Este estudo descreve o monitoramento microscópico da adesão pneumococcus às cordas do fator von Willebrand produzidas na superfície de células endotélias primárias humanas diferenciadas estresse de cisalhamento em condições de fluxo definidas. Este protocolo pode ser estendido à visualização detalhada de estruturas celulares específicas e quantificação de bactérias aplicando procedimentos diferenciais de imunocoloração.
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Artigo de método
Infecção pneumocócica de células endotélias humanas primárias em fluxo constante
Neste artigo
Resumo
Resumo
A interação de Streptococcus pneumoniae com a superfície das células endotélias é mediada no fluxo sanguíneo através de proteínas mecanosensíveis, como o Fator Von Willebrand (VWF). Esta glicoproteína muda sua conformação molecular em resposta ao estresse de cisalhamento, expondo assim locais de ligação para um amplo espectro de interações hospedeiro-ligand. Em geral, o cultivo de células endotélias primárias um fluxo de cisalhamento definido é conhecido por promover a diferenciação celular específica e a formação de uma camada endotelial estável e rigidamente ligada que se assemelha à fisiologia do revestimento interno de um vaso sanguíneo . Assim, a análise funcional das interações entre patógenos bacterianos e a vasculatura hospedeira envolvendo proteínas mecanosensíveis requer o estabelecimento de sistemas de bomba que possam simular as forças fisiológicas de fluxo conhecidas por afetar a superfície de células vasculares.
O dispositivo microfluídico usado neste estudo permite uma recirculação contínua e sem pulso de fluidos com uma taxa de fluxo definida. O sistema controlado por computador bomba de pressão do ar aplica um estresse tesoura definida em superfícies de células endoteliis, gerando um fluxo contínuo, unidirecional e controlado médio. As mudanças morfológicas das células e o acessório bacteriano podem ser monitoradas microscópicas e quantificadas no fluxo usando slides especiais de canal projetados para visualização microscópica. Em contraste com a infecção da cultura celular estática, que em geral requer uma fixação da amostra antes da rotulagem imunológica e análises microscópicas, as lâminas microfluídicas permitem a detecção baseada em fluorescência de proteínas, bactérias e componentes celulares após a fixação da amostra; coloração de imunofluorescência em série; e detecção direta baseada em fluorescência em tempo real. Em combinação com bactérias fluorescentes e anticorpos específicos rotulados por fluorescência, este procedimento de infecção fornece um sistema de visualização de componentes múltiplos eficiente para um enorme espectro de aplicações científicas relacionadas a processos vasculares.
Introdução
A patogênese das infecções pneumocócicas é caracterizada por uma interação multifacetada com uma diversidade de compostos de matriz extracelular e componentes da hemostase humana, como plasminogênio e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. O multidomínio glicoproteína VWF serve como regulador-chave de uma hemostasis equilibrada, mediando recrutamento trombocito e incorporação de fibrina no local da formação de trombos
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Protocolo
O cultivo microfluídico de células foi realizado com células endotélias humanas primárias comerciais (HUVEC). A empresa isolou as células com o consentimento informado do doador. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Câmara de Médicos do Estado Federal Baden-Wuerttemberg com o número de referência 219-04.
Nota: Veja a Tabela de Materiais para suprimentos de protocolo.
1. Pré-cultivo de células endotélias primárias
- Descongele um frasco congelado de glicerol contendo 1 x 105 HUVEC primário de três doadores diferentes suavemente a 37 °C e semeie as cé....
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Resultados
Culturing HUVEC primário em um fluxo unidirecional constante resulta na formação de um confluente e camada de células bem embaladoque promove a geração de WPBs celulares preenchidos com o mecanosensível VWF13,14. Este protocolo descreve o uso de uma bomba de pressão de ar baseada, sistema de recirculação sem pulso para análise de infecção que requer imitar a situação de estresse cisalhamento no fluxo sanguíneo humano.
Este sistema perm.......
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Discussão
A simulação da interação bacteriana com proteínas hospedeiras mecanosensíveis, como a VWF, requer um sistema de cultura celular perfusível que permita a geração de um fluxo definido, unidirecional e contínuo de líquidos, gerando assim um estresse de cisalhamento confiável . Vários sistemas de bombas microfluídicas já foram descritos. Uma revisão abrangente de Bergmann et al. resume os aspectos-chave dos diferentes modelos de cultura celular bie tridimensional17.
