Summary
여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.
Abstract
여기에 제시된 프로토콜은 전립선 상피 오르가노이드에서 약력학, 줄기 세포 전위 및 암 분화를 연구하는 프로토콜이다. 전립선 오르가노이드는 안드로겐 반응형 3차원(3D) 배양체로 전립선 피상과 유사한 정의된 배지에서 성장합니다. 전립선 오르가노이드는 야생 형 및 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선 암에서 확립 될 수 있습니다. 중요한 것은, 환자 유래 오르가노이드는 유전학과 생체 내 종양 생물학에 있는 종양을 밀접하게 닮습니다. 또한, 오르가노이드는 CRISPR/Cas9 및 shRNA 시스템을 사용하여 유전자 조작이 가능합니다. 이 통제된 유전학은 약리학적인 반응에 유전형 그리고 돌연변이 단면도의 효력을 급속하게 시험하기 위한 단장으로 오르가노이드 문화를 매력적으로 만듭니다. 그러나, 실험 프로토콜은 재현 가능한 결과를 얻기 위하여 오르가노이드 문화의 3D 본질에 구체적으로 적응되어야 합니다. 여기서 설명된 것은 오르가노이드 형성 능력을 결정하기 위한 시딩 분석을 수행하기 위한 상세한 프로토콜이다. 그 후, 이 보고는 생존력 측정, 단백질 격리 및 RNA 격리를 통해 약물 치료를 수행하고 약리학적 반응을 분석하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 프로토콜은 피하 이식을 사용하여 이종이식 및 후속 생체 내 성장 분석에 대한 오르가노이드를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 매우 재현 가능한 데이터를 생성하며 3D 문화 시스템에 널리 적용됩니다.
Introduction
약물 내성은 암 치료의 주요 임상 문제 중 하나입니다. 전이성 전립선암 (PCa) 치료는 주로 안드로겐 신호 전달 축을 지향한다. 차세대 항안드로겐 치료법(예: 엔잘루타미드 및 아비라테론)은 임상적으로 큰 성공을 보였지만, 사실상 모든 PCa는 결국 안드로겐 독립 국가 또는 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다.
CRPC의 최근 게놈 및 전사체 프로파일링은 전립선암에 내성의 세 가지 일반적인 메커니즘이 밝혀: 1) 안드로겐 수용체 (AR) 신호의 복원의 결과로 돌연변이를 활성화1; 2) 글루코코르티코이드 수용체(GR)의 활성화가 AR 신호전달의 손실을 보상할 수 있는 차세대 항안드로겐 치료 저항에 대한 전임상 모델에서 예시된 바와 같이 바이패스 신호전달의활성화2; 및 3) 종양 세포가 약물 표적에 의존하는 세포 유형에서 이에 의존하지 않는 다른 세포 유형으로 혈통을 전환하여 내성을 획득하는 계보 가소성의 최근 확인된 과정 (PCa에서 AR 음성으로 표현됩니다). 및/또는 신경 내분비 질환 [NEPC])3,4. 그러나 약물 내성을 유발하는 분자 메커니즘은 이해되지 않습니다. 더욱이, 취득한 반대로 안드로겐 저항은 악용될 수 있는 치료 취약점으로 이끌어 낼 수 있습니다. 따라서 환자 표현형 및 유전자형을 모방하는 모델 시스템에서 약물 반응을 평가하는 것이 필수적입니다.
전립선 오르가노이드는 정의된 배지를 가진 3D 단백질 매트릭스에서 성장한 오르가노티컬 배양체이다. 중요한 것은, 전립선 오르가노이드는 뮤린 또는 인간 기원의 양성 및 암 조직에서 확립 될 수 있으며, 그들은생체5,6에서발견되는 자형질 및 지질 학적 특징을 유지한다. 중요한 것은, 항안드로겐 에 민감한 PCa 및 CRPC 세포는 모두 오르가노이드의 현재 보상에서 표현된다. 또한, 전립선 오르가노이드는 CRISPR/Cas9 및 shRNA5를사용하여 쉽게 유전자 조작됩니다. 따라서, 전립선 오르가노이드는 약물 반응을 테스트하고 내성 메커니즘을 해명하기 위한 적합한 모델 시스템이다. 여기서, 상세한 프로토콜은 약물 검사를 수행하고 전립선 오르가노이드를 사용하여 약리학적 반응을 분석하기 위해 기술된다.
