Summary
Målet med denne protokollen var å utvikle en murine modell av lavt nivå toxicant eksponering som ikke forårsaker åpen leverskade, men heller forverrer pre-eksisterende leverskader. Dette paradigmet bedre viser menneskelig eksponering og subtile endringer som oppstår ved eksponering for toxicant konsentrasjoner som er betraktet som sikre.
Abstract
Vinyl klorid (VC), en rikelig miljømessige miljøgifter, forårsaker steatohepatitis på høye nivåer, men anses trygt på lavere nivåer. Selv om flere studier har undersøkt rollen som VC som en direkte hepatotoxicant, konseptet at VC endrer følsomheten til leveren til andre faktorer, slik som alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD) forårsaket av høy-fett diett (HFD) er romanen. Denne protokollen beskriver en eksponering paradigme å evaluere effekten av kroniske, lavt nivå eksponering for VC. Mus er acclimated til lav-fett eller høy-fett diett en uke før begynnelsen av innånding eksponering og forblir på disse dietter gjennom hele eksperimentet. Mus er eksponert for VC (sub-OSHA nivå: < 1 ppm) eller rom luft i innånding kamre i 6 timer/dag, 5 dager/uke, i opptil 12 uker. Dyr overvåkes ukentlig for kroppsvektøkning og mat forbruk. Denne modellen av VC eksponering forårsaker ingen åpen leverskade med VC innånding alene. Imidlertid forbedrer kombinasjonen av VC og HFD betydelig leversykdom. En teknisk fordel med denne co-eksponering modellen er hele kroppen eksponering, uten tilbakeholdenhet. Videre, forholdene nærmere ligner en svært vanlig menneskelig situasjon med en kombinert eksponering for VC med underliggende alkoholfrie fatty leversykdom og dermed støtte romanen hypotesen at VC er en miljømessig risikofaktor for utvikling av leverskader som en komplikasjon av fedme (dvs. NAFLD). Dette arbeidet utfordrer paradigmet at gjeldende eksponeringsgrenser VC (yrkesmessig og miljømessig) er trygge. Bruken av denne modellen kan kaste nytt lys og bekymring på risikoen for VC eksponering. Denne modellen av toxicant-indusert leverskade kan brukes til andre flyktige organiske forbindelser og for å studere andre interaksjoner som kan påvirke leveren og andre organsystemer.
Introduction
Tallrike toxicants er til stede i luften vi puster på svært lave nivåer. Vinyl klorid (VC) er monomere gass som brukes av industrien for å skape polyvinylklorid (PVC) plastprodukter1. Det er en utbredt miljømessig hepatotoxicant, kjent kreftfremkallende, og er rangert #4 på ATSDR farlig stoff prioritet liste2. For bedre å forstå toksiske effekter på menneskers helse og interaksjoner med eksisterende Co-morbidities, etablere modeller av eksponering som etterligner menneskelig eksponering er avgjørende. Den primære interessen for denne gruppen er å studere hepatic effekter av kronisk VC eksponering ved lave konsentrasjoner. VC utøver sine viktigste effekter på leveren, hvor det har blitt vist (ved høye konsentrasjoner) å forårsake steatosis, og toxicant-assosiert steatohepatitis (TASH) med nekrose, fibrose, skrumplever3,4, samt leverkreft (HCC) og den ellers ekstremt sjeldne hepatic hemangiosarcoma5. TASH har trolig eksistert i befolkningen i flere ti år, men forble uncharacterized og underappreciated av etterforskerne4,6. Som et resultat av forskning som viser direkte toksisitet for VC-eksponering, reduserte Occupational Safety and Health Administration (OSHA) den akseptable eksponerings terskelen til 1 ppm over en 8 h arbeidsdag7. Selv om eksponerings terskelen har blitt senket, er effekten av denne konsentrasjonen av VC på menneskers helse uklart7. I tillegg er effekten av VC eksponering på eksisterende komorbiditeter, for eksempel leversykdom, i stor grad ukjent8. Dette kunnskaps gapet er spesielt viktig i dag på grunn av den økende globale utbredelsen av alkoholfrie fatty leversykdom (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. Viktigere, VC har nylig vist å være en uavhengig risikofaktor for leversykdom fra andre årsaker13. Målet med denne protokollen var derfor å utvikle en relevant inhalasjons modell for eksponering for flyktige miljømessige toxicant, VC i sammenheng med underliggende leverskade, å etterligne menneskelig eksponering og identifisere potensialet, romanen mekanismer for VC-indusert eller VC-forsterket leverskade.
