Summary
在这里，我们提出一个协议，从果蝇雄性附属腺体（辅助细胞）分离和排序特定细胞群，用于RNA测序和RT-qPCR。细胞分离是通过FACS纯化GFP表达的二次细胞后，需要解剖，蛋白酶消化和机械分散多步骤解散过程。
Abstract
为了理解器官的功能，理解其组成细胞群的作用通常很有用。不幸的是，单个细胞群的稀有性往往使得很难获得足够的材料用于分子研究。例如，果蝇雄性生殖系统的附属腺体包含两种截然不同的分泌细胞类型。主细胞占腺体分泌细胞的96%，而次级细胞（SC）占细胞的其余4%（每个男性约80个细胞）。虽然这两种细胞类型都产生的重要成分，但已知只有少数基因是 SC 特有的。到目前为止，SC的稀有性阻碍了这一重要细胞类型的转录组分析研究。这里提出了一种方法，允许纯化用于RNA提取和测序的SC。该协议包括首先从苍蝇中解剖腺体，表达SC特异性GFP报告器，然后将这些腺体置于蛋白酶消化和机械分离中，以获得单个细胞。按照这些步骤，使用荧光活细胞分拣机（FACS）对单个、活体、GFP标记的细胞进行分类，用于RNA纯化。此程序产生 SC 特异性 RNA 从 +40 男性每个条件在一天内的下游RT-qPCR和/或RNA测序。程序的快速性和简单性允许从不同的基因型或环境条件，在短时间内确定许多不同的苍蝇的转录。
Introduction
器官由多种细胞类型组成，每种细胞类型都有离散功能，有时表达的基因组非常不同。为了准确理解器官的功能，研究组成这个器官的每种不同的细胞类型通常是至关重要的。用于探索可能功能的主要方法之一是转录子分析。这种强大的方法提供了细胞中基因表达的快照，以揭示活跃的过程和途径。然而，对于必须从更丰富的相邻细胞中纯化的稀有细胞群来说，这种类型的分析通常是困难的。例如，果蝇男性附属腺体是主要由两种分泌细胞类型组成的器官。由于两种细胞类型的稀有细胞只占该腺体细胞的4%，因此没有使用细胞类型特定的转录组分析来帮助确定这些细胞的功能。
附属腺体（AGs）是昆虫中男性生殖道的器官。它们负责生产的大部分蛋白质（蛋白（ SFPs ）和附属腺蛋白（ ACPs ）。其中一些SFP已知诱导交配雌性生理和行为反应，通常称为交配后反应（PMR）。一些PmR包括：排卵率和卵子产卵率增加，精子的储存和释放，女性饮食的变化，以及女性对二级求亲男性1，2的接受率下降。由于昆虫影响到从人类健康（作为致命疾病的载体）到农业的许多重大社会问题（昆虫可以是害虫，但对授粉和土壤质量至关重要），了解昆虫繁殖是一个重要的研究领域。与模型有机体果蝇黑色素酶一起，对GS和ACPs的研究有了显著进展。这些研究强调了AGs和它们产生的一些单个蛋白质在创建PMR中的作用，影响了其他物种的工作，如病媒伊蚊3、4和其他昆虫1 ， 5.此外，当AG分泌精液1，6的成分时，它们通常被认为是哺乳动物前列腺和精质囊泡的功能模拟。这种功能相似性结合两个组织类型的分子相似性，使AGs成为苍蝇7前列腺的模型。
在果蝇雄性，有两个附属腺叶。每个叶可以被看作是一个囊状结构，由围绕中央流明的单层分泌细胞组成，由光滑的肌肉包裹。如上所述，有两种形态、发育和功能上截然不同的分泌细胞类型组成这个腺体：多边形主细胞（占细胞的96%），以及较大的圆形二次细胞（SC）（组成剩余的4%的细胞，或大约40个细胞每叶）。已经表明，两种细胞类型产生不同的ASP集，以诱导和维持PMR。迄今为止获得的大部分数据都强调了单一蛋白质在触发PMR大多数特征行为中的作用。这种蛋白质，性肽，是一种小的，36个氨基酸肽，由主细胞8，9，10分泌。虽然性肽似乎在PMR中起主要作用，但主细胞和继发细胞产生的其他AcPs也已被证明影响PMR11、12、13、14的各个方面。 ，15，16，17.例如，根据我们目前的知识，SC，通过它们产生的蛋白质，似乎需要在第一天18日之后使SP信号永久化。
