Summary
Presenteras här är ett protokoll för att studera farmakologiska svar i prostata epitelial organoider. Organoider liknar nära in vivo biologi och recapitulate patient genetik, vilket gör dem attraktiva modellsystem. Prostata organoider kan etableras från vildtyp prostates, genetiskt modifierade musmodeller, godartad mänsklig vävnad, och avancerad prostatacancer.
Abstract
Presenteras här är ett protokoll för att studera farmakodynamik, stamcells potential, och cancer differentiering i prostataepitelial organoider. Prostata organoider är androgen lyhörd, tredimensionella (3D) kulturer odlas i ett definierat medium som liknar det prostatiska epitelet. Prostata organoider kan etableras från vildtyp och genetiskt modifierade musmodeller, godartad mänsklig vävnad, och avancerad prostatacancer. Viktigare, patient härledda organoider liknar nära tumörer i genetik och in vivo tumörbiologi. Dessutom kan organoider vara genetiskt manipulerade med hjälp av CRISPR/Cas9 och shRNA system. Dessa kontrollerade genetik gör den Organoid kulturen attraktiv som en plattform för att snabbt testa effekterna av genotyper och mutationella profiler på farmakologiska svar. Experimentella protokoll måste dock anpassas specifikt till 3D-karaktären hos Organoid kulturer för att få reproducerbara resultat. Beskrivs här är detaljerade protokoll för att utföra seedning analyser för att bestämma Organoid formation kapacitet. Därefter visar denna rapport hur man utför läkemedelsbehandlingar och analyserar farmakologisk respons via viabilitet, protein isolering och RNA-isolering. Slutligen beskriver protokollet hur man förbereder organoider för xenograftering och efterföljande in vivo tillväxt analyser med subkutan ympning. Dessa protokoll ger mycket reproducerbara data och är allmänt tillämpliga på 3D-kultursystem.
Introduction
Läkemedelsresistens är en av de stora kliniska problem i cancerbehandling. Metastaserande prostatacancer (PCa) behandling är främst inriktad på androgen-signalering axeln. Nästa generations anti-androgen terapier (t. ex., enzalutamid och abirateron) har visat stor klinisk framgång, men praktiskt taget alla PCa fortskrider så småningom mot en androgen-oberoende stat, eller kastrationsresistenta prostatacancer (CRPC).
Senaste genomisk och transkriptomic profilering av CRPC avslöjade det finns tre generella mekanismer för resistens i prostatacancer: 1) aktiverande mutationer som resulterar i återställande av androgenreceptorn (ar) signalering1; 2) aktivering av bypass-signalering, som exemplifieras i en preklinisk modell för nästa generations anti-androgen terapi resistens där aktivering av glukokortikoid-receptorn (GR) kan kompensera för förlust av AR-signalering2; och 3) den nyligen identifierade processen för härstamning plasticitet, där tumörceller förvärva resistens genom att byta linjer från en celltyp beroende av drogen målet till en annan celltyp som inte är beroende av detta (som i PCa, representeras som AR-negativa och/eller neuroendokrina sjukdomar [nepc])3,4. Emellertid, de molekylära mekanismer som orsakar läkemedelsresistens inte förstås. Dessutom, förvärvade anti-androgen resistens kan leda till terapeutiska sårbarheter som kan utnyttjas. Därför är det viktigt att utvärdera läkemedelssvar i modellsystem som imiterar patientens fenotyper och genotyper.
Prostata organoider är organotypic kulturer odlas i en 3D-protein matris med ett definierat medium. Viktigt, prostata organoider kan fastställas från godartad och cancerogena vävnad av murin eller mänskligt ursprung, och de behåller fenotypiska och genotypisk funktioner som finns i vivo5,6. Viktigare, både anti-androgen känsliga PCa och CRPC celler representeras i den nuvarande kompendium av organoider. Dessutom är prostata organoider lätt genetiskt manipulerade med CRISPR/Cas9 och shRNA5. Sålunda, prostata organoider är ett lämpligt modellsystem för att testa läkemedelssvar och belysa resistensmekanismer. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för att utföra drogtester och analysera farmakologiska reaktioner med hjälp av prostata organoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt arbete som beskrivs i detta protokoll har utförts med tidigare etablerade murina organoider och patient-härledda organoider. Alla djur arbete utfördes i enlighet med riktlinjerna för forskning djur resurscentrum av Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Alla patient-härledda vävnader samlades i enlighet med regler och förordningar av Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).