Den viktigste ruten for eksponering for mange miljømessige toxicants og forurensende stoffer er via innånding. Når inhalert, kan sammensatte gå inn systemisk sirkulasjon gjennom lungene, reise til leveren, og bli metabolically aktiveres av hepatic enzymer før de blir utskilt14,15,16. Det er ofte disse aktive metabolitter som forårsaker toksisitet og skade i kroppen. Tidligere studier av denne gruppen og andre har brukt VC metabolitter som surrogater for eksponering for VC gass17,18. Andre grupper har brukt innånding modeller av VC; Imidlertid ble ekstremt høye eksponeringsnivåer (> 50 ppm) iverksatt for å indusere Akutt toksisitet, alvorlig leverskade og tumor utvikling19. Selv om disse studiene har gitt viktig informasjon og mekanismer for VC-indusert kreftfremkallende, har de ikke recapitulate de subtile effektene og komplekse interaksjoner med andre medvirkende faktorer og derfor er mindre relevante for menneskelig eksponering.
VC-inhalasjon pluss høy fett diett (HFD) modell beskrevet her (se figur 1 for tidslinje), er den første modellen av kronisk, lav dose VC eksponering (dvs. sub-OSHA konsentrasjon), der mus er eksponert for toxicant under forhold som etterligner menneskelig eksponering mye tettere. Faktisk data fra denne modellen sammenfattet resultatene observert hos mennesker eksponert for VC, slik som innvirkning på metabolske trasé20, oksidativt stress og mitokondrie dysfunksjon4. Andre musemodeller av inhalasjon, slik som hode-bare og nese-bare modeller21, krever at dyret skal behersket, forårsaker stress til dyret. Her, denne hele kroppen eksponerings metode ikke krever injeksjon eller unødvendige stress til dyrene. Dyrene ha annonse lib adgang å næringen og vann og er oppstilt innen det større innånding kammeret for en bestemt antallet av timene per dag og dager per uke. Videre konseptet at VC endrer følsomhet for en annen hepatotoxicant er en roman finne, først demonstrert av denne gruppen12 og har IMPLIKASJONER for VC eksponering i konsentrasjoner godt under de som trengs for direkte hepatotoxicity.
Denne metoden for innånding eksponering kan brukes til å etterligne eksponering til en rekke gass toxicants, inkludert andre flyktige organiske forbindelser, til stede i vårt miljø. Faktisk, flyktige organiske forbindelser er en stor gruppe av miljømessige toxicants og mer utbredt i industrialiserte områder, noe som resulterer i visse populasjoner å være i høyere risiko for kronisk eksponering22. Denne protokollen kan endres for å passe ulike eksperimentelle spørsmål. Lengden på tid og konsentrasjon av sammensatte administreres kan varieres. Selv om utgangspunktet utviklet for fastsettelse av leverskade, kan andre organsystemer og har blitt studert med denne modellen23. Etterforskere som mål å studere kroniske eksponeringer med dyr, men ønsker å minimere animalsk stress, bør vurdere å bruke denne modellen.
Protocol
Alle av det dyr/VC eksperimenter var anerkjent av avdelingen av miljømessig sunnhet, sikkerheten forening for vurderingen og akkreditering av laboratorium dyr bekymre og prosedyrer var anerkjent av det innenbys institusjonell dyr bekymre og bruk komité.
1. eksperimentell oppsett og Akklimatisering til renset, eksperimentelle dietter
- Bestem totalt antall C56Bl/6J-mus (minimalt 6 − 8 mus per gruppe).
Merk: dyr i hver diett gruppe vil bli ytterligere sub-delt inn i eksponering grupper. Sørg for å gjøre rede for det totale antallet dyr som trengs når du planlegger studien. - Identifiser og veie dyrene. Registrere disse dataene.
- Bytt dietter fra vanlig Chow til renset lav-fett (LFD) eller høy-fett diett (HFD) en uke før starten av innånding eksperimenter for å acclimate musene til den nye dietter (se figur 1 for tidslinjen).
- Gi mat og vann ad lib. Overvåk mat forbruket ved å veie og registrere maten som skal gis per bur, og veiing og registrering av resten av maten på hver fôring dag. Hvis bolig 4 mus per bur, gi ~ 50 g mat to ganger per uke. Hvis bolig 5 mus per bur, gi ~ 60 g mat to ganger per uke.