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Protocol
이 프로토콜에 기술된 모든 작업은 이전에 확립된 뮤린 오르가노이드 및 환자 유래 오르가노이드로 수행되었습니다. 모든 동물 작업은 기념 슬로안 케터링 암 센터의 연구 동물 자원 센터의 지침에 따라 수행되었다 (IACUC: 06-07-012). 모든 환자 유래 조직은 기념 슬로안 케터링 암 센터 (IRB: 12001)의 규칙 및 규정을 준수하여 수집되었습니다.
1. 중간 및 버퍼 준비
- 실험을 시작하기 전에 밤새 4°C에서 지하 멤브레인 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)를 해동한다. 사용 중에 얼음에 보관하십시오.
- 실험 전에 배양 판을 37°C에서 24시간 동안 놓습니다. 이것은 중합하기 위해 지하 멤브레인 매트릭스 돔 (이하 매트릭스 돔이라고함)을 도울 것입니다. 도금 오르가노이드는 단계 2.1.2에 기재되어 있다.
- 확립된 프로토콜5에따라 오르가노이드 배지를 준비한다.
- 표피 성장 인자를 첨가하지 않고 오르가노이드 배지를 준비합니다(EGF; 성분에 대한 재료 표 참조). EGF는 AR 전사 출력을 억제하고 항 안드로겐저항성 5를부여한다.
- 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)를 준비합니다.
참고: 이 매체는 섹션 2-4에서 트립신 대체와 효소 소화를 억제 하는 데 사용 됩니다. - 제조업체의 프로토콜에 따라 약물 솔루션을 준비합니다. 엔잘루타미드/mdv3100(이하 2세대 항안드로겐이라고함)의 경우, 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 100 μM의 스톡 용액을 준비한다. 재고는 최대 6 개월 동안 -20 °C에서 보관할 수 있으며 신선하게 만들 필요가 없습니다.
2. 분리, 효소 소화 및 오르가노이드의 확립
- 이전에 확립된 프로토콜5,7에따라 마우스 또는 인간 조직으로부터 전립선 오르가노이드를 분리한다. 간략한 설명은 아래에 제공됩니다.
- 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 전립선 조직을 효소적으로 다이제스트합니다. 본 실험에서, ADMEM/F12에서 5 mg/mL 콜라게나아제 타입 II의 1 mL을 전립선 조직의 50 mg의 소화에 사용하였다.
- 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집하고, 세포를 계산하고, 지하 막 매트릭스에서 재중단하고, 예온 된 오르가노이드 배양 판에 매트릭스 돔에서 적절한 밀도5,7에서 플레이트 (도금) 메서드는 그림 1A에나와 있습니다.
- 돔이 완전히 덮여 있도록 돔의 상단에 미디어를 추가하고 고체화할 수 있도록 합니다.
- 하류 응용 프로그램에 대 한 원하는 수량으로 오르가노이드를 성장. 셀 번호는 표준 계수 방법에 의해 결정될 수 있습니다. 밀도에 대한 자세한 내용은 프로토콜의 응용 프로그램별 섹션을 참조하십시오.
- P1000 파이펫을 사용하여 매체와 파이펫을 위아래로 그려 방해합니다. 지하 멤브레인 매트릭스가 완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 전달합니다. 단일 15 mL 원엽 튜브 당 10 개 이상의 돔을 배치하지 마십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상한을 끄고 PBS 5 mL로 셀 펠릿을 씻습니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급을 벗고 트립신 교체의 4 mL에 펠릿을 다시 일시 중단. 37 °C에서 흔들어 5-10 분 동안 소화. 트립신 대체를 억제하기 위해 동일한 부피의 오르가노이드 배지 + 10% FBS를 추가합니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급을 끄고 PBS의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
- 40 μm 필터로 현탁액을 걸터 단일 셀 현탁액을 보장합니다. 혈세포계 또는 이에 상응하는 계수 장치를 사용하여 셀 번호를 정량화합니다.
참고: 실행 가능한 단일 셀을 얻는 것이 어려운 경우 흐름 정렬을 사용하여 단일 셀 솔루션을 얻습니다.