1. medel-och buffertberedning
- Tina basalmembran Matrix (t. ex. Matrigel) vid 4 ° c över natten innan försöket påbörjas. Håll det på is under användning.
- Placera kultur plattorna vid 37 ° c i 24 timmar före experiment. Detta kommer att hjälpa basalmembranet Matrix Dome (hädanefter kallad Matrix Dome) för att polymerisera. Plätering organoider beskrivs i steg 2.1.2.
- Bered det organoida mediet enligt det fastställda protokoll5.
- Bered det organoida mediet utan tillsats av Epidermal tillväxtfaktor (EGF; se tabell över material för komponenter). EGF dämpar den AR transkriptionella produktionen och ger anti-androgen resistens5.
- Förbered Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med 10% foster bovint serum (FBS).
Anmärkning: detta medium används för att hämma enzymatisk nedbrytning med trypsin ersättning i avsnitt 2-4. - Förbered läkemedelslösningar enligt tillverkarens protokoll. För enzalutamid/MDV3100 (hädanefter kallad andra generationens antiandrogen), Bered en stamlösning på 100 μM i dimetylsulfoxid (DMSO). Lagret kan förvaras vid-20 ° c i upp till 6 månader och behöver inte göras färskt.
2. isolering, enzymatisk nedbrytning och etablering av organoider
- Isolera prostata organoider från mus eller mänsklig vävnad enligt de tidigare fastställda protokollen5,7. Nedan finns en kort beskrivning.
- Finhacka och enzymatiskt smälta prostatavävnad för att producera en enda cellsuspension. I detta experiment användes 1 mL 5 mg/mL kollagenastyp II i ADMEM/F12 för nedbrytning av 50 mg prostatavävnad.
- Samla celler genom centrifugering vid 300 x g i 5 min, räkna cellerna, Omsuspendera dem i källaren membran matris, och tallrik vid lämplig densitet5,7 i matrisen kupoler på förvärmda Organoid kultur plattor (plätering metod visas i figur 1A).
- Låt kupoler stelna och lägga till media på topparna av kupoler så att de är helt täckta.
- Odla organoider till önskad mängd för nedströms applikationer. Cell nummer kan bestämmas med hjälp av standard inventerings metoder. Se den tillämpningsspecifika delen av protokollet för ytterligare information om densitet.
- Använd en P1000-pipett och dra upp mediet och Pipettera uppåt och nedåt för att störa. När basalmembran matris är helt störd, överföra suspensionen till en 15 mL koniskt rör. Placera inte mer än 10 kupoler per enskilt 15 mL koniskt rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Dra av supernatanten och tvätta cellpelleten med 5 mL PBS. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Dra av supernatanten och Omsuspendera pelleten i 4 mL trypsin-ersättning. Digest för 5-10 min med skakning vid 37 ° c. Lägg till en lika stor mängd Organoid medium + 10% FBS för att hämma trypsin Replacement. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Dra av supernatanten och Omsuspendera i 1 mL PBS.
- Filtrera suspensionen med ett 40 μm-filter för att säkerställa en enda cellsuspension. Kvantifiera cellnumret med hjälp av en hemocytometern eller motsvarande räkneapparat.
Obs: om det är svårt att få livskraftiga enstaka celler, Använd flödes sortering för att få en enda cell lösning.
3. bedömning av Organoid Formations kapacitet
Anmärkning: för att bestämma andelen celler som kan generera en Organoid, en sådd analys kan utföras som en proxy för Stem/stamceller potential. Organoid formation kapacitet är också viktigt för att definiera ett cell sådd nummer för genomförbarhet analyser.
- Späd ut den cellsuspension som erhållits i steg 2,7 till 100 celler per 10 μL av suspensionen med hjälp av Organoid medium innehållande 10 μM Rho-Kinas-hämmare Y-27632.
- Överför 1 100-celler (110 μL suspension) till ett nytt koniskt rör.
- Tillsätt 285 μL av basalmembran matris och Omsuspendera cellerna. Detta kommer att resultera i en ~ 70% Matrix koncentration.
