Summary
Vi leverer en protokol til isolering af microglia fra forskellige dissekted regioner af en voksen mus hjerne halvkugle, efterfulgt af semi-automatiseret bibliotek forberedelse til dyb single-celle RNA sekvensering af fuld længde transkriptomer. Denne metode vil bidrage til at belyse funktionelle heterogenitet mikroglia i sundhed og sygdom.
Abstract
Som hjemmehørende makrofager i centralnervesystemet, microglia aktivt kontrollere hjernens udvikling og homøostase, og deres dysfunktioner kan drive sygdomme hos mennesker. Der er gjort betydelige fremskridt for at afdække de molekylære signaturer af homeostatisk mikroglia samt ændringer af deres genekspression som reaktion på miljømæssige stimuli. Med fremkomsten og modning af enkelt-celle genomiske metoder, er det i stigende grad erkendes, at heterogene mikroglia kan ligge til grund for de forskellige roller, de spiller i forskellige udviklingsmæssige og patologiske forhold. Yderligere dissektion af sådanne heterogenitet kan opnås ved effektiv isolering af mikroglia fra en given region af interesse, efterfulgt af følsom profilering af individuelle celler. Her giver vi en detaljeret protokol til hurtig isolering af microglia fra forskellige hjerneområder i en enkelt voksen mus hjerne halvkugle. Vi demonstrerer også, hvordan man bruger disse sorterede mikroglia til plade baseret dyb enkelt celle-RNA-sekvensering. Vi diskuterer tilpasningsevnen af denne metode til andre scenarier og giver retningslinjer for at forbedre systemet til at rumme store undersøgelser.
Introduction
Microglia, der repræsenterer 5% − 10% af alle neurale celler, er residente makrofager spredt over hele centralnervesystemet (CNS)1. Beskyttet bag blod-hjerne barrieren, typisk microglia i en sund voksen hjerne indeholder mange fine processer, der hurtigt udvide og trække sig tilbage for at interagere med neuroner og andre gliale celler i parentchyma. Microglia kan også vedtage amoeboid morfologi forbundet med øget Fagocytisk funktion i specifikke udviklingsmæssige stadier eller på immun udfordringer i skade og sygdom1,2,3,4. Nylige spændende opdagelser har klart vist, at microglia er på ingen måde passive tilskuere til hjerne-afledte eller patologiske signaler, men spiller centrale roller i at kontrollere hjernens udvikling og homøostase, for eksempel ved at støtte neuronal overlevelse, beskæring umodne synapser, fremme oligodendrocyte Lineage celler differentiering samt angiogenese1. Som flere funktioner i microglia er belyst, spændingen er yderligere næret af humangenetik undersøgelser, som viste, at mange neurodegenerative sygdomme risiko gener, såsom TREM2, overvejende eller udelukkende udtrykkes ved microglia5,6,7. I betragtning af deres betydning i udvikling og plausible sygdom-kørsel roller, enorm indsats er for nylig blevet sat i retning af vores forståelse af mikroglial gen regulering og funktion i håb om at finde nye terapeutiske mål for Neurodegenerative sygdomme 1,8.
RNA-sekvensering (RNA-SEQ) giver mulighed for objektiv karakterisering af celletype-specifik genekspression, som igen guider forskerne til at undersøge genfunktioner i tætte cellulære netværk7. RNA-SEQ var for det meste udført på bulkprøver, hvilket førte til opdagelsen af en homeostatisk mikroglial gensignatur, der adskiller dem fra andre neurale og immunceller9. Men, en sådan tilgang kunne overse molekylære og funktionelle forskelle mellem microglia, især dem, der forbigående i udvikling, eller forbundet med aldring og sygdom. Enkelt celle-RNA (scrna-SEQ) tilbyder den følsomhed og opløsning, der har revolutioneret feltet ved at afsløre tidligere undervurderet heterogenitet af microglia i en række forskellige sammenhænge2,3,10. På grund af tilstedeværelsen af andre lignende immunceller i CNS-cirkulations interfacet giver scRNA-SEQ oplysninger, der er med til at designe nye værktøjer til at adskille og funktionelt dissekere disse relaterede celler med lidt forudgående viden2,11.
En bred vifte af scRNA-SEQ platforme er blevet opfundet, hver egnet til visse anvendelser12. Generelt, dråbe baserede metoder, såsom 10x Genomics, er højere i gennemløb med (titusinder) af celler sekvenserede i hvert løb, og de er mindre selektive for input, som kan indeholde blandede cellepopulationer, der kræver bred kategorisering. Plade baserede metoder giver højere følsomhed og læse dybde13,14, som regel rettet mod bestemte populationer fra celle sortering for at afsløre subtile forskelle eller sjældne udskrifter. I betragtning af den lille procentdel af mikrogliale celler, især de udviklings-eller sygdomsrelaterede delpopulationer, blandt alle CNS-celletyper, er det ofte ønskeligt at isolere mikroglia fra en bestemt region af interesse og opnå dybe og fuld længde transkriptomic oplysninger for at forstå deres heterogenitet.