3. 오르가노이드 형성 능력 평가
참고 : 오르가노이드를 생성 할 수있는 세포의 비율을 결정하기 위해, 종자 분석은 줄기 / 전구 잠재력에 대한 프록시로 수행 될 수있다. 오르가노이드 형성 능력은 또한 생존 성 세포 에 대한 세포 파종 수를 정의하는 데 중요하다.
- 10 μM Rho 키나아제 억제제 Y-27632를 함유하는 오르가노이드 배지를 사용하여 현탁액의 10 μL당 2.7~ 100개의 세포에서 수득된 세포 현탁액을 희석시켰다.
- 1,100 개의 세포 (현탁액 110 μL)를 새로운 원유 관으로 옮니다.
- 지하 멤브레인 매트릭스 285 μL을 추가하고 세포를 다시 일시 중단합니다. 이것은 ~ 70 % 매트릭스 농도를 초래할 것이다.
참고 : 시딩 동안 지하 막 매트릭스의 희석은 단백질 매트릭스의 점도에 의한 돔 크기의 변화를 크게 감소시킵니다. - 미리 데운 24 웰 플레이트에서 매트릭스 돔의 35 μL의 종자 세포는 200 개의 세포 / 웰을 초래합니다. 플레이트 3-5는 샘플당 복제됩니다(도 1A 및 2.1.2 단계에서도 도금 방법 참조).
- 세포가 매트릭스 돔 내에 남아 있는지 확인하려면 플레이트를 뒤집어 셀 인큐베이터에 배치하여 지하 멤브레인 매트릭스를 고형화하십시오.
- 10분 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 제거하고 로키나아제 억제제 함유 배지를 첨가한다.
- 2일마다 매번 매체를 새로 고칩니다. 7 일 후, 오르가노이드의 수를 정량화하십시오. 실험 전반에 걸쳐 로키나아제 억제제들을 매체에 보관하였다.
- 돔 당 설립 된 오르가노이드의 수를 계산하고 도금 된 세포의 총 수 (200 세포)에서 형성 된 오르가노이드의 백분율을 계산합니다.
참고 : 유기 성 설립 비율은 세포 유형과 유전자형에 따라 3 %-60 %에서 다릅니다.
4. 오르가노이드의 약리학적 반응 결정
- 2.7단계에서 계속, 매트릭스 돔에서 종자 1,000-10,000 셀. 최종 세포 수를 결정하기 위한 대리자로서 오르가노이드 형성 효율 및 성장 속도를 이용한다.
참고: 권장 되는 셀 번호는 표 1에제공 됩니다. 분석당 조건당 3~5개의 복제를 사용합니다. 최종 농도 70% 지하 멤브레인 매트릭스를 사용하여 점도에 의해 유발되는 파이펫팅 오류를 줄입니다. - 종자 35 μL의 매트릭스 돔은 24웰 플레이트에서 및 3절에서 행해진 것처럼 돔이 고형화하게 한다(도 1A 및 2.1.2단계에서도 도금 방법 참조). 선택의 로키나아제 억제제 및 약물을 함유하는 배지를 추가한다. 이 방법은 모든 약물에 적용될 수 있지만, 이 프로토콜에서는, 2세대 항안드로겐이 예를 들어 10 μM에서 사용된다. 반 최대 억제 농도 (IC50)를 결정하려면 log10 증분을 수행하고 대조군으로 약물이 용해된 차량을 사용하십시오.
- 배지를 2~3일마다 새로 고치고 7일째에 오르가노이드를 분석하여 약물의 약리학적 반응을 확인한다. 타임 포인트는 실험 및 약물의 선택에 따라 다를 수 있습니다.
참고 : 오르가노이드는 이러한 분석을 수행하기 위해 트립시니화 될 필요가 없습니다. - 오간노이드를 그대로 유지하려면 P1000 파이펫을 사용하여 중간 및 파이펫을 위아래로 그려 지하 멤브레인 매트릭스를 방해합니다.
- 지하 멤브레인 매트릭스가 완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 전달합니다. 15 mL 원엽 튜브당 10개 이상의 매트릭스 돔을 전송하지 마십시오.
- 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리. 상류를 뽑고 PBS 5 mL로 씻으하십시오.
- PBS의 1 mL에 오르가노이드를 다시 중단하고 삼각과 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 오르가노이드를 방해합니다.