Anmärkning: utspädning av basalmembranet matrisen under sådd minskar kraftigt variationen i kupolstorleken, orsakad av viskositeten hos proteinet matrisen. - Frö celler i 35 μl Matrix kupoler i en förvärmda 24 väl tallrik, vilket resulterar i 200 celler/brunn. Platta 3-5 replikat per prov (se även pläteringsmetoden i figur 1A och steg 2.1.2).
- För att säkerställa att cellerna förblir inom Matrix Dome, vänd plattan och placera den i en cellinkubator för att befästa basalmembran matrisen.
- Efter 10 min, ta bort plattan från inkubatorn och tillsätt medel som innehåller Rho-Kinas-hämmaren.
- Uppdatera mediet var 2: a dag. Efter 7 dagar, kvantifiera antalet organoider. Behåll Rho Kinas-hämmaren i media under hela experimentet.
- Räkna antalet organoider som fastställts per kupol och beräkna procent av organoider bildas av det totala antalet celler pläterade (200 celler).
Obs: Organoid etablering nyckeltal varierar från 3%-60% beroende på celltyp och genotyp.
4. bestämning av farmakologiska reaktioner av organoider
- Fortsätter från steg 2,7, utsäde 1000-10000 celler i en Matrix Dome. Använd Organoid formation effektivitet och tillväxthastighet som en proxy för att bestämma det slutliga cellnumret.
Anmärkning: rekommenderade cell nummer finns i tabell 1. Använd tre till fem replikat per tillstånd per analys. Använd en slutlig koncentration av 70% basalmembran matris för att minska pipettering fel induceras av viskositeten. - Utsäde 35 μL av matriskupoler i en 24-brunn platta och låt kupoler stelna enligt vad som görs i avsnitt 3 (se även pläteringsmetoden i figur 1a och steg 2.1.2). Tillsätt medel som innehåller Rho kinashämmare och drogen val. Denna metod kan tillämpas på alla läkemedel, men i detta protokoll, en andra generationens anti-androgen används vid 10 μM för ett exempel. För att bestämma halva maximal hämmande koncentration (IC50), utföra en log10 inkrementell, och som en kontroll, använda det fordon där läkemedlet upplöstes.
- Uppdatera mediet varannan eller tre dagar och analysera organoider på dag 7 för att bestämma den farmakologiska reaktionen av drogen. De tidpunkter kan variera mellan valet av experiment och drog.
Obs: Organoider behöver inte vara trypsinized att utföra dessa analyser. - För att hålla organoider intakta, Använd en P1000 pipett, rita upp mediet och Pipettera upp och ner för att störa basalmembran matrisen.
- När basalmembranet matrisen är helt störd, överföra suspensionen till en 15 mL koniskt rör. Överför inte mer än 10 matrixkupoler per 15 mL koniskt rör.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min. Dra av supernatanten och tvätta med 5 ml PBS.
- Omsuspendera organoider i 1 mL PBS och störa organoiderna med hjälp av triturering och en glas Pasteur-pipett.
- Kvantifiera antalet Organoid fragment. Utsäde 5 replikat som innehåller 100 Organoid fragment som beskrivs i steg 2.1.2.
- Utför analysen av cell genomförbarhet enligt beskrivningen nedan i avsnitt 7.
5. RNA-isolering från organoider
Obs: kommersiellt tillgängliga kolumnbaserade metoder ger god kvantitet och kvalitet av RNA. För att säkerställa god kvantitet RNA, Använd minst en kupol per prov; emellertid, med hjälp av tre kupoler rekommenderas, som kan seedade i en enda brunn på en 12 bra tallrik.
- Lägg till ß-merkaptoetanol (1%) till glutation lyseringsbufferten i RNA-isolerings satsen.
- Dra av mediet från basalmembran kupoler som innehåller organoider och tillsätt 750 μL av denna buffert. Pipettera upp och ned med en P1000 pipett. Kontrollera att alla basalmembran matris har upplösts.
- Tillsätt 750 μL 70% etanol och blanda med pipettering. Därefter överföra 700 μL av blandningen till kolonnen, Centrifugera vid 12 000 x g för 1 min, och upprepa med resten av lysatet.
- Utför tvättningar och behandling med DNase i kolumner enligt tillverkarens anvisningar. Elute RNA i 30-50 μL av RNAse-fritt vatten.