A tecno.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O projeto foi financiado pelo DFG (BE 4570/4-1) para a SB.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 mL Luer-seringa | Fisher Scientific | 10303002 | com 1 mL de volume para injeção de gelatina usando a conexão luer das lâminas |
| 2 mL Luer-seringa | Sarstedt | 9077136 | Para remendar / injetar fluidos nas conexões luer das lâminas da câmara do canal |
| Accutase | eBioscience agora thermo fisher | 00-4555-56 | mistura de protease usada para descolamento suave de células endoteliais |
| AlexaFluor350-conjugado Phalloidin | Abcam | ab176751 | nenhuma concentração disponível do fabricante, a solução de estoque é suficiente para 300 tets, a empresa recomenda o uso de 100 µ L de uma diluição de 1:1.000, fluorescência azul (configurações do filtro DAPI) |
| Anticorpo anti-camundongo derivado de cabra conjugado com AlexaFluor488 | Thermo Fisher Sientific | A11001 | : 2 mg/mL para imunocoloração de FVW humano em lâmina microfluídica após fixação de PFA, fluorescência verde |
| Anticorpo anti-coelho derivado de cabra conjugado com AlexaFluor568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | concentração de estoque: 2 mg/mL para imunocoloração de pneumococos em lâmina microfluídica após fixação de pFA, fluorescência vermelha |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | meio de cultura bacteriana complexa |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilizada, para preparação de tampão de bloqueio |
| Frascos de cultura de células com filtro | TPP | 90026 | subcultivo de HUVEC em frascos de cultura de células não revestidos de 25 cm2 |
| superfície Centrífuga Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | fiação de bactérias (volumes de >2mL) |
| Centrífuga Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | fiação de células eucarióticas |
| Centrífuga Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | fiação de bactérias (volumes inferiores a 2 mL) |
| Cloranfenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | usado em uma concentração de 0,2 mg/mL para o cultivo de pneumococos transformados com construção genética que transporta proteína fluorescente vermelha e de resistência ao cloranfenicol |
| Braçadeira para tubo de perfusão | ibidi | 10821 | para segurar o líquido no tubo antes de conectar a lâmina ao sistema de bomba |
| CO2-Incubadora | Fisher Scientific | MIDI 40 | é perfeitamente adaptado ao tamanho da unidade fluídica com corrediça de canal conectada e foi usado para cultivo de fluxo a 37 &graus; C e 5% CO2 |
| CO2-Incubadora | Sanyo | MCO-18 AIC | para incubação de bactérias e células em atmosfera definida a 5% CO2 e 37 ° C |
| Placas de ágar sangue da Colômbia | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | meio de cultura complexo à base de ágar para S. pneumoniae suplementado com 7% de sangue de ovelha |
| Computador | Dell | Latitude 3440 | Comuter com software de bomba de pressão |
| Microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) | Leica | DMi8 | Microscópio inverso com platina coberta por uma câmara aquecível e com unidade de fluorescência equipada com filtro de fluorescência, fonte de luz de xenônio (SP8, DMi8) e DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 megapixels) |
| Di hidrogenofosfato potássico (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | usado para tampão PBS |
| Material de secagem | Merck | 101969 | grânulos de sílica laranja para secagem usados em uma garrafa de vidro com um adaptador de tubulação |
| Suplemento ECGM Mix | Promocell | C-39215 | mistura de suplemento para ECGM -meio, necessário para pré-cultivo de células endoteliais: 0,02 mL / mL Soro fetal de bezerro, 0,004 mL / mL suplemento de crescimento de células endoteliais, 0,1 ng / mL fator de crescimento epidérmico, 1 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos, 90 µ g/mL de heparina, 1 µ g/mL de hidrocortisona |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM suplementado com 5% [p/p] FCS e 1 mM MgSO4 para aumentar a adesão celular |
| Meio de crescimento de células endoteliais (ECGM, pronto para uso) | Promocell | C-22010 | meio de cultura de HUVECs, já suplementado com todos os componentes da mistura de suplementos |
| Soro de bezerro fetal (FCS) | biocromo agora Merck | S 0415 | suplemento para cultura de células, utilizado para análises de infecção |
| anticorpo anti-FVW humano de cabra conjugado com FITC | Abcam | ab8822 | concentração de estoque: 10 mg/mL, para imunodetecção de FVW globular e multimerizado em fluxo |
| Unidade fluídica | ibidi | 10903 | unidade fluídica para cultivo em fluxo |
| Gelatina (suína) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | para pré-revestimento da superfície do canal de microlâminas |