鉴于SCs的稀有性（每只男性只有80个细胞），我们关于这些细胞及其产生的蛋白质的所有知识都来自遗传学和候选方法。到目前为止，只有相对较少的基因列表被证明是SC特异性的。此列表包括地域蛋白缺陷已验证的三叶草 （Dve）19，lncRNA MSA20， Rab6， 7， 11和1921， CG1656和CG1757511， 15，21和主箱转录因子腹 - B （Abd-B）18.以前，我们已经表明，在二次细胞（iab-6cocuD1突变体）中，Abd-B和lncRNA MSA的表达存在突变缺陷，将PMR的长度从+10天缩短到只有一天12,18,20.这种表型似乎是由于SP在女性生殖道12、18、20中储存不当所致。在细胞水平上，这种突变体的次生细胞表现出异常形态，失去其特有的真空状结构18，20，21。使用这种突变线，我们以前试图通过比较来自野生类型或突变附件腺体12的整个GS的转录配置文件来识别涉及SC功能的基因。此外，其他实验室显示，SC数，形态和真空含量取决于男性的饮食，交配状态和年龄21，25，26。
虽然这些方法取得了积极进展，但SC全文远未实现。这些细胞在这个器官中的稀有性使得即使从野生型细胞也很难进一步进步。对于测试基因表达，这些细胞在特定环境刺激后的变化将更加困难。因此，需要一种分离和纯化SC RNA的方法，该方法足够快速和简单，足以在不同的遗传背景和环境条件下发挥作用。
Abd-B和MSA基因都需要从果蝇Bithorax复合物（称为D1增强剂）的特异性1.1kb增强剂，以在SCs18，20中表达。此增强剂以前曾用于创建GAL4驱动程序，当该驱动程序与UAS-GFP关联时，能够专门在 SC 中驱动强大的 GFP 表达式。因此，我们使用此行作为 FACS 协议的基础，将这些细胞从野生类型和iab-6cocuD1 AGs 中分离。由于iab-6cocuD1突变S显示不同的细胞形态，我们表明，该协议可用于分离细胞，以确定其转录组从这种罕见的细胞类型在完全不同的条件下。
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Protocol
1. 使用果蝇线和男性收集
- 对于此协议，使用在 SC 中表达 GFP 的雄性，而不是主细胞。在这里，使用AbdB-GAL4驱动器（在参考文献18中描述），与UAS-GFP（在染色体2上）重新组合。也可以使用其他适当的驱动程序。对于不同突变条件下的SC分离，将突变交叉成包含SC特异性GFP线的线。
- 收集两批约25个健康，处女雄性为每个基因型和年龄他们在25°C3-4天与新鲜制作的果蝇食品小瓶。
注：由于年龄、交配状况、营养和社会环境都影响生殖生物学，因此必须遵循严格的规程来控制这些参数。处女雄性在25°C的阴液后，在标准玉米粉-琼酵母食品上，以每瓶20-25名男性的组分，在12小时/12小时光/暗循环后，年龄为3-4天。
2. 解决方案和材料准备
-
准备以下解决方案。
- 制备血清补充介质（SSM）：施耐德的果蝇培养基辅以10%热灭活胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素。
- 准备1x胰蛋白酶（例如，TrypLE快速酶）的等分，并在室温下储存。
- 准备木瓜的等分 [50 U/mL]（储存在 -20 °C，只解冻一次）。
- 制备1倍磷酸盐缓冲盐（PBS，在室温下储存）。
-
为附件腺体的物理解散准备多个火焰圆移液器吸头。