- Mät koncentrationerna med en fluorometer vid OD = 260 Nm och 280 nm och förvara vid-80 ° c eller Fortsätt med nedströmsanvändningar.
6. protein isolering från organoider
Anmärkning: för protein isolering, Förbered standard RIPA buffert som innehåller fosfatas och proteashämmare (tabell över material). Med minst tre kupoler rekommenderas, som kan seedas i en enda 12 brunn.
- Med hjälp av en P1000 pipett, upprätta mediet från cellen med basalmembran kupoler som innehåller organoider och Pipettera upp och ner för att störa basalmembranet matrisen.
- När den är helt störd, överför suspensionen till ett 15 mL koniskt rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Dra av supernatanten och tvätta med 5 mL iskall PBS. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Dra av supernatanten och Omsuspendera pelleten i 4 mL trypsin-ersättning. Smälta för 5-10 min vid skakning vid 37 ° c.
- Lägg till en lika stor mängd Organoid medium + 10% FCS att hämma trypsin ersättare. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
Anmärkning: Postcentrifugering, ingen basalmembran matris ska synas i pelleten. - Dra av supernatanten och tvätta med 5 mL iskall PBS. Dra av supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 300 μL lyseringsbuffert med ett P1000 pipet och överför sedan till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
- Inkubera på isen i 10 min och därefter Sonikera 2x för 30 s vardera vid kylt vatten med en temperatur på 4 ° c. Sätt tillbaka röret på isen och utför proteinkvantifiering med hjälp av standardmetoder.
- Denaturera proteinet genom att tillsätta natriumdodecylsulfat (SDS) som innehåller laddnings färg och koka i 5 min vid 95 ° c. Förvara celllysat vid-80 ° c eller Fortsätt med nedströms applikationer.
7. analys av cellernas genomförbarhet med organoider
Anmärkning: cellernas lönsamhet kan bedömas med hjälp av det kommersiellt tillgängliga analys paketet för cell viabilitet och en luminometer. Förbered buffertarna enligt tillverkarens anvisningar. Fem replikat per tillstånd rekommenderas: en replikat bestående av 1 35 μL basalmembran Matrix Dome i en brunn på en 24 brunn tallrik.
- Dra av mediet av Organoid kulturen, är noga med att lämna matrisen kupoler intakt.
- Tillsätt 65 μL PBS och Pipettera upp och ner för att störa Matrix Dome.
- Tillsätt 100 μl av cell genomförbarheten assay kit buffert och Omsuspendera cellerna under genom pipettering.
- Inkubera i rumstemperatur (RT) i 10 minuter med skakning.
- Överför 100 μL blandning till en icke-genomskinlig platta som lämpar sig för luminometern och utför avläsning enligt tillverkarens anvisningar för analys satsen för cell genomförbarhet.
8. beredning av organoider för xenograftering
Obs: Organoider är också mottagliga för subkutan ympning i både immunsupprimerade djur, samt, isogena möss. För att säkerställa injicerade organoider är distinguishable in vivo, etikett organoider med en konstitutivt uttrycker fluorophore5. Det rekommenderas att utföra ett försöks experiment för ympning med 5 x 105 celler till 2 x 106 celler per injektion, med steg om 5 x 106 celler, som ympning effektivitet varierar mellan Organoid linjer.
- Använd en P1000-pipett för att rita upp mediet och Pipettera uppåt och nedåt för att störa basal membranmatrisen. När den är helt störd, överför suspensionen till ett 15 mL koniskt rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
Obs: överför inte mer än 10 matrixkupoler per 15 mL koniskt rör. - Dra av supernatanten och tvätta med 5 mL PBS. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Dra av supernatanten och Omsuspendera pelleten i 4 mL trypsin-ersättning. Smälta för 5-10 min vid skakning vid 37 ° c.
- Lägg till lika stor mängd Organoid medium + 10% FBS för att hämma trypsin Replacement. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Dra av supernatanten och Omsuspendera i 1 mL PBS. Filtrera suspensionen med ett 40 μm-filter för att säkerställa en enda cellsuspension. Kvantifiera celler med hjälp av standardmetoder.