| Cloridrato de histamina | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | para indução de secreção de FVW a partir de corpos endoteliais Weibel Palade |
| Célula endotelial da veia umbilical humana (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lote-Nr. 396Z042 | células endoteliais primárias de doador agrupado, armazenadas cripcoservidas em nitrogênio líquido |
| Anticorpo específico de VWF humano derivado de camundongo (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | concentração de estoque: 200 µ g/mL para imunocoloração de FVW em lâmina microfluídica após fixação de PFA |
| Porta de injeção | ibidi | 10820 | para injeção de histamina ou bactérias na tubulação do reservatório durante a circulação do fluxo |
| Microscópio óptico | Zeiss | Axiovert 35M | microscópio de luz inversa para controle do descolamento de células eucarióticas e contagem de células usando uma objetiva de água de 40x permitindo ampliação de 400x |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | lâminas fisicamente modificadas para cultivo fludico (μ – Deslize I0.4Luer com uma altura de canal de 0.4 mm, um volume de canal de 100 μ L, uma área de crescimento de 2,5 cm e uma área de revestimento de 25,4 cm2) adequada para todos os tipos de ensaio de fluxo, o tratamento físico gera uma superfície hidrofílica e adesiva. |
| Sulfato de magnésio (MgSO4, não hidratado) | Sigma Aldrich | M7506-500G | Para preparação do meio ECGMS |
| Bomba microfluídica | ibidi | 10905 | de pressão de ar |
| Câmara de contagem de células Neubauer | Karl Hecht GmbH& Co KG | 40442002 | câmara de contagem microscópica para HUVECs |
| Paraformaldeído 16% (PFA) | Microscopia Eletrônica Ciências | 15710-S | para reticulação de amostras |
| Conjunto de Perfusão | ibidi | 10964 | O Conjunto de Perfusão Amarelo/Verde tem um diâmetro de tubo de 1,6 mm, um comprimento de tubo de 50 cm, um volume total de trabalho de 13,6 mL, um volume de tubo morto de 2,8 mL e um tamanho de reservatório de 10 mL. combinado com o µ-slide L0.4Luer, em 37 & C e uma viscosidade de 0,0072 dyn x s/cm2 uma faixa de vazão de 3,8mL/min até 33,9 mL/min e tensão de cisalhamento entre 3,5 din/cm2 e 31,2 din/cm2 podem ser alcançados. com 50 cm de comprimento para |
| solução salina tamponada com fosfato | a solução foi preparada usando os seguintes produtos químicos: 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 , pH 7,4 | ||
| Cubetas de plástico | Sarstedt | 67.741 | (2 x ópticas) para medição de DO a 600 nm |
| Anti-soro específico para pneumococo | Pineda | criado em coelho usando Streptococcus pneumoniae NCTC10319 e D39 inativados por calor, purificados por IgG usando coluna de proteína A-sepharose. | |
| de poliestireno ou isopor | esta é uma medida de precaução para evitar o estresse pelo frio nas células semeadas nas lâminas do canal. Qualquer tipo de isopor, como material de caixa de embalagem, pode ser usado. A placa pode ter 0,5 cm de espessura e deve ter um tamanho de 20 cm2. | ||
| Cloreto de potássio (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | utilizado para amortecedor PBS |
| Software de controlo da bomba (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Software informático para controlar a bomba de pressão, definir as condições de caudal e iniciar/terminar o caudal |
| Tubos de reacção 1,5/2,0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | necessários para diluições de anticorpos |
| Tubos de reacção com 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| pneumococos que expressam RFP | Coleção Nacional de Culturas-Tipo, Saúde Pública Inglaterra | 10,319 | Streptococcus pneumoniae sorotipo 47 expressando RFP fundido a proteína semelhante a histonas integrada ao genoma |
| Pipetas sorológicas 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | para pipetar volumes maiores |
| Carbonato de sódio (Na2CO3, sem água) | Sigma Aldrich | 451614-25G | para preparação de tampão de carbonato de sódio 100 mM |
| Dihidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | usado para buffer PBS |
| Fotômetro espectral Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | medição da densidade óptica (DO) da suspensão bacteriana a 600 nm |
| Sacarose | Sigma | Aldrich S0389-500G | para preparação de tampão de bloqueio |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Usado em concentração final de 0,1% diluída em dH20 para permeabilização de células eucarióticas após fixação de PFA |
| Extrato de levedura | oxóide | LP0021 | as bactérias são cultivadas em suplemento de THB com 1% [p/p] de extrato de levedura = meio de cultivo bacteriano completo THY |
Referências
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152
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Reimpressões e permissões