注：使用低固定提示处理附件，因为它们倾向于粘附在未经处理的塑料上。火焰圆环过程可减少尖端开口并平滑尖端边缘。这确保了肽酶消化后的有效解脱，而不剪切细胞膜。- 用锋利的刀片切割一个 200 μL 的尖端，然后轻轻将其穿过火焰，使其尖端圆周，使开口更宽但平滑，以便在步骤 3.7 期间处理。
- 通过不到一秒钟的时间将尖端开口靠近火焰，缩小多个 1，000 μL 尖端的开口。稍微旋转尖端，以避免过度熔化或堵塞。对从窄到宽的提示进行排序。这可以通过确定愿望的速度来实现。尝试分离一个小规模的 GS 样本，以测试最窄的提示的效率。
注：这些提示对于机械搅拌至关重要（步骤 5.2 和 5.3）。优质的火焰圆移液器吸头允许完全解散，同时保持细胞活力。因此，在重复使用程序结束时，用水彻底清洗这些提示。这允许每天重复的解散。
3. 附件腺体的解剖
- 把20到25只雄性果蝇放在冰上的玻璃盘子里。
- 在 SSM 中分离 1 名男性。脱下生殖道，清除除射精管外所有其他组织上的附属腺对。
注：去除睾号，因为释放的精子会形成团块，干扰分离过程。拆下射精灯泡，这使得它漂浮时难以操作。 - 使用钳子，在室温下将附件密封圈转移到装有 SSM 的玻璃板上。重复步骤 3.2-3.3 20 次，在 SSM 中获取一批 20 对腺体。
注：这些步骤将在15至20分钟内实现。 AGs应该看起来健康，腺体周围的肌肉层的蠕动运动应该是可见的。GFP 可使用荧光显微镜进行监测。 - 将附件密封圈转移到 1x PBS，在室温下洗涤 1-2 分钟。
注：为了更好地解索，必须用PBS冲洗腺体。然而，由于细胞在PBS中显示出压力迹象，这一步骤的持续时间应受到限制;PBS中分离的二次细胞迅速膨胀和死亡。 - 将20μL木瓜素[50U/mL]稀释到180μL的1x胰蛋白酶中，以获得解散溶液（向上或向下，保持9μL的胰蛋白酶和1μL的木瓜素为每个男性）。使用钳子，将附件密封圈转移到此解决方案。
- 从近端部分分离附件腺体（包含辅助细胞）的尖端。使用细钳牢固地捏住腺叶的中间，用第二个钳子的尖尖切开。去除附属腺体和射精管的近端部分，以改善分离并缩短细胞分拣时间。
注：从20对腺体中切除远端部分需要15至20分钟，因此通过肽类分裂在室温下开始消化。 - 解剖完所有腺体尖端后，使用步骤 2.2.1 中准备的特殊 200 μL 移液头将其转移到 1.5 mL 管中。在处理腺体之前，它应该是宽的、圆的和潮湿的。
注：对于移液附件腺组织，提示应始终预先湿与适当的溶液（胰蛋白酶或SSM，保持一个管每个为此目的）。仔细冲洗样品之间的提示，以避免污染。
4. 组织消化
- 将微型管置于 37°C 摇床中 60 分钟，以 1，000 rpm 转速摇动。
注：激动和消化时间对于成功的解散都是至关重要的。较短或一动不动的消化会给予较差的解离，可能是因为外肌层和内粘性保护附属腺细胞免受肽类分裂。 - 在室温下加入1mL的SSM以停止消化，并立即进行步骤5。
5. 细胞的机械分离
- 使用宽圆角 1，000 μL 尖端，预湿 SSM，将样品转移到 24 孔板中。在显微镜下监测GFP荧光：大多数腺尖应看起来完好无损，并且应分离一些SC。
- 使用步骤 2.2.2 生成的圆形窄移液器尖端，上下移液 3 到 5 次，以破坏附件腺组织。
注：监测荧光，确保大组织斑块已经分解。如果不是这样，请重复步骤 5.2。 - 使用非常窄的圆角移液器尖端（在步骤 2.2.2 中生成），移液向上和向下 1-2 次。
注：步骤 5.3 之后，只应看到单个单元格。建议使用 24 孔板，因为它们能够轻松监控过程。当几个样品被处理并给出令人满意的结果（看起来健康的二次细胞完全分离）时，移液步骤将在微管中执行。 - 等待至少 15 分钟，让细胞稳定在井底，并移除多余的 SSM，以减少分拣时间。
注：让细胞沉淀证明优于其他方法，如离心，并允许在FACS之前对细胞进行最后一次目视检查。 - 将细胞移入干净的1.5 mL管中，并汇集相同的样品（每个情况有两批20个雄性）。用 SSM 冲洗水井以回收最后一个细胞，并将其移入管中（使用小体积）。
- 在1.5 mL微管中，加入300μL的细胞解解溶液和1μL蛋白酶K[50μg/[L]（在RNA纯化试剂盒中提供的解决方案，见步骤7）。为每个样品准备两个管（一个用于 MC，一个用于 SC）。
6. FACS（荧光激活细胞分拣）
- 向每个样本添加可行性标记，在排序前几分钟进行排序（0.3 mM Draq7）。
警告：应谨慎处理 Draq7。 -
对活二次细胞（GFP阳性、Draq7阴性细胞）的均质群体进行分类。在另一个微管中，对主要细胞（更小、GFP阴性、Draq7-阴性细胞）进行排序。使用以下 FACS 门控策略：
注：将细胞分拣机压力设定为 25 PSI，并将细胞通过 100 μm 喷嘴。分拣速率约为 2，000 个单元格/s。- 排除碎屑并根据 FSC-SSC （图2E） 选择总电池，以排除碎屑。
- 排除死单元格。使用 640 nm 激光激发 Draq7，使用 795/70 带通滤波器收集发射的荧光。门 Draq7 阳性细胞出 （图 2F.
- 使用 SSC-H 与 SSC-W 和 FSC-A 与 FSC-H 的双浇注拆下双浇注（图 2H）。
注：使用双浇注严格排除细胞双子，以减少主要细胞污染。 - 将 +550 GFP 阳性细胞分类到 1.5 mL 微管中，该微管具有酶缓冲液和蛋白酶 K。此总体被视为二次细胞 （SC，图 2G）。在 488 nm 处激发 GFP，使用 526/52 带通滤波器收集发射的荧光。
- 将 1，000 个 GFP 阴性细胞（均质和小尺寸）放入 1.5 mL 微管中，带 Lysis 缓冲液和蛋白酶 K。这个群体被认为是主要细胞（MC，图2G）。
- 涡流所有样品。
注：从40个雄性（+40 x 80 SC = 3，200个二级细胞），获得600至800个活单次次细胞（大约20-25%检索）。停止对大约 550 个 SC 和 1，000 个 MC 进行排序，以对样本进行规范化。
7. RNA提取
注：我们使用显源大师纯RNA纯化试剂盒进行RNA提取，并进行了以下调整。只要产量足够高，足以准备从 +500 个细胞（此处使用了 2 ng RNA）的测序库，可以使用其他试剂盒。
- 在65°C加热样品15分钟，每5分钟涡旋一次，以完成细胞分流。
- 将样品放在冰上5分钟。按照制造商关于核酸沉淀的建议（部分"总核酸沉淀"和"从总核酸制剂中去除污染DNA"）。
- 在10μL无RNaseTE缓冲液中悬浮RNA颗粒。
- 添加RNase抑制剂（可选）。
- 将样品储存在-80°C。
8. RNA数量、质量和特异性的质量控制
- 估计RNA的质量和浓度。由于体积小，浓度小，在这里使用RNA 6000笔筹码。高质量的RNA被定义为非降解，可见为低基线，具有与rRNA对应的尖峰。
-
RT-qPCR 控制已排序单元格的标识
- 使用随机六氯考姆作为引种，使用总RNA的2 ng进行逆转录。对二次细胞RNA和主细胞RNA执行RT。
注：cDNA可以稀释、附量，并冷冻，供日后使用。 - 使用适当的引物对进行实时定量PCR，以量化内务管理基因（α-Tubulin，18S rRNA）、继发细胞特异性基因（MSA、Rab19、Abd-B）和主要细胞特异性基因（性肽）。