- Snurra och Omsuspendera cellerna i PBS + Rho-hämmare till en koncentration av 2 x 106 celler per 100 μl (se tabell 2 för cellkoncentrationer och absolut cell nummer som behövs för varierande koncentrationer). Använd en lika volym av basalmembran matris för att generera en 1:1 suspension. Placera fjädringen på isen.
- Injicera celler enligt standardprotokoll och övervaka tillväxten av xenograft med hjälp av standardmetoder8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sådd effektivitet
Organoid formation kapacitet bestäms av fenotyp och genotyp. Vildtyp (WT) prostata basal celler visade överlägsen Organoid formation kapacitet (30%-40%) jämfört med luminala celler (3%) (Figur 1a). Efter Organoid etablering, bildandet kapaciteten ökat drastiskt. Normalt kan 25%-30% av cellerna som härleds från en WT-Organoid bilda en ny Organoid (figur 1B). CRISPR/Cas9-medierad förlust av PTEN (PTENΔ/δ) eller p53 (p53δ/δ) resulterade i en mindre ökning av organoidbildande kapacitet. Förlust av både p53 och PTEN ytterligare ökad bildning kapacitet (figur 1B).
Farmakologiska svaret
Baserat på sådd effektivitet, sådd av 1000-10000 celler i 35 μL av basalmembran Matrix Dome i en 24 bra tallrik utfördes. Rekommenderade cell sådd nummer baserat på Organoid formation effektivitet finns i tabell 1. Men, Organoid spridning hastigheter kan variera kraftigt beroende på genotyp. Ytterligare ändringar i cell sådd nummer kan göras baserat på proliferation.
I figur 2, effekterna av anti-androgena molekyler på tillväxt testades i murina organoider med olika genotyper. Totalt 2 500 celler var seedade från murina organoider med en WT genotyp, p53 förlust, PTEN förlust, eller dubbla p53 och PTEN förlust. p53 och PTEN-förlust initierades av lentiviral introduktion av en gRNA riktad mot p53 och/eller PTEN -Locus i Organoider som uttrycker Cas9 under Rosa26 Promotorns kontroll med en C57/Bl6 genetisk bakgrund9.
Förlust av p53 orsakar inte resistens mot de anti-androgena molekylerna. Förlust av PTEN ökad resistens mot androgen förening, som visas tidigare10. Dubbel förlust av p53 och PTEN resulterade dock i fullständigt motstånd mot den andra generationens antiandrogen (figur 2A). AR-hämning förändrade också Organoid fenotyper. I kontroll Cas9+/+ organoider, samt p53δ/δ-Deleted och PTENΔ/δ organoider, observerades en minskning av Organoid lumen (figur 2B). p53δ /δ PTENδ/δ organoider var fenotypiskt opåverkade (figur 2B). I linje med dessa resultat, när 1 x 106 celler var ympade subkutant i flanken, ökade endast p53δ/δ PTENδ/δ organoider (figur 2C). Sammantaget visar dessa resultat att p53δ/ δ PTENδ/δ Co-deletion leder till resistens mot andra generationens anti-androgen i murina organoider.
Patient-härledda PCa organoider är heterogena i fenotyp och genotyp11,12; Därför, svar på läkemedel kan skilja sig kraftigt mellan mänskliga PCa Organoid linjer. I figur 3, de anti-androgena molekyler svar av två distinkta humant PCa organoider, MSKPCA2 och MSKPCA3 visas. Spridningen av MSKPCA2 organoider hämmade starkt av anti-androgena molekyler, medan MSKPCA3 organoider förblev opåverkade (figur 3A, B). MSKCPCA2 organoider uttryckte höga halter av AR och AR-målet FKBP5, och de uttryckte Hallmark luminala proteiner som CK8 och CK18. Däremot MSKPCA3 organoider också uttryckt basal (CK5) och mesenkymala (Vimentin) markörer och visade inget uttryck för FKBP5. Dessa resultat tyder på att dessa organoider modell en icke-Luminal androgen-oberoende fenotyp.