Her giver vi oplysninger om, hvordan man isolerer mikroglia fra forskellige mus-hjerneområder, der er dissekeret fra en enkelt halvkugle, som bruges til enkelt celle-RNA-SEQ efter en halvautomatiseret plade baseret forberedelsesprocedure. Den anden halvkugle kan derefter anvendes til histologisk validering. Strømlinet fra en tidligere offentliggjort metode9, denne isolation protokol har til formål at maksimere udbyttet fra små mængde af råvarer, og i mellemtiden opretholde endogene microglial Gen ekspression profiler. Vi bruger fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) til at berige microglia (eller andre relaterede immunceller af interesse) i 96-brønd plader og miniaturize mængderne af reagenser til Biblioteks forberedelse for at øge gennemløb. Vi fremhæver denne følsomme scRNA-SEQ-platform, selv om der kan anvendes andre plade baserede strategier. Denne metode kan let tilpasses til at isolere mikroglia fra andre dissekeret væv, såsom skade eller sygdom Foci, og alder af musen kan variere på tværs af næsten alle postnatale stadier. En effektiv isolering af det regionale mikroglia til undersøgelser af enkelt cellet transkriptomik vil gøre det lettere at forstå deres funktioner inden for sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer gnavere, er udformet til Stanford University retningslinjer, som er i overensstemmelse med nationale og stats love og politikker. Alle dyreforsøg blev godkendt af Stanford universitetets administrative panel om laboratorie pleje af dyr.
Bemærk: Alle løsninger og buffer kompositioner er angivet i tabel over materialer.
1. forberedelse på dagen for celle isolering
- Forbered følgende reagenser og chill dem på is: medium A (50 mL), magnetisk-aktiveret celle sortering (MCS) buffer (30 mL), FACS buffer (25 mL), fosfat-bufferet saltvand (PBS; 30 mL), DNase (320 μL), og RNase hæmmer (30 μL).
Bemærk: De mængder, der er angivet her, er tilstrækkelige til at isolere mikroglia fra 4 hjerneområder (f. eks. cortex, cerebellum, hippocampus og striatum) af en enkelt musehjerne halvkugle. Opskalere, hvis der anvendes flere væv. - Placer fire rene 2 mL Dounce-homogenisatorer på is, og tilsæt 2 mL medium A med 80 μL DNase (12.500 enheder/mL) og 5 μL Rnasehæmmer i hver Dounce-homogenizer. Chill stemerne i 15 mL rør.
- Mærk fire 6 cm Petri skåle med hjerneområder til vævs opsamling og tilsæt 200 μL kold medium A til hver skål på is. Tilsæt ca. 5 mL medium A til en 6 cm Petri skål til dissektion.
Bemærk: Før brug skal du sørge for, at alle reagenser er sterile og velegnede til RNA-applikationer. Bænk og dissektion værktøjer skal være rene og sprøjtes med RNase dekontaminering løsning (tabel over materialer).
2. hjerne region dissektion
Bemærk: Dette trin skal tage ~ 30 min.
- Der indsprøjtes 400 − 500 μl ketamin/xylazin (24 mg/ml ketamin og 2,4 mg/ml xylazin) i bughinden af en ung til voksen scene mus (> 1 måned gammel).
Bemærk: En mandlig mus bruges her til illustration, men enten køn er egnet. - Vent i 5 minutter og Knib en bagpote for at sikre manglende tilbagetrækning.
- Brug straks en 26 G x 3/8 nål til at udføre transcardial perfusion med 20 − 30 mL iskold PBS, indtil bufferen løber ud uden synligt blod.
- Decapitate musen med et par kirurgisk saks. Brug lille saks til at skære åbne huden for at udsætte under kraniet, og derefter skåret gennem sagittale sutur, lambdoidal sutur og koronal sutur. Brug pincet til at trække begge sider af parietal knogle og interparietalknoglen knogle uden at beskadige vævet, og forsigtigt flytte hjernen ind i dissektion Petri skålen med medium A.
- Brug en pre-kølet klinge til at skære hjernen gennem midterlinjen i to halvkugler.
Bemærk: De fire hjerneområder, der er beskrevet her fra en enkelt halvkugle, giver et tilstrækkeligt antal mikroglia til enkelt celle-eller bulk-RNA-SEQ-applikationer. Den anden halvkugle kan anvendes til immun histokemi eller RNA in situ-validering. - Adskil cerebellum fra den kortikale lap og hjernestammen med #55 pincet og Overfør vævet til en samling Petri skål.