- 使用随机六氯考姆作为引种，使用总RNA的2 ng进行逆转录。对二次细胞RNA和主细胞RNA执行RT。
9. 测序（cDNA库准备、测序和数据分析）
- 使用总RNA的2纳克与聚dT引体合成cDNA。使用 SMARTer 技术放大它们进行放大。
- 使用 Nextera XT 工具包准备库。
- 使用多路复用、100个核苷酸单读测序（即使50个核苷酸读数适用于大多数用途）的序列，每个样本产生约3 000万次读取。
10. 数据分析
- 运行快速QC。
- 使用 STAR 对齐器映射 UCSC dm6 果蝇参考基因组上的读取，并生成 .bam 文件。使用集成基因组查看器 （IGV） 在基因组浏览器上可视化读取。
- 使用 HTSeq 执行基因计数。
- 使用修剪的M值均值（TMM）方法使基因计数22规范化。使用 edgeR 对差分表达式、MA 图和 PCA 进行统计分析。
- 对于基因表达分析和统计，使用一般线性模型、具有假检测率 （FDR） 的准可能性 F 检验和本杰明和霍奇伯格校正 （BH）。
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Representative Results
这里提出的协议使一个实验者能够从果蝇雄性附属腺中提取二级细胞，并在一天内提取其RNA（图1）。
我们使用Abd-B-GAL4构造18来标记辅助细胞 （SC），而不是用 GFP 标记主细胞 （MC） （图 2A）。此过程的一个目标是获得 SC 的野生类型转录组（野生类型用逗号书写，因为它们是从表达 GFP 和 GAL4 的转基因苍蝇中获得的）。另一个目标是通过快速和简单的程序获得SCRNA，允许研究它们在不同条件下的基因表达。因此，我们使用野生类型和"iab-6cocuD1"突变体执行此过程，这些突变体携带 1.1 kb 的删除，删除了负责 SC 表达式的Abd-B增强剂。这种删除也删除了MSA的启动子，一个重要的二次细胞发育，形态和功能18，20（图2B，C）。该协议被重复三次与2个基因型每次获得生物三元（以下称为WT-1，-2，-3为野生类型和D1-1，-2和-3的iab-6cocuD1）。
该协议允许MC和SC在几个小时内从果蝇附属腺体分离（图2D）。然后，两个细胞群在两个不同的管中排序，以分离MC和SC。FACS的门控策略如图2E-2G所示。 Draq7 允许估计整个样本的细胞存活率约为 70%（图 2F）。根据 FSC-A vs FSC-H 和 SSC-H vs SSC-W 的估计，单位代表 SC 人口的 90% 以上，MC 人口超过 80%。（参见图 2H）。这反映了一种有效的分离。大约 10% 的分拣事件被中止，因为同一 FACS 水滴中存在另一个单元或碎片。从 40 名男性开始，我们通常收集 550 个 SC 和 1，000 个 MC，然后中断排序。从1个样本（6个样本）中，我们无法达到550个二次细胞。因此，WT-1样品仅从427 SC获得，但提供的RNA质量和数量与其他样品相似。
细胞被分类成液化缓冲液（包含蛋白酶K）。一旦所有样品都准备就绪，从每个细胞样本中提取RNA，以便在一天结束时进行RNA颗粒。利用具有适当芯片的生物分析仪处理低浓度和小体积的RNA的质量和数量。由于估计浓度在样品之间是可变的（从 1，300 pg/μL 到 344 pg/μL，参见图 3A），我们调整了 RT-qPCR 和 cDNA 库合成的起始材料到大约 2 ng（测量浓度不高准确）。我们通过野生类型MC和SC提取物的实时qPCR量化了特定基因的表达，以控制我们分类的细胞群的特性。图 3B表示基因表达为与α-tubulin表达规范化的相对定量。如18S rRNA和α-图布林这样的家政基因，如预期的那样，在所有样本中检测出来。恰恰相反，SC基因Rab19仅从SC提取物中检测，而MC基因性肽仅从MC检测。我们注意到，在iab-6cocuD1突变SC中的Rab19表达相对于野生类型SC较低，这表明该基因的表达受Abd-B和MSA的丢失（一致，一致，Rab19 标记的真空液在iab-6cocuD1突变体21 中丢失。辅助细胞特异性转录程序MSA仅从野生类型SC检测，而不是从MC检测，也检测出来自iab-6cocuD1 SC，这是预期的，因为MSA启动子在此突变体中被删除。总之，图3所示的Q表明，通过该协议获得的RNA没有降解，并且两个细胞群（SC和MC）在野生类型和突变条件下都成功地从附属腺体中分类。此处仅对辅助细胞的 RNA 进行排序，但请注意，此过程支持同时对 SC 和 MC 进行转录分析。
RNA测序是使用标准程序实现的。在这里，我们将只讨论与此方法相关的质量控制分析。当获得序列时，读取映射到参考果蝇基因组，归因于基因，并规范化。对6个样本（3个野生类型和3个iab-6cocuD1复制）进行了PCA（主要成分分析）。PC1 中尽可能多地考虑数据中的可变性，在 PC2 中考虑了尽可能多的剩余可变性。如图4A所示，野生类型将聚类复制得非常接近，并且远离Iab-6cocuD1样本。这表明WT样本彼此比突变样本更相似。这说明了该方法的可重复性及其从突变次生细胞检测异常遗传程序的能力。当 D1-2 和 D1-3 样本聚集在一起时，我们注意到 D1-1 样本差异很大。由于此复制的所有 CS 都很好，并且与所有其他复制相媲美，因此我们可以排除样本制备问题（总共 2900 万次读取，其中 >76% 与参考基因组唯一对齐）。其中，>77%归因于一个基因，>90%是mRNA，<3%是rRNA）。这种差异可能反映了在iab-6cocuD中SC的基因表达是不稳定的，尽管测试这个假说需要更多的复制。
可视化与基因组上特定基因对齐的读取允许对数据质量进行可视化估计。图 4显示了一系列基因，每个基因型的读取来自 1 个代表性复制。毫不奇怪，内务管理基因（如Act5C）在基因型（图4B）以及SC特异性基因Rab19和Dve（图4C，D）中表达。缺乏电子读法证实，聚dT选择性地从成熟的拼接mRNA中制备逆转录，用于cDNA库制备。值得注意的是，我们可以看到野生类型和iab-6cocuD1 SC之间特定基因表达的重要和显著差异。这在图4E中由MSA基因（其在野生型的强烈表达）在iab-6cocuD1中丢失。MSA作为原理证明，这种方法能够识别在突变条件下调节不当的基因。这将有助于了解这种突变体中观察到的表型，并可能为正常次细胞功能提供新的见解。
图 1：协议概述。将显示协议的关键步骤，时间线位于右侧。这个程序允许一个从早上从活的果蝇开始，在中午之前有分离的附属腺细胞，根据GFP表达对它们进行排序，并在工作日结束时提取他们的RNA。RNA测序和数据分析通常需要几周时间。这个数字已由参考文献27修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：隔离和排序GFP表达的二级细胞。（A） Abd-B：GAL4 UAS-GFP附件腺体的共聚焦图像，在二次细胞 （SC） 中表达 GFP，但在主细胞 （MC） 中不表达 GFP。核被DAPI（蓝色）所污染。点白线分隔 AG 叶。ED 是射精管道。左上角的白条为 50 μm 刻度。（B，C）附件腺体远端部分的放大视图与SC表示GFP，在野生类型 （B） 和iab-6cocuD1 （C） 背景.（D） 在GFP双筒望远镜下，以低倍率分离的细胞。