- 오르가노이드 조각의 수를 정량화합니다. 시드 5는 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 100개의 오르가노이드 단편을 포함하는 복제한다.
- 7항에 기재된 바와 같이 세포 생존성 분석기를 수행한다.
5. 오르가노이드로부터의 RNA 분리
참고: 시판되고 있는 컬럼 기반 방법은 RNA의 양과 품질을 양호하게 산출합니다. 양호한 RNA를 보장하려면 샘플당 최소 1개의 돔을 사용하십시오. 그러나 3 개의 돔을 사용하는 것이 좋습니다.
- ß-메르카포에탄올 추가 (1%) RNA 절연 키트에서 글루타티온 용해 완충제에.
- 오르가노이드가 함유된 지하 멤브레인 돔에서 배지를 끄고 이 완충액의 750 μL을 추가합니다. P1000 파이펫을 사용하여 위아래로 파이펫을. 모든 지하 멤브레인 매트릭스가 용해되었는지 확인하십시오.
- 70% 에탄올 750 μL을 추가하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 이어서 혼합물의 700 μL을 컬럼으로 옮기고, 1분 동안 12,000 x g에서 원심분리기를 넣고, 나머지 용해액을 반복한다.
- 제조업체의 지침에 따라 스와시 및 온컬럼 DNase 처리를 수행하십시오. RNA가 없는 물 30-50 μL에서 RNA를 용출합니다.
- OD = 260 nm 및 280 nm에서 형광계를 사용하여 농도를 측정하고 -80 °C에서 저장하거나 다운스트림 응용 프로그램을 계속하십시오.
6. 오르가노이드로부터의 단백질 분리
참고 : 단백질 분리를 위해 인산염 및 프로테아제 억제제가 함유 된 표준 RIPA 버퍼를준비하십시오 (재료 표). 적어도 세 개의 돔을 사용하는 것이 좋습니다, 이는 하나의 12 잘시드 할 수 있습니다.
- P1000 파이펫을 사용하여 오르가노이드와 파이펫이 포함된 지하 멤브레인 돔으로 셀에서 배지를 끌어올려 지하 멤브레인 매트릭스를 방해합니다.
- 완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 완전히 깨뜨리십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상한을 벗고 얼음으로 차가운 PBS 5 mL로 씻으하십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급을 벗고 트립신 교체의 4 mL에 펠릿을 다시 일시 중단. 37°C에서 흔들면서 5-10분 동안 소화합니다.
- 트립신 교체를 억제하기 위해 동일한 부피의 오르가노이드 배지 + 10% FCS를 추가합니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
참고 : 원심 분리 후, 지하 멤브레인 매트릭스는 펠릿에 표시되어서는 안됩니다. - 상한을 벗고 얼음으로 차가운 PBS 5 mL로 씻으하십시오. 상온액을 뽑아 P1000 파이펫을 사용하여 300 μL의 용해 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단한 다음 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 옮김을 옮김을 옮김.
- 얼음에 10 분 동안 배양한 후 4 °C의 온도로 냉각수에서 각각 30 s에 대해 2 x를 초음파 처리합니다. 튜브를 다시 얼음 위에 놓고 표준 방법을 사용하여 단백질 정량화를 수행합니다.
- 로딩 염료를 함유하는 도데실 황산나트륨(SDS)을 첨가하여 단백질을 변성시키고 95°C에서 5분간 끓인다. -80°C에서 용해하거나 다운스트림 어플리케이션을 계속 보관하십시오.
7. 오르가노이드를 가진 세포 생존성 분석
참고: 시판되는 세포 생존력 분석 키트 및 발광계를 사용하여 세포 생존가능성을 평가할 수 있다. 제조업체의 지침에 따라 버퍼를 준비합니다. 조건당 5개의 복제가 권장됩니다: 1개의 복제는 24개의 웰 플레이트 의 한 웰에 35 μL 지하 막 매트릭스 돔으로 이루어져 있습니다.
- 매트릭스 돔을 그대로 두지 않도록 주의하면서 오르가노이드 배양의 매체를 빼내십시오.
- 65 μL의 PBS와 파이펫을 위아래로 추가하여 매트릭스 돔을 방해합니다.
- 세포 생존성 분석 키트 버퍼의 100 μL을 추가하고 파이펫팅에 의해 다시 중단합니다.
- 실온(RT)에서 10분 동안 흔들어 서 배양합니다.
- 100 μL의 혼합물을 발광계에 적합한 비반투명 플레이트로 옮기고 세포 생존 성 분석 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 판독을 수행합니다.
8. 이종이식을 위한 오르가노이드 의 준비
참고: 오르가노이드는 면역이 손상된 동물뿐만 아니라 등인성 마우스모두에서 피하 이식을 할 수 있습니다. 주입된 오르가노이드가 생체 내에서 구별될 수 있도록, 구성적으로 플루오로포어를 발현하는오가노이드를 라벨 5. 이식 효율이 오르가노이드 라인마다 다르기 때문에 주사 당 5 x 105 세포에서 2 x 106 셀을 사용하여 이식하는 파일럿 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
- P1000 파이펫을 사용하여 중간 및 파이펫을 위아래로 끌어올려 지하 멤브레인 매트릭스를 방해합니다. 완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 완전히 깨뜨리십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
참고: 원유관 당 10개 이상의 매트릭스 돔을 전송하지 마십시오. - 상급을 끄고 PBS 5 mL로 씻으하십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급을 벗고 트립신 교체의 4 mL에 펠릿을 다시 일시 중단. 37°C에서 흔들면서 5-10분 동안 소화합니다.
- 트립신 대체를 억제하기 위해 동일한 부피의 오르가노이드 배지 + 10% FBS를 추가합니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급을 끄고 PBS의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오. 40 μm 필터로 현탁액을 걸터 단일 셀 현탁액을 보장합니다. 표준 방법을 사용하여 셀을 정량화합니다.
- PBS + Rho 억제제에서 세포를 100 μL당 2 x 106 셀의 농도로 스핀 다운하고 다시 중단합니다(다양한 농도에 필요한 세포 농도 및 절대 세포 수에 대한 표 2 참조). 동일한 부피의 지하 멤브레인 매트릭스를 사용하여 1:1 서스펜션을 생성합니다. 얼음에 서스펜션을 놓습니다.
- 표준 프로토콜에 따라 세포를 주입하고 표준 방법을 사용하여 이종이식 성장을 모니터링8.
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Representative Results
시딩 효율
유기체 형성 능력은 표현형 및 유전자형에 의해 결정됩니다. 야생형(WT) 전립선 기저세포는 우수한 오르가노이드 형성 능력(30%-40%)을 보였다. 발광 세포 (3%)에 비해 (그림1A). 오르가노이드 설립 후, 형성 능력이 급격히 증가했습니다. 전형적으로, WT 오르가노이드로부터 유래된 세포의 25%-30%는 새로운 오르가노이드를 형성할 수있다(도 1B). CRISPR/Cas9 매개 Pten (PtenΔ/Δ)또는 p53 (p53Δ/Δ)의손실은 오르가노이드 형성 능력의 경미한 증가를 초래했다. p53 및 Pten의 손실은 더 증가된 형성 용량을 증가시킵니다(도1B).
약리학적 반응
파종 효율에 기초하여, 24개의 웰 플레이트에서 지하 멤브레인 매트릭스 돔의 35 μL에서 1,000-10,000개의 세포를 파종하여 수행하였다. 오르가노이드 형성 효율에 기초한 권장 세포 시종 수치는 표 1에제공된다. 그러나, 오르가노이드 증식 속도는 유전자형에 따라 크게 다를 수 있습니다. 세포 시드 수에 대한 추가적인 변화는 증식에 기초하여 이루어질 수 있다.
그림 2에서,성장에 대한 반대로로겐성 분자의 효과는 다른 유전자형을 가진 뮤린 오르가노이드에서 시험되었다. 총 2,500개의 세포를 WT 유전자형, p53 손실, Pten 손실, 또는 이중 p53 및 Pten 손실을 가진 뮤린 오르가노이드로부터 시드하였다. p53 및 Pten 손실은 C57/Bl6 유전적 배경을 가진 Rosa26 프로모터의 통제 하에 Cas9를 구성하는 유기체에서 p53 및/또는 Pten 궤적을 표적화하는 gRNA의 렌티바이러스 도입에 의해 개시되었다9.