Figur 1: mätning av Organoid bildnings hastigheter för prostata celler hos människa och mus. (A) Schematisk översikt över cell resuspension i basalmembran matris (vänster) och Organoid sådd i matris kupoler (höger). (B) relativ Organoid bildning av humana (CD49f +)-härledda basala och (CD26 +)-härledda luminala celler (%, y-axel, medelvärde ± SD) i närvaro av 1 Nm DHT. Totalt 200 celler var seedade och antalet organoider kvantifierades 7 dagar efter sådd (n = 3, * * * p < 0,01, t-test). C) relativ Organoid bildning av murin WT, PTENΔ/δ, p53δ/δ, och p53δ/δ PTENδ/δ organoider (%, y-axel, medelvärde ± SD) i närvaro av 1 Nm DHT. Totalt 200 celler var seedade och antalet organoider kvantifierades 7 dagar efter sådd (n = 3). p53 och PTEN -förlust medierades av grnas inriktning av p53 och/eller PTEN-Locus i Organoider som uttrycker Cas9 konstitutivt under en Rosa26 promotor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bedömning av det farmakologiska svaret hos organoider som härrör från genetiskt modifierade möss. A) relativ cellproliferation av MURIN WT, PTENΔ/δ, p53δ/Δoch p53 δ/δ PTENδ/δ organoider (y-axel, medelvärde ± SD, mätt med cell genomförbarhet assay Kit) av 2 500 celler 7 dagar efter etableringen av organoider; (n = 3, * p < 0,05, t-test) med 1 nM DHT eller 10 μM av andra generationens antiandrogen enligt indikationen. B) representativa brightfield-bilder på WT, PTENδ/δ, p53δ/Δoch p53Δ/δ PTENδ/δ Organoid kulturer behandlade med 1 Nm DHT eller 10 μm andra generationens antiandrogen enligt indikationen. C) representativ tillväxtkurva för WT, PTENΔ/δ, p53δ/Δoch p53Δ/δ PTENδ/δ organoider som injiceras subkutant i flanken av isogena C57/Bl6 möss. Endast p53δ /δ PTENδ/δ organoider uppvisade tillväxt. Totalt 1 x 106 celler injicerades. Tre oberoende kurvor av p53δ/δ PTENδ/δ organoider visar sig vara heterogena i tillväxtens hastighet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bedömning av den farmakologiska reaktionen av organoider härledda humana prostatacancer biopsier. A) relativ cellproliferation av patient-härledda MSKPCA2 och MSKPCA2 organoider (y-axel, medelvärde ± SD, mätt med cell genomförbarhet assay Kit) av 5 000 celler 7 dagar efter etableringen av organoider (n = 4, * p < 0,05, t-test) med 1 Nm DHT eller 10 μm andra generationens anti-androgen som anges. (B) representativa brightfield bilder av MSKPCA2 och MSKPCA3 organoider kulturer som behandlats med 1 Nm DHT eller 10 μm andra generationens anti-androgen som anges. (C) Western blot-analys av ar, FKBP5 (ar-målgen), CK8 och CK18 (Luminal markörer), CK5 (basal markör), och Vimentin (mesenkymala markör) i MSKPCA2 och MSKPCA3 organoider. GAPDH användes som lastkontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Organoid sådd verkningsgrad (%) | Cell-seedning nummer (per Dome) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
Tabell 1: cell sådd nummer används för att bedöma farmakologiska svar baserat på Organoid formation kapacitet. Tabell för kolumn (vänster till höger) inkluderar Organoid formation kapacitet intervall och motsvarande antal celler till utsäde per Matrix Dome.
| Totalt cell nummer | PBS0 + Y-27632 | Matrigel volym | cell koncentration/injektion |
| 5 x 106 | 500 μl | 500 μl | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1,5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 μl | 500 μl | 2 x 106 |
Tabell 2: rekommenderade cell nummer för experiment med Organoid xenograftering. Kolumner från vänster till höger inkluderar absoluta totala antalet celler för 10 injektioner, total volym PBS + Y-27632 för 10 injektioner, basalmembran Matrix volym, och cell nummer per injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förstå de molekylära mekanismerna bakom anti-androgen resistens och upptäcka potentiella terapeutiska sårbarheter kräver testning av farmakologiska svar i modellsystem imitera prostatacancer. Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för tillförlitlig analys av farmakologiska svar i patient-derived och genetiskt modifierade prostata organoider och beredning av dessa Organoid prover för nedströms applikationer.
Det finns två kritiska steg i det här protokollet. Den första är att bestämma sådd effektivitet och tillväxttakten av organoider. Organoid tillväxthastighet varierar kraftigt. Detta är beroende av arter, som murina härledda organoider växa ungefär två gånger snabbare än human-härledda organoider. Förutom arter är tillväxthastigheten beroende av genotyp och fenotyp. Men när sådd effektivitet och tillväxthastighet bestäms, kan detta protokoll anpassas till alla typer prostata Organoid.
Det andra kritiska steget är att arbeta med den protein-Matrix-baserade 3D-kulturen för att förbereda för efterföljande nedströms applikationer. Införandet av sådd variation av viskositet i basalmembranet matrisen under plätering kan undvikas genom att använda utspädd (70%) basalmembran matris, enligt beskrivningen. Korrekt att bryta upp polymeriserad matris utan alltför störande organoider beskrivs också i detalj. Detta protokoll möjliggör störningar av matrisen utan att införa variation i Organoid avläsning, som kan anpassas för screening av läkemedelsbibliotek för olika genetiska bakgrunder i PCa. Dessutom, genom att utföra CRISPR/Cas9-eller shRNA-baserade uttryck störning, gener som ger resistens mot läkemedel kan efterfrågas.
En punkt av hänsyn är att mediet sammansättningen av prostata Organoid kultur kan påverka den farmakologiska reaktionen. Till exempel, EGF, en del av både murin och Human prostata Organoid kultur, kraftigt minskar känsligheten för anti-androgen. Därför är EGF utelämnas i detta protokoll från mediet, och känslighet för anti-androgen återställs. Det rekommenderas att avgöra om någon Organoid ingredienser påverka känsligheten för läkemedlet som testas. Detta gäller särskilt för den komplexa mänskliga prostatan Organoid kultur medium, som (bortsett från EGF, noggin, R-spondin1, DHT, och A83-001 [sammansättningen av murina Organoid medium]) innehåller fibroblast tillväxtfaktor 10 (FGF10), FGF2, prostaglandin E2, nikotinamid och p38i-hämmaren SB202190.
Den Organoid medium sammansättning gynnar tillväxten av godartad prostata epitel över cancervävnad, alltså inga primära hormon känsliga PCa Organoid linjer har fastställts. För närvarande är alla humana PCa organoider härrör från patienter med avancerad metastaserande anti-androgen resistenta PCa; Därför, de flesta av dessa linjer är anti-androgen resistenta och lämpar sig för att identifiera nya behandlingar. Som proof-of-Concept, delta-liknande 3 (DLL3) har identifierats som ett terapeutiskt mål med hjälp av patient-härledda NEPC organoider som är targetable med rovalpituzumab tesirine13. Denna metod är lämplig för dessa typer av experiment och är också lämplig för prostata organoider från normal godartad vävnad, primär prostatacancer, och CTCs.
En brist på prostata Organoid kultur är avsaknaden av en cellulär nisch. Således, bidrag till läkemedelsresistens av icke-tumörceller inte kan studeras med hjälp av den nuvarande plattformen. Men, Co-kulturer av kolorektal cancer och lungcancer organoider med autologa T-celler har nyligen etablerats, möjliggör studier av interaktioner mellan tumören och immunförsvaret14. Andra samkultursystem kan inrättas för att ytterligare studera icke-cell-autonoma interaktioner.
Sammanfattningsvis ger denna rapport ett detaljerat protokoll för reproducerbar bedömning av farmakologiska reaktioner i prostata organoider och efterföljande tillämpningar nedströms. Viktigt är detta protokoll i stort sett tillämplig och kan användas för Organoid kulturer av andra organ, inklusive tjocktarmen15, tunntarmen16 , mage17,18, lever19, bukspottkörtel20, njure21, och bröstkörteln22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C. L. S tjänstgör i styrelsen för Novartis; är en medgrundare av ORIC läkemedel och i av enzalutamid och apalutamid; är en vetenskapsrådgivare till Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra och PMV; och är en medgrundare av seragon, köpt av Genentech/Roche i 2014. W.R.K. är en i och patentinnehavare av Organoid teknik.
Acknowledgments
K.P. stöds av NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. stöds av HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; och Starr cancer Consortium. W.R.K. stöds av Dutch cancer Foundation/KWF buit 2015-7545 och prostatacancer stiftelsen PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