（E-H）FACS 门控策略，用于净化 SC 和 MC. 所有面板上的红点均显示面板（G） 中定义的 SC。首先排除碎片（E，步骤6.2.1）以及Draq-7阳性死细胞（F，步骤6.2.2）。GFP阳性细胞选择（SC）以及同质的GFP负细胞（MC）（G，步骤6.2.4和6.2.5）。在 MC 和 SC 总体中都排除了双精度值（步骤 6.2.3，只有 SC 的 SSC-H vs SSC-W 门控在2H上作为示例显示）。这个数字已由参考文献27修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：RNA的质量控制：质量、数量和细胞类型特异性。（A） 对笔下芯片的RNA质量和浓度估计的控制.25 nt 峰值是定量的控制。低基线表示低降解，两个主要峰值是核糖体RNA。显示了用于RT-qPCR的3个样本，其质量代表本研究中使用的所有RNA样本，其估计浓度反映了我们获得的总RNA在样本之间的变化。（B） RT-qPCR 证明了二次细胞 （SC） 和主细胞 （MC） 分选的特异性。基因表达定量使用q=2（40-Cq）公式完成。在每个条件下，每个基因的三次分化都归化为α-TubulinRNA的平均数量，以补偿总RNA变异。误差条显示标准偏差。WT表示野生类型，D1是指iab-6cocuD1突变体。这个数字已由参考文献27修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：关于RNA测序数据的质量控制。（A） WT-1、2、3（绿点）和D1-1、2、3（蓝点）RNA测序数据集的主要成分分析（PCA）。（B-E）使用IGV软件对映射到果蝇参考基因组的测序读取。为了清晰起见，只显示每个基因型的一个有代表性的样本（WT-1 和 D1-2），并且只显示几个特定的位点。基因名称被写在每个面板的顶部，> 和 < 符号表示其方向。括号中的数字表示每个跟踪的每个 DNA 碱基对读取次数的刻度。对于给定基因的两个条件，此比例相同，但基因之间差异，以便更好的可视化。每个面板底部的蓝色条显示基因的内创体（细线）、外显子（宽线）和ORF（具有 >>; 的矩形）。请注意，Rab19和Arl5是重叠的收敛基因 （C）。这个数字已由参考文献27修改。请点击此处查看此图的较大版本。
| 本研究中用于RT-qPCR的引基器： | ||
| 靶基因 | 正向引漆 | 反向引漆 |
| 阿尔法-图布林 | TTTTCCGTCGTGGGGGGGAA | 中海协 |
| 18S rRNA | CTGAGAACGCTACATC | ACCAGATGCCCTCAT |
| 拉布19 | 卡加格格加特茨塔塔塔茨塔茨塔茨 | TTGGAAAAGAGGCG |
| 性肽 | 加加特格格格格格格阿加塔格 | 塔阿卡特TCCCCCCCGC |
| Msa | CTCCTCTCTCTCTGCGG | CAGCTCTTTTATCTCTCTCC |
表 1：引性序列
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Discussion
细胞分离的方法从果蝇组织，如象形圆盘已经描述了23。我们试图简单地在附属腺体上使用这些程序失败，鼓励我们开发这种新协议。蛋白酶消化和机械三聚酯是我们为手术成功而烦恼的关键步骤，因此，我们在第2至第5节中放置了许多注释，以帮助实验者获得令人满意的结果。为了解脱成功，肽类细胞必须到达附属腺细胞，这些细胞受流明体中的粘性和腺体周围的肌肉层的保护。因此，切除腺体的远端部分至关重要（步骤3.6）。此外，在剧烈晃动下至少消化60分钟（步骤4.1）是必要的。与胰蛋白酶溶液（例如，TrypLE）的温和解离，在机械解离之前保持了腺体的完整性和细胞活力。添加木瓜素或胶原酶与胰蛋白酶溶液结合改善了解散（通过较少的移液获得完美的解结，从而改善细胞存活率）。然而，这些酶都不足以自行分离细胞。使用第 2.2.2 部分生成的圆形窄尖进行移液是此方法的关键步骤。因此，在小规模实验中应优化此三元法（步骤 5.2-5.3），以选择最佳提示组合（请参阅步骤 5.3 中的注释）。