p53의 손실은 항 안드로겐 분자에 대한 내성을 일으키지 않았다. Pten의 손실은 이전에 도시 된 바와 같이 안티 안드로겐 화합물에 대한 저항을 증가10. 그러나 p53 및 Pten의 이중 손실은 2세대 항안드로겐에 대한 완전한 저항을 초래하였다(도2A). AR 억제는 또한 변경한 오르가노이드 표현형을 바꾸었습니다. 대조군 Cas9+/+ 오르가노이드뿐만 아니라 P53Δ/Δ-삭제 및 PtenΔ/Δ 오르가노이드에서, 오르가노이드 루멘 크기의 감소가 관찰되었다(그림2B). p53Δ/Δ PtenΔ/Δ 오르가노이드는 전형적으로 영향을 받지 않았다(그림 2B). 이러한 결과에 따라, 1 x 106 세포가 측면에 피하로 이식되었을 때, 단지 p53Δ/Δ PtenΔ/Δ 오르가노이드가 성장하였다(그림2C). 전반적으로, 이러한 결과는 p53Δ/Δ PtenΔ/Δ 공동 결실이 뮤린 오르가노이드의 2세대 항안드로겐에 대한 내성을 초래한다는 것을 보여줍니다.
환자 유래 PCa 오르가노이드는 표현형 및 유전자형11,12; 따라서, 약물에 대 한 응답 인간의 PCa 오르가노이드 라인 사이 크게 다를 수 있습니다. 도 3에서,두 개의 뚜렷한 인간 PCa 오르가노이드, MSKPCA2 및 MSKPCA3의 항안드로겐성 분자 반응이 도시된다. MSKPCA2 오르가노이드의 증식은 항 안드로겐 성 분자에 의해 강하게 억제된 반면 MSKPCA3 오르가노이드는 영향을 받지 않았습니다(그림 3A, B). MSKCPCA2 오르가노이드는 높은 수준의 AR 및 AR 표적 FKBP5를 발현하고 CK8 및 CK18과 같은 특징적인 발광 단백질을 발현했다. 대조적으로, MSKPCA3 오르가노이드는 또한 기저 (CK5) 및 중간엽(Vimentin) 마커를 발현하고 FKBP5의 발현을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 이러한 오르가노이드가 비발광 안드로겐 독립적 표현형을 모델링한다는 것을 시사한다.
그림 1: 인간 및 마우스 전립선 세포의 오르가노이드 형성 률을 측정합니다. (A)지하 막 매트릭스 (왼쪽)와 매트릭스 돔에서 오르가노이드 시드 (오른쪽)에서 세포 재현탁액의 개략적 개요. (B)인간 (CD49f +)-유래 기저 및 (CD26+)-유래 발광 세포 (%, y축; 평균 ± SD)의 존재 1 nM DHT의 존재. 총 200개의 세포를 시드하고 오르가노이드의 수를 7일 후 시드(n=3, ***p< 0.01, t-test)로 정량화하였다. (C)1 nM DHT가 있는 경우 Murine WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ 및 P53Δ/Δ/Δ 및 P53 Δ/ΔΔ/Δ 오르가노이드(%, y-축;평균 ±SD)의 상대오르가노이드 형성. 총 200개의 세포를 시드하고 오르가노이드의 수를 7일 후 시드(n=3)로 정량화하였다. p53 및 Pten 손실은 Rosa26 프로모터 하에서 Cas9를 구성하는 오르가노이드에서 p53 및/또는 Pten 궤적의 gRNA 의 표적화에 의해 매개되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유전자 조작 마우스에서 유래한 오르가노이드의 약리학적 반응을 평가한다. (A)뮤린 WT, PtenΔ/Δ,P53Δ/Δ및 P53Δ/Δ/Δ의 상대세포 증식, P53 Δ/ΔPten Δ/Δ 오르가노이드(y-축, 평균 ±SD, 세포 생존력 분석 키트로 측정) 7일 후 설립 후 오르가노이드; (n = 3, *p < 0.05, t-test) 1 nM DHT 또는 10 μM의 2 세대 항안드로겐. (B)WT, PtenΔ/Δ,P53Δ/Δ및 P53Δ/Δ/ Δ 및 P53 Δ/ΔPten Δ/Δ 오르가노이드 배양물의 대표적인 브라이트필드 이미지는 1 nM DHT 또는 10 μM 2세대 항안드로겐으로 처리되었다. (C)WT, PtenΔ/Δ,P53Δ/Δ,및 P53 Δ/Δ/Δ의 대표적인 성장 곡선, 및 P53Δ/Δ Pten Δ/Δ 오르가노이드는 등소성 C57/Bl6 마우스의 측면에 피하 주사를 주입하였다. 오직 P53Δ/Δ PtenΔ/Δ 오르가노이드만이 성장을 보였다. 총 1 x 106 세포를 주입하였다. P53Δ/Δ PtenΔ/Δ 오르가노이드의 3개의 독립적인 곡선은 성장 속도의 이질성을 나타내기 위해 나타난다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인간 전립선암 생검 유래 오르가노이드의 약리학적 반응을 평가한다. (A)환자 유래 MSKPCA2 및 MSKPCA2 오르가노이드(y 축, 평균 ±SD, 세포 생존성 분석 키트로 측정)의 상대세포 증식 5,000세포 의 7일 후 오가노이드(n = 4, *lt; 0.05, t-test) 1 nM DHT 또는 10 μM 2 세대 안티 안 드로 겐 표시. (B)지시된 바와 같이 1 nM DHT 또는 10 μM 2세대 항안드로겐으로 처리된 MSKPCA2 및 MSKPCA3 오르가노이드 배양의 대표적인 브라이트필드 이미지. (C)MSKPCA2 및 MSKPCA3 오르가노이드에서 AR, FKBP5 (AR 표적 유전자), CK8 및 CK18 (루미날 마커), CK5 (기저 마커), 비멘틴 (중간엽 마커)의 서양 블롯 분석. GAPDH는 로딩 제어로 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 오르노이드 시딩 효율(%) | 셀 시드 번호(돔당) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
표 1: 오르가노이드 형성 능력에 기초하여 약리학적 반응을 평가하는 데 사용되는 세포 파종 수. 테이블별 컬럼(왼쪽에서 오른쪽)은 행렬 돔당 종자되는 오르가노이드 형성 용량 범위 및 상응하는 세포 수를 포함한다.
| 총 셀 수 | PBS0+ Y-27632 | 마트리겔 볼륨 | 세포 농도 / 주입 |
| 5 x 106 | 500 μl | 500 μl | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1.5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 μl | 500 μl | 2 x 106 |
표 2: 오르가노이드 이종이식 실험에 권장된 세포 번호. 왼쪽에서 오른쪽으로 열은 10 주사에 대한 절대 총 세포 수, 10 주사에 대한 PBS + Y-27632의 총 부피, 지하 막 매트릭스 볼륨 및 주사 당 세포 수를 포함한다.
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Discussion
항 안드로겐 저항의 근본적인 분자 기계장치를 이해하고 잠재적인 치료 취약성을 발견하려면 전립선암을 모방한 모델 시스템에서 약리학적 반응을 테스트해야 합니다. 여기서 설명된 상세한 프로토콜은 환자 유래 및 유전자 조작 전립선 오르가노이드및 다운스트림 애플리케이션을 위한 이러한 오르가노이드 샘플의 제조에서 약리학적 반응의 신뢰할 수 있는 분석을 위한 상세한 프로토콜이다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 오르가노이드의 종자 효율 및 성장 속도를 결정하는 것입니다. 오르가노이드 성장 속도는 크게 다릅니다. 이것은 인간 유래 오르가노이드보다는 약 2 배 빨리 성장하기 때문에, 종에 의존합니다. 종을 제외하고 성장 속도는 유전자형과 표현형에 달려 있습니다. 그러나, 시딩 효율 및 성장 속도가 결정되면, 이 프로토콜은 모든 전립선 오르가노이드 유형에 적응될 수 있다.