- Brug #55 pincet til omhyggeligt at dissekere hippocampus og striatum fra cortex og overføre hvert væv til en samling Petri skål.
3. mekanisk vævs dissociation
Bemærk: Hold celler og reagenser kølige hele tiden undtagen under farvning trin. Dette trin skal tage ~ 30 min.
- Hak hver hjernevæv med en barberkniv i < 1 mm3 fine stykker.
- Brug 1 mL pipette (med spidser afskåret) til at overføre Vævsstykker til de præ-afkølede Dounce-homogenisatorer, der hver indeholder 2 mL medium A med DNase-og Rnasehæmmer.
- Homogeniser vævet ved langsomt at vride stemplet ind og ud af Dounce-homogenisator for 6 − 10 fulde strøg, indtil der ikke er synlige bidder til stede.
Bemærk: Douncing dræber neuroner og de fleste andre gliale celler, men forlader mikrogliale celler temmelig intakt. Både utilstrækkelig og over-douncing kan føre til lavt udbytte af celler. - Dissocieret væv overføres til 50 mL rør gennem 70 μm-strainere.
- Skyl hver Dounce-homogenisator og stempel med i alt 6 mL kold medium A og Filtrer skyllevæsken gennem samme filter i det tilsvarende rør.
- Enkelt celle suspensioner (ca. 8 mL hver) overføres til 15 mL koniske rør og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °c med bremse = 5.
4. fjernelse af myelin
Bemærk: Dette trin skal tage ~ 60 min.
- Forbered 1 stor udtynding (LD) kolonne (for Cortex) og 3 store udvalg (LS) kolonner (for de andre 3 regioner) i en magnetisk separator (tabel over materialer). Skyl hver søjle med 3 mL MCS buffer.
- Når centrifugering er færdig, pipetten ud og kassér supernatanten uden at forstyrre pellet. For cortex og cerebellum væv, resuspension celler i 850 μL MCS buffer med 1,8 μL Rnasehæmmer. For hippocampus og striatum væv, resuspension celler i 400 μL MCS buffer med 0,9 μL Rnasehæmmer.
Bemærk: Kolonnerne (LD vs. ls) og den mængde, der anvendes til opblanding er optimeret baseret på mængden af myelin til stede i vævet. Hvis andre hjerneområder er analyseret, kan det være nødvendigt at justere disse tilstande afhængigt af størrelsen af vævet, og hvor meget myelin der kan eksistere. Effektiviteten af myelin fjernelse kan estimeres i trin 4,9. - Tilsæt 100 μL myelin fjernelse perler hver i cellerne fra cortex og cerebellum og tilsæt 50 μL af myelin fjernelse perler hver i celler fra hippocampus og striatum.
- Bland forsigtigt cellerne med perler og Inkuber rørene på is i 10 minutter.
- Bring mængden af røret med kortikale celler til 2 mL med MCS buffer, og alle andre til 1 mL (dvs. tilsættes 1 mL for kortikale celler; 500 μL for hippocampus og striatal celler; ingen grund til at tilføje buffer til cerebellare celler).
- Når kolonnerne er tømt for skylle buffer, placeres et 15 mL rør under hver kolonne. De kortikale celler (2 mL) belastes på LD-søjlen og alle andre (1 mL hver) på LS-kolonnerne. Brug straks 1 mL MCS-buffer til at vaske de originale rør og indlæse opløsningen på de tilsvarende kolonner.
- LD-søjlen vaskes én gang med 1 mL MCS-buffer, og hver LS-kolonne vaskes to gange med 1 mL MCS-buffer hver vask. Fortsæt med at indsamle gennemstrømnings opløsningen under vask.
- Filtrer cellerne ind i runde bund FACS rør gennem 35 μm si caps.
Bemærk: Hvert rør skal samle omkring 4 mL enkelt cellesuspension depleteret af myelin. - Du kan eventuelt tage 10 μL af cellesuspensionen og blande den med 10 μL 0,4% trypan og et blå opløsning. Undersøg cellerne under et 10x lyse felt mikroskop for at estimere udbyttet, overlevelsesraten og niveauet af rest myelin.
Bemærk: En vellykket forberedelse bør generere over 90% levende celler (runde i form og udelukke den blå farvestof) med lidt at ingen myelin snavs. - Pellet celler i FACS rør ved 400 x g i 5 min ved 4 °c, med bremse = 5. Hæld langsomt supernatanten ud og dup kanten af røret på silkepapir. Resuspender cellerne i hvert rør med 300 μL FACS buffer.
Bemærk: Hvis MCS sortering foretrækkes, kan CD11b perler bruges til at vælge microglia og andre myeloide celler efter myelin fjernelse. Disse celler kan derefter anvendes til ikke-plade-baserede scRNA-SEQ samt bulk RNA-SEQ. Den forbehold af denne alternative fremgangsmåde er, at CD11b perler ikke adskille microglia fra andre relaterede immunceller, som også er positive for dette antigen.
5. farvning for fluorescens-aktiveret celle sortering
Bemærk: Dette trin skal tage ~ 40 min.
- Tilsæt 5 μL mus FC-receptorer blok reagens (tabel over materialer) i hvert rør. Inkuber i 5 min på is.
- Tilsæt 1 μL CD45-PE-Cy7 og 1 μL CD11b-BV421 i hvert rør.
Bemærk: Antistoffer med andre konjugeret fluorophorer kan anvendes. Antistoffer mod TMEM119, en specifik markør for homeostatiske microglia9, kan også inkluderes, men det anbefales at blive brugt sammen med CD45 og CD11b, fordi visse microglia subpopulationer kan miste TMEM119 overflade udtryk. - Inkubér rørene på en shaker i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Tilsæt 2 mL FACS-buffer til vask.
- Pellet celler ved 4 °C, 400 x g i 5 min. langsomt hælde supernatanten og dup kanten af røret på silkepapir. Resuspension af cellerne i hvert rør med 400 μL af FACS-buffer med 1 μL Rnasehæmmer og 0,5 μL propidium Iodid (PI, 1:1.000 fortynding).
6. sortering af indeks FACER
Bemærk: Dette trin bør tage ~ 1 h.
- Efter standard FACS procedure, trække porte baseret på scatter (undtagen snavs), enkeltceller, levende celler (PI negativ), microglia og myeloid celler (CD45+, CD11b+).
Bemærk: Typiske mikrogliale celler udtrykker CD45 på lavere niveauer sammenlignet med andre grænse-associerede makrofager, såsom perivaskulære og meningeal makrofager, og derfor gating på CD45 lav CD11b+ bør være tilstrækkelig, hvis fokus for forskningen er genekspression profiler i disse klassiske microglia1,2. Visse undergrupper af microglia kan dog have et højere CD45 udtryk, og dette gælder især under udvikling eller i sygdomstilstande. For at sikre objektiv analyse af mikroglial genekspression kan CD45 høje og CD45 lave immunophenotyper registreres gennem indeks sorteringsindstilling og begge populationer indsamlet til sekvensering og downstream-analyse. Desuden kan TMEM119 overflade ekspression anvendes til at målrette den homeostatiske mikrogliale population (Se trin 5,2) og analyseres sammen med CD45 niveauer og sekvensering resultater. - Sorter enkelt mikroglia (med en 100 μm dyse) i 96-brønden polymerasekæde reaktion (PCR), der indeholder 4 μL lysis-buffer hver brønd (se den offentliggjorte protokol14 for detaljer).
Bemærk: Det eksterne RNA-kontrol konsortium (ERCC) RNA Spike-in mix (tabel over materialer) kan tilføjes på 1:2.4 x 107 i lysis buffer til kvalitetskontrol og normalisering formål2. - Vortex kort pladerne og drej ned med en bænk-top centrifuge.
- Straks fryse prøverne på tøris. Pladerne opbevares ved-80 °C indtil klargøring af biblioteket.
Bemærk: Alternativt kan flere celler opsamles i 1,5 mL rør med RNA-ekstraktions buffer til bulk-RNA-SEQ. Ifølge forfatterne ' erfaring, 3.000 celler er tilstrækkelige til at generere god kvalitet biblioteker efter den offentliggjorte protokol2,14.
7. forberedelse af et enkelt celle-RNA-sekvente Rings bibliotek
Bemærk: Her følges den offentliggjorte protokol14 for at generere scrna-SEQ biblioteker ved hjælp af flydende håndtering robotteknologi og et par ændringer. I denne artikel beskrives proceduren kun kortvarigt, og forskellene fremhæves. Behandling af 4 plader tager samtidig omkring 2,5 dage.
- Tø plader på is og udføre reverse transskription med oligo-dT30VN primer (i lysis buffer) til at generere cDNA med termiske cyklist (tabel 1): 42 °c 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C i hold. Derefter forstærkes cDNA med et ekstra exonuklease-fordøjelses trin i begyndelsen (tabel 2) ved hjælp af PCR Master Mix og in situ PCR (ispcr) primere (tabel over materialer) og følgende pcr-betingelse: 37 °c 30 min; 95 °C 3 min; 23 cyklusser af 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 min.
- Rense cDNA ved hjælp af 18 μL magnetiske perler per brønd (0,7:1 ratio). Pladen påsættes på en magnetisk stander i 5 minutter, og prøverne vaskes to gange med frisklavet 80% ethanol, 80 μL pr. brønd hver gang. Efter tørring af pladen i 15-20 min. elueret cDNA med 20 μL elelueringsbuffer pr. brønd.
Bemærk: For kvalitetskontrol, brug en fragment analysator (høj følsomhed næste generations sekvensering [NGS] fragment analyse, 1 − 6000 BP) til at kontrollere størrelsesfordelinger og koncentrationer af cDNA, og kun yderligere proces prøver med en smøre mellem 500 − 5000 BP, og højere end 0,05 ng/μl. - For at generere biblioteker blandes 0,4 μL af hver cDNA-prøve med 1,2 μL Tn5 tagmenterings reagenser fra Biblioteks forberedelses sættet (tabel over materialer) i en 384-brønd plade ved hjælp af en nanoliter pipette Rings maskine ved 55 °c 10 min.
Bemærk: Her tilsættes 1/12,5 af den foreslåede reaktions volumen (5 μL prøve og 15 μL tagmenterings reagenser) for at reducere omkostningerne og i mellemtiden øge gennemløb. En nanoliter pipette Rings maskine (tabel over materialer) bruges til at overføre reagenser (dette og følgende trin) fra og til 384-brønd plader. - Tilsæt 0,4 μL neutraliserings buffer for at standse tagmenterings reaktionen ved RT i 5 min.
- Tilføj 384 indekser (tabel over materialer, 0,4 μl fremad og 0,4 μl omvendt), 1,2 μl PCR mix til prøver (2 μl hver), og amplificere bibliotekerne ved hjælp af følgende betingelse: 72 °c 3 min; 95 °C 30 s; 10 cyklusser af 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min.
- Saml alle individuelle biblioteker (Tag 1 μL hver) fra den samme 384-brønd plade sammen, og brug magnetiske perler (tabel over materialer, 0,7:1 ratio) til at rense de endelige poolede biblioteker.
- Brug et fluorometer (tabel over materialer) til at måle koncentrationerne og en bioanalysator (tabel over materialer) til at undersøge størrelsesfordelinger af poolet biblioteker før sekvensering. Målret sekvens dybden ved 1.000.000 RAW-læsninger pr. celle.
- Følg standard bioinformatiske procedurer for at filtrere og trimme sekvensering læser og udføre justering2. Brug optællings tabellen og metadata som input til at udføre klynge analyse med Seurat-pakken15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver en metode til at isolere og sortere mikroglia fra forskellige hjerneområder i en voksen perfbrugt hjerne halvkugle, efterfulgt af scRNA-SEQ. Vi bruger douncing til at skabe enkelt cellesuspension og også som et første skridt til at berige microglia. Utilstrækkelig eller over-douncing reducerer udbyttet. Derudover indeholder voksne musehjerner høje niveauer af myelin, som også kan reducere sorteringseffektivitet og udbytte, hvis det ikke fjernes korrekt. Derfor undersøger vi cellesuspensionen under mikroskopet ved at bruge trypan og et Blue og et hemocytometer til at estimere udbyttet, celle levedygtigheden og effekten af myelin fjernelse (trin 4,9), før du udfører antistof farvning (figur 1). Samlede celletal på dette tidspunkt bør være over 30.000 for cortex, og over 5.000 for andre væv. Over 90% af cellerne bør være levedygtige med lidt myelin snavs.
Vi bruger en FACS maskine til at sortere microglia (eller myeloide celler), som typisk er CD45 lav og CD11b positiv. I det mindste for det kortikale væv, vellykket isolation bør generere over 80% microglia ud af alle levende enkeltceller (figur 2). Den døende/døde befolkning udgør kun en lille del af præparatet (ca. 10%).
Når individuelle mikroglia er fanget i lysis buffer, er RNA frigivet og derefter omvendt transskriberet til cDNA, som derefter forstærkes i 23 cyklusser. Det er vigtigt at kontrollere kvaliteten af disse cDNA-prøver-i det mindste en del af dem-før du laver biblioteker. Som en kapillar elektroforese platform, fragment analysator og høj-følsomme NGS fragment kits (1 − 6000 BP) giver hurtig og præcis information om størrelsesfordeling samt mængden af cDNA-molekyler til stede i hver brønd af en 96-brønd plade (figur 3a). Prøver, der viser en smøre (500 − 5000 BP) og over en bestemt koncentrations tærskel (f. eks. 0,05 ng/μl), kan bruges til at lave biblioteker. På samme måde skal de poolede biblioteker testes på en bioanalysator før sekvensering (figur 3B).
Vi sekvenserer prøverne til en dybde på over 1.000.000 rå læsninger pr. celle, som mættede detektionskraften i denne scRNA-SEQ-metode16. Med ca. 60% kortlægnings hastighed kan der påvises over 2.000 gener pr. mikroglial celle. Vi fik offentliggjorte data, der blev genereret ved hjælp af denne isolationsmetode17, og demonstrere dens reproducerbarhed fra uafhængige eksperimenter og følsomhed til påvisning af microglia-specifikke gener på tværs af den sekvenserede population (figur 4).
Figur 1: vurdering af microglia-isolations udbytte, cellens levedygtighed og effektiviteten af fjernelse af myelin. Det venstre panel viste det lyse felt billede (4X forstørrelse) af trypan og et blå farvede celler (fra cortex) efter at have passeret gennem myelin fjernelse kolonner. Resultater for andre regioner ville se ens ud, men med færre celler. Langt de fleste (hvis ikke alle) af celler syntes lyse (ikke-plettet) og runde på grund af tab af processer. Det rigtige billede var zoom-in (20x) af det boxed område og lidt myelin vragrester var til stede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Gates bruges til sortering af microglia. Data viste gating strategi for sortering af mikroglia fra cortex, og den samme strategi blev anvendt til andre regioner. Cellerester blev først udelukket fra scatter plot, og enkeltceller blev gated af Forward scatter-område (FSC-A)/Forward scatter-bredde (FSC-W). Levende celler blev gated af PI negativ farvning, som var fra omkring 90% af alle enkeltceller. Microglia, der repræsenterer ca. 80% af levende celler, blev sorteret fra CD45 Low CD11b + Gate. I alt ~ 30.000 microglia kunne isoleres og sorteres fra cortex væv (fra en halvkugle af en 3-måneders gammel mus). Indeks sortering blev udført på en FACS-maskine. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative Kvalitetskontrolresultater for forstærket cDNA fra en enkelt mikroglial celle og et eventuelt poolet bibliotek. (A) ved hjælp af en fragment analysator afbildes alle fragmenter med deres størrelse på X-aksen og relativ fluorescens intensitet på Y-aksen, hvilket betyder overflod af en given størrelse cDNA. LM (nedre markør, 1 BP) og UM (øvre markør, 6.000 BP) indlæser markører med kendte koncentrationer, der anvendes til måling af cDNA-mængde. Med succes forstærket cDNA fra en repræsentativ mikroglial celle danner en kurve (grøn punkteret linje) på størrelses fordelings grafen eller en smøre (mærket parentes) på gel grafen mellem 500 BP og 5.000 BP. Andre mærkede toppe blev forstærket fra ERCC Spike-in molekyler eller ribosomale RNA. Koncentrationen af cDNA mellem 500 BP og 5.000 BP kan kvantificeres, og de prøver med koncentrationer, der er højere end 0,05 ng/μL, og som viser sådanne typiske kurver, bevares til Biblioteks forberedelse. RFU, relativ fluorescens enhed. B) repræsentativt kvalitetskontrol resultat på en bioanalysator, der viser størrelsesfordelingen af et endeligt poolet bibliotek (med ca. 380 celler). Typisk, det spænder fra 200 BP til 2.000 BP med en gennemsnitlig størrelse på 400 − 600 BP. De to skarpe toppe var lastning markører. FU, fluorescens enhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: scRNA-SEQ-analyse af microglia isoleret fra 4 hjerneområder af to hanmus. (A) tsne plot, der viser sammenblandet mønster af regionale mikroglia (kun celler fra mus #1 blev fremhævet). De udgør ikke særskilte klynger i henhold til regionens oprindelse ud over subtile Skift til koncentrerede områder på tSNE plot (muligvis på grund af batch effekter). Denne observation er i overensstemmelse med begrænset regional heterogenitet af microglia baseret på globalt Gen ekspression hos voksne mus (se en nylig publikation2 for yderligere drøftelse om dette emne). B) tsne plot, der viser overlappende mønster af microglia fra to individuelle mus, som blev behandlet uafhængigt. Selv om små batch effekter kan eksistere (celler, der koncentrerer sig i visse områder af plottet), danner disse celler ikke særskilte klynger efter dyrenes oprindelse. Dette resultat antyder, at protokollen er reproducerbar for sammenligning af data mellem eksperimenter. (C) ekspression af microglia signatur gener opdaget af scrna-SEQ viser over 95% opdagelse sats for specifikke markører, såsom Tmem119 og P2ry12, og over 80% opdagelse sats for kendte transkriptionsfaktorer såsom Sall1 og pu. 1. Dataene blev analyseret igen fra publiceret litteratur17. (D) stort flertal af isolerede microglia mangler udtryk for gener specifikke for andre celletyper, såsom Tubb3 (neuroner), Aldh1l1 (astrocytter), Gjb1 (oligodendrocytter), og Tie1 (endotelceller). E) ekspression af gener relateret mikroglial aktivering eller stress. Klassiske markører, TNF, Il1b, Nos2og Nfkb2, som er svagt udtrykte, vises på toppen. Tidlige respons gener, Egr1 og FOS, vises nederst (Se diskussionen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Volumen (μL) |
| Cellelyse | 4 |
| Revers transkriptase (100 U/μL) | 0,95 |
| RNase-hæmmer | 0,25 |
| 5x første strand buffer | 2 |
| Dithiothreitol (DTT; 100 mM) | 0,5 |
| Betaine (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0,06 |
| Skabelon switch oligo (TSO; 100 μM) | 0,1 |
| H2O | 0,14 |
| Samlede | 10 |
Tabel 1: omvendt transkriptionstilstand. Reagens volumener til en revers transkriptionsreaktion er tilvejebragt.
| Reagens | Volumen (μL) |
| Reverse transkriptionsprodukt | 10 |
| 2x PCR Master Mix | 12,5 |
| ISPCR primer (10 μM) | 0,25 |
| Lambda exonuclease | 0,1125 |
| H2O | 2,1375 |
| Samlede | 25 |
Tabel 2: betingelse for PCR-amplifikation. Reagens volumener til en PCR-amplifikation af cDNA fra en enkelt celle er tilvejebragt.
| Plade baseret (denne protokol) | Dråbe baseret (10x Genomics) | |
| Følsomhed | Flere gener opdaget | Færre gener detekteret |
| Fuld længde | Ja | Nej (5 ' eller 3 ' ende) |
| Fleksibilitet for cellenumre/populationer | Egnet til karakterisering af små eller sjældne delpopulationer | Velegnet til bred kategorisering af store cellepopulationer |
| Overførselshastighed | Op til flere tusinde celler | Hundredvis til titusinder af celler |
| Unik Molekylær identifikator | Nej | Ja |
| Omkostning pr. celle | $1-$ 5 | mindre end $1 |
| Eksperimentel sværhedsgrad | Flere trin og kræver normalt væske håndteringsrobot teknologi | Enkel at udføre med kommercialiserede maskiner |
| Cellepopulationer | Målrettet af FACS sortering | Uvildige |
Tabel 3: sammenligning mellem plade baserede og droplet baserede scRNA-SEQ-metoder. I denne artikel leveres den plade baserede fuld længde scRNA-SEQ-procedure, som har fordelene ved højere følsomhed, fuld længde sekvensering og fleksibilitet for små antal celler som input. Droplet-baserede metoder giver fordelene ved højere gennemløb, lavere omkostninger, let at udføre og data i unikke molekylære identifikatorer. De supplerer hinanden afhængigt af formålet med forsøgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia interagerer aktivt med andre celletyper i CNS, og de er meget følsomme over for miljømæssige stimuli. For at minimere inflammatoriske reaktioner og afvigende ændringer i deres genekspression under isolations processen, er denne protokol blevet strømlinet fra en tidligere offentliggjort metode9, og det er nu egnet til at isolere microglia fra flere regioner af en enkelt mus hjerne halvkugle parallelt. Væv og reagenser holdes ved kold temperatur, og eksperimenter udføres rettidigt (ca. 3,5 h fra dissektion til sortering) med færre skylninger og færre reagenser baseret på begrænsede vævs størrelser. Vi vælger douncing over andre homogenisering metoder, såsom enzymatisk fordøjelse, fordi mekanisk dissociation kan dræbe og dermed fjerne neuroner og andre gliale celler, mens forårsager lidt skade eller aktivering til microglia9,18. Over-douncing, dog, kan reducere udbyttet af microglia og bør undgås. Det har tidligere vist sig, at mekanisk dissociation og perler-baseret myelin fjernelse efterfulgt af FACS sortering indføre mindre aktivering til microglia, baseret på minimal ekspression af klassiske inflammatoriske gener, f. eks, TNF, Il1b, Nos2, og Nfkb29 (figur 4e). Ikke desto mindre kunne microglia stadig reagere på ex vivo-betingelserne under dissociation og sortering ved upregulating af tidlige reaktions gener såsom FOS og Egr1 (figur 4E), som normalt ikke udtrykkes af microglia in vivo2,19, og sådanne ændringer fra transcriptomic-undersøgelser bør altid valideres på histologi sektioner.
Her giver vi procedurer for isolering af microglia fra cortex, cerebellum, hippocampus og striatum fra en voksen musehjerne halvkugle, og denne protokol kan let tilpasses til andre regioner eller stadier. Dette er nyttigt for situationer, for eksempel, når sygdomsramte mikroglia er begrænset til visse områder af hjernen, som kan dissekere ud, eller i aging undersøgelser, hvor pooling prøver er uhensigtsmæssig på grund af betydelige individuelle variationer. Med tilgængeligheden af antistoffer mod mikrogliale (eller pan medfødte immune) epitoper kan denne protokol også tilpasses til isolering af microglia i rotte-eller humane væv9. Ved justering for større eller ældre væv, er det vigtigt at overveje og teste mængden af myelin-fjernelse perler og typen af kolonner, der anvendes. En alternativ metode til fjernelse af myelin er ved tæthed gradient centrifugering i kommerciel lav-viskositet Media20. Samlet set er disse to metoder sammenlignelige i deres effektivitet, selv om tætheden gradient Centrifugerings metoden kan give lidt højere udbytter, og på den anden side, den magnetiske perler metode er mindre tilbøjelige til at introducere endotoksiner, som kan aktivere microglia21,22.
På grund af den lille procentdel af mikroglia blandt totale hjerneceller, er det ofte vigtigt at berige eller rense microglia før du udfører enkelt celle transkriptomic undersøgelser. Vi bruger FACS som en følsom tilgang til at fange svagt repræsenterede celletyper, og vælg microglia baseret på CD11b og CD45 Surface Expression. Fra en halvkugle får vi rutinemæssigt ~ 30.000 microglia til cortex og ~ 5.000 microglia til cerebellum, hippocampus eller striatum. Disse udbytter er tilstrækkelige for de fleste enkelt celle applikationer samt bulk-RNA-SEQ (3.000 eller flere celler kan anvendes). Det er værd at nævne, at microglia kan upregulate CD45 immunoreactivity under udvikling eller sygdom2, i hvilket tilfælde celler med både lave og høje niveauer af CD45 skal registreres og indeks sorteres til analyse. En anden mulighed for berigende microglia er at bruge CD11b perler-medieret magnetisk-aktiveret celle sortering efter myelin fjernelse, men dette ville begrænse scRNA-SEQ til dråbe metoder.
For at studere mikroglial genekspression ved enkelt celle opløsning sorterer vi normalt celler i mindst 2 − 3 96-brønd plader pr. prøve og udfører Biblioteks forberedelse med væske håndterings maskiner. Det har vist sig, at denne plade-baserede fuld-længde bibliotek forberedelse tilgang er en af de mest følsomme scrna-SEQ metoder i detektionsgrænsen, tillader nøjagtig kvantificering af sjældne udskrifter, såsom transkriptionsfaktorer13,14,16. På grund af sekvensering i fuld længde, er denne fremgangsmåde ikke underlagt 5 ' eller 3 ' bias og kan bruges til at analysere splejsning varianter (tabel 3). Hertil kommer, i modsætning til dråbe baserede metoder, som normalt kræver hundreder eller tusinder af celler i en reaktion, denne plade-baserede protokol har fleksibiliteten til at omfatte et lille antal celler i hvert eksperiment, og gradvist udvide befolkningens størrelse ved at tilføje flere plader i design senere. Dette er fordelagtigt, når man studerer små undergrupper af microglia under visse betingelser, såsom fosterudvikling.
Mens denne protokol reproducerbart genererer høj kvalitet scRNA-SEQ biblioteker for hjernen regional microglia, det er ofte kun egnet til små undersøgelser på grund af de relativt høje omkostninger (omkring $5/Cell for bibliotek forberedelse, stadig billigere end $23/Cell, hvis du bruger off hylden SmartSeq v4 Kit). Flere strategier kan hjælpe med at reducere omkostningerne og øge dataoverførselshastigheden. For det første kan cellerne sorteres i 384-brønd plader med så lidt som 0,5 μL lysis-buffer, og dette kræver kun 1/8 volumener af reagenser til den oprindelige reverse transskription og PCR amplifikation trin. For det andet er det muligt at producere in-House Tn5 transposase, der har samme kvalitet som den i et kommercielt tilgængeligt kit23. Disse to modifikationer kan reducere bibliotekets forberedelses omkostninger ned til $1/Cell. For det tredje, ved hjælp af tilpassede indekser, tusindvis af celler kan samles sammen til sekvensering på et system uden at ofre sekvensering dybde (> 1 million læsninger/celle)17. Disse forbedringer sammen med inkorporering af automatiserede væske håndteringsrobotter, vil gøre det muligt for høj gennemløb dyb scRNA-SEQ af microglia isoleret fra næsten alle definerede regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno og Spyros Darmanis for deres hjælp under udviklingen af denne protokol. Vi takker også Stanford Shared FACS-faciliteten, især Meredith Weglarz og Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart fra Stanford protein og Nucleic Acid facilitet (PAN) for deres store støtte til optagelserne. Dette arbejde finansieres af JPB Foundation og Vincent J. Coates Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).