Merk: under fôring av renset dietter, bør mengden mat sjekkes hver dag for å sikre at musene har tilstrekkelig pellets. Hvis det er utilstrekkelig pellets musene har en tendens til å "hamstre" mat og øke inntaket. Videre, spesielt HFD tendens til å smuldre mye mer enn LFD, forårsaker en lignende effekt. - Overvåk dyr gjennom hele eksperimentet for å sikre at dyre helsen opprettholdes.
Merk: ukentlig vektøkning og mat forbruk, sammen med metabolsk overvåking kan gjøres for å gi en indeks over generelle dyrehelse.
2. vinyl klorid innånding eksponerings system
Merk: det finnes flere eksponerings systemer for innånding kommersielt tilgjengelig, alt fra "bare nesen" til "hele kroppen"-eksponering og manuell til automatiserte systemer. Data som tidligere ble publisert av denne gruppen, er avledet fra et helkropps manuelt system12,23,24. Et diagram som beskriver den automatiserte innånding eksponerings system er vist i figur 2.
- Sørg for at fortynnings luften i både de eksperimentelle og kontroll kamrene er høyeffektive partikkel luft (HEPA) og aktivert karbon filtrert, tørket og trykket regulert før de trer i sine respektive strømnings målings enheter (masse strømnings kontroller [MFC ] – eksperimentell kammer, flowmeter – kontroll kammer).
Merk: i kontroll kammeret regulerer flowmeter luftstrømmen til musene. Luften går inn i toppen av kammeret, passerer mus, så er oppbrukt under mus og passerte gjennom et HEPA filter før du går inn i den kjemiske panseret. Temperatur og relativ fuktighet (RH) måles i kammeret. I den eksperimentelle kammeret, er fortynnings luften blandes med luft fra en VC tank. Begge strømmene reguleres med enhetstypen. Forholdet mellom de to blandinger bestemmer konsentrasjonen av VC i den eksperimentelle kammeret. VC går inn i toppen av eksponerings kammeret gjennom en dispergerer med syv dyser som peker i forskjellige retninger. VC passerer mus og er deretter oppbrukt gjennom 12 separate porter som er plassert under buret rack. Dette kammeret design har vist å gi homogene toxicant konsentrasjoner tidligere25. - Sørg for at trykket, temperaturen og RH overvåkes fra innenfor den eksperimentelle og kontroll kamre.
- Bekreft at kammer eksos føres gjennom et HEPA filter, en CO2 probe, og et aktivt kullfilter før du går inn i eksos området av den kjemiske hetten og at co2 nivå overvåkes for å sikre at musene mottar akseptabel ventilasjon.
- Bruk tilpasset programvare for å endre, overvåke og registrere miljømessige variabler ved innånding eksponeringer.
Merk: Hvis det brukes et manuelt system, skal variablene som er beskrevet i trinn 2.1 − 2.4 overvåkes og kalibreres, når det er nødvendig regelmessig gjennom hele eksponerings perioden.
3. oppsett før eksponering
- Slå av alle luftmengder i de eksperimentelle og kontroll kamre for tekniker sikkerhet.
- For hvert kammer, åpne kammer døren og plassere absorberende sengetøy materiale (absorberende side opp) på toppen av ekskrementer panorere. Fukt det absorberende materialet for å gi et behagelig Luftfuktighetsnivå (40 − 60% RH) i hele eksponerings perioden.
- Still inn ønsket eksponeringsnivå for VC i kammeret. For sub-OSHA grense konsentrasjoner bruke 0,85 ppm av VC. Bruk enten Software-administrert, detektor-basert feedback kontroll av VC levering til kammeret eller bruke manuelle justeringer i systemet.
Merk: sistnevnte tilnærming krever kunnskap om kammer volum, kammer oppdateringsfrekvens, luftstrøm og levering rate av VC gassen fra aksjen forsyning; disse beregningene må senere bli validert og kalibrert ved målinger av VC-konsentrasjoner i kammeret i steady state12,24. Den vanligste teknikken for måling av VC i kammeret er via gass kromatografiske analyse av prøve luft12,24. Fordelene med programvare drevet tilnærming om nøyaktighet og presisjon av VC levering er klare. Det har imidlertid vist seg at den manuelle tilnærmingen også er nøyaktig og konsistent12,24.
FORSIKTIG: VC er en kjent toxicant og kreftfremkallende på høyt nivå. Utøve riktig personlig verneutstyr og håndtering av gassen mens du skrur på og av kamrene.