두 번째 중요한 단계는 후속 다운스트림 애플리케이션에 대비하기 위해 단백질 매트릭스 기반 3D 배양과 협력하는 것입니다. 도금 시 지하 멤브레인 매트릭스의 점도에 의한 종자 변이의 도입은 희석(70%)을 사용하여 피할 수 있습니다. 설명된 대로 지하 멤브레인 매트릭스. 오르가노이드를 과도하게 방해하지 않고 중합 매트릭스를 적절히 분해하는 것도 상세히 기술되어 있다. 이 프로토콜은 PCa에서 다른 유전 적 배경을 위한 약물 라이브러리의 스크리닝을 위해 적응될 수 있는 오르가노이드 판독에 있는 변이를 소개하지 않고 매트릭스의 중단을 가능하게 합니다. 더욱이, CRISPR/Cas9- 또는 shRNA 기반 발현 간섭을 수행함으로써, 약물 내성을 부여하는 유전자가 질의될 수 있다.
고려 포인트는 전립선 오르가노이드 문화의 중간 조성이 약리학적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 예를 들어, EGF, 뮤린과 인간의 전립선 오르가노이드 문화의 구성 요소, 크게 안티 안 드로 겐에 감도 감소. 따라서, EGF는 배지로부터 이 프로토콜에서 생략되고, 항안드로겐에 대한 민감도가 회복된다. 어떤 organoid 성분 테스트 되 고 약물에 대 한 감도 영향을 미치는 경우 결정 하는 것이 좋습니다. 이는 (EGF, 노긴, R-spondin1, DHT 및 A83-001 [뮤린 오르가노이드 배지의 조성]을 제외하고)가 섬유아세포 성장 인자 10 (FGF10), FGF2, 프로스타글란딘 E2를 포함하는 복잡한 인간 전립선 오르가노이드 배양 배지에 특히 해당합니다. 니코틴아미드, 및 p38i 억제제 SB202190.
오르가노이드 배지 조성물은 암 조직에 대한 양성 전립선 상피의 성장을 선호하므로 원발성 호르몬에 민감한 PCa 오르가노이드 라인이 확립되지 않았습니다. 현재, 모든 인간 PCa 오르가노이드는 향상된 전이성 항 안드로겐 내성 PCa를 가진 환자로부터 유래; 따라서, 이러한 라인의 대부분은 안티 안 드로 겐 저항 하 고 새로운 치료를 식별 하기 위해 적합. 개념 증명으로서, 델타형 3(DLL3)은 로왈피투주맙 테시린13으로표적화되는 환자 유래 NEPC 오르가노이드를 이용한 치료 표적으로 확인되었다. 이 방법은 이러한 유형의 실험에 적합하며 정상 양성 조직, 원발성 전립선암 및 CTC의 전립선 오르가노이드에도 적합합니다.
전립선 오르가노이드 문화의 한 가지 단점은 세포 틈새 시장이 없다는 것입니다. 따라서, 비종양 세포에 의한 약물 내성에 대한 기여는 현재 플랫폼을 사용하여 연구될 수 없다. 그러나, 자가 T 세포를 가진 대장암 및 폐암 오르가노이드의 공동 배양은 최근에 설립되어 종양과 면역 계통 사이의 상호 작용에 대한 연구가 가능하게14. 다른 공동 배양 시스템은 비세포-자율적 상호작용을 추가로 연구하기 위해 확립될 수 있다.
결론적으로, 이 보고는 전립선 오르가노이드 및 후속 다운스트림 응용에 있는 약리학적인 반응의 재현가능한 평가를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 광범위하게 적용 가능하며 결장15,소장16, 위17, 18,간19,췌장20,대장 을 포함한 다른 장기의 오르가노이드 배양에 사용될 수 있습니다. 신장21, 그리고 유방 선22.
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Disclosures
C.L.S는 노바티스 의 이사회에서 활동하고 있습니다. ORIC 제약의 공동 창립자이며 엔잘루타미드와 아팔루타미드의 공동 발명가입니다. Agios, 베이진, 블루프린트, 컬럼 그룹, 포그혼, 하우스 제약, 넥스트에치, KSQ, 페트라 및 PMV에 대한 과학 고문입니다. 2014년 제넨텍/로슈가 인수한 세라곤의 공동 창업자입니다. W.R.K.는 오르가노이드 기술의 공동 발명가이자 특허 보유자입니다.
Acknowledgments
K.P.는 NIH 1F32CA236126-01에 의해 지원됩니다. C.L.S.는 HHMI에 의해 지원됩니다. CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; 스타 암 컨소시엄. W.R.K.는 네덜란드 암 재단 / KWF Buit 2015-7545 및 전립선 암 재단 PCF 17YOUN10에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
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