使用这个协议，一个人将能够从40个雄性分离出500到800个活的二次细胞。这表示 ±20% （± 5%）回收考虑 3，200 SC 作为起始材料 （40 男性 x 80 SC）。20% 的效率对于RNA测序来说足够高，因为我们可以在一天内处理多个样品。但是，可以通过以下几种方法加以改进：以较大的批次工作;以较大批量进行工作;以较大批量进行工作;以较大批量进行工作;以较大批量进行工作;以较大批量进行工作;在消化管中做三角，跳过步骤5.4，以减少转移;非常轻柔地三聚（一些分离的GFP®细胞在步骤5.3后不久死亡）;缩短分离与FACS之间的时间;使用高浓度的胰蛋白酶溶液减少消化时间;使用不太严格的参数进行单选（步骤 6.2.3）和中止排序。该协议的一个限制是，它需要几个小时来分离细胞;因此，它不适合研究非常瞬态的基因表达变化。通过此协议，4 x 20 雄性可在一个上午由一个人（带训练）进行处理，允许在 1 天内从 SC 提取两种不同条件的 RNA（图 1）。值得注意的是，更多的实验者可以参与附件腺体收集（步骤3.1-3.3），以便在同一天处理多个样本。但是，步骤 3.4 以后将优先由同一个人执行，以最大限度地提高可重现性。
继发细胞对雄性粪便12、20、24执行基本功能，但它们为履行这一作用而表达的基因的完整图则仍然缺失。在这里，我们描述了如何从相对较少的苍蝇中获取这些细胞的转录组，从而能够比较不同条件下SC中的基因表达。这里使用了一种影响SC功能和形态的突变体，其转录体的重要变化可见。因此，这种方法可能有助于识别其功能所需的新的SC基因。据我们所知，我们实验室中唯一通过手工采摘SC进行SC转录法的替代方法，获得了高质量的RNA测序数据，但过程过于耗费，无法在多种条件下进行。我们将比较我们的SC RNAAseq数据集，并在一篇独特的论文中分析它们对SC生物学的生物学意义（正在编写中）。
今后，该技术不仅能揭示野生型SC转录组，而且有助于研究环境或基因改变对附属腺细胞转录组的影响。SC数、形态和真空含量已被证明取决于男性饮食、交配状态和年龄21、25、26。我们仍然对所涉及的遗传途径了解有限，比较不同条件下的SC转录法是有见地的。这种快速和相对简单的协议将支持此类研究。重要的是，这种方法允许从同一个体中分离主细胞，因此可以用于确定遗传和环境参数是否同时影响两个附属腺细胞类型。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
我们感谢Karch实验室的成员，感谢iGE3基因组学板块，感谢日内瓦大学的流式细胞学核心设施，感谢为FACS制定协议的让-皮埃尔·奥布里-拉查纳耶博士。我们感谢卢卡·斯蒂克利帮助可视化IGV上的阅读。我们感谢自己温柔地允许重用数字，感谢编辑们促使我们在写作方面富有创造性。
这项研究由日内瓦州（CI、RKM、FK）、瑞士国家研究基金（www.snf.ch）和克拉拉兹基金会（FK）捐款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
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