4. eksponering bur og dyr forberedelse
- Fjern musene fra sine boliger kamre og plassere dem i de enkelte bur av innånding kammeret buret rack (ett bur rack for kontroll mus, en for eksponert mus). Tilfeldig hver mus plassering i buret rack daglig for å sikre at hver mus er eksponert homogenously innenfor eksponerings kammeret. Flekk hver dyrene ' antallet og bur plasseringen holdning inne det laboratorium notisbok.
- Plasser hver bur rack i sine respektive kammer og lukke kammer dørene.
5. gjennomføre en eksponering
- Kontroller at ventilen for VC-gasstanken er i åpen stilling. Sørg for at fortynnings flyten for det eksperimentelle kammeret er satt til 25 L/min.
- Start fortynnings flyten i det eksperimentelle kammeret. Kontroller at flowmeter på kontroll kammeret er satt til 25 L/min.
- Sørg for at alle sensorer (strømmer, temperatur, fuktighet, kammer trykk, CO2 nivå) fungerer riktig og viser forventede resultater i både eksperimentelle og kontroll kamre.
Merk: VC-flyten beregnes og angis på grunnlag av fortynnings flyten og ønsket VC-konsentrasjon. - Sørg for at hele eksponeringen, i det eksperimentelle kammeret, eksponeringstid, fortynnings flyt, VC-flyt, temperatur, fuktighet, kammer trykk, CO2 -nivå og teoretisk VC-konsentrasjon vises, grafisk og registreres. Kontroller at temperatur og luftfuktighet for kontroll kammeret også vises, grafisk og registreres.
Merk: Hvis det brukes et manuelt system, bør VC-Flow kontrolleres og justeres når det er nødvendig, gjennom hele eksponerings perioden. - Hvis det oppstår problemer under eksponeringen, setter du VC-flyten til null og øker fortynnings flyten til maksimumsverdien for å raskt rense kammeret.
- Når eksponerings varigheten (for eksempel 6 h/dag) er nådd, slår programvaren automatisk av VC-strømmen. Den 15 min sikkerhets timer deretter begynner for tiden etter varigheten for eksperimentell kammer å fjerne VC. Når det er trygt å fjerne dyrene, klikker du på OK -knappen i dialogboksen. Systemet vil stoppe innspillingen målinger til filen og eksponeringen er over.
Merk: Hvis et manuelt system brukes, må brukeren manuelt slå av VC-flyt på slutten av eksponerings varigheten og tiden for VC-klaring på slutten av eksponeringen må beregnes.
6. etter eksponering
- Slå stopcock på ventilen for VC gasstanken til lukket posisjon og slå av alle luftmengder i eksponerings kammeret. Drei flowmeter til det ikke er noen luftstrøm i kontroll kammeret.
- Fjern dørene fra hvert kammer for å gi ventilasjon til mus. Fjern buret stativer fra kamrene. Under en hette, fjerne mus fra deres eksponering bur og plassere dem tilbake i sine bolig bur. Transport alle mus tilbake til sine bolig rom for overnatting boliger i vanlige bur.
- Kast avfall fra den ekskrementer pannen inn i en avdeling for miljø Helse & Safety (DEHS)-godkjent Biohazard container, da disse kan betraktes som en kjemisk fare av institusjonelle miljø helsetjenester. Rengjør kammer dørene, ekskrementer pannen, eksponerings bur stativet og eksponerings kammeret for de eksperimentelle og kontrollsystemene.
7. validering av VC-konsentrasjon i kamre under eksponering
- Gjennomfør en måling av VC-konsentrasjonen i eksperiment kammeret halvveis gjennom hver eksponering (3 t).
- Break glasset tips på en VC detektor tube og en forbehandle tube. Fest strømnings utgangen på VC-detektor slangen til detektoren tube pumpen. Fest strømnings-i enden av VC detektor røret til Flow-out enden av forbehandle røret med et kort stykke slange. Fest et kort stykke slange til strømnings-i enden av forbehandle røret.
- Fjern en plugg fra en av prøve portene som er nær pustesonen til musene. Fest slangen fra strømnings-i enden av forbehandle røret til Prøvetakings porten.
- Fra full stilling, forlenge håndtaket på stempelet av detektoren røret pumpen til fullt ut posisjon. Dette vil trekke 100 mL samplet gass fra kammeret inn i VC detektor røret over en periode på 90 s. Etter å ha ventet på 90-s, skyver du håndtaket inn igjen.
- Gjenta trinn 7,4 tre ganger slik at totalt 400 mL trekkes inn i VC detektor røret.
- Fjern slangen fra prøve porten på kammeret og sett pluggen inn i porten igjen. Inspiser fargeendring av VC detektor rør for å fastslå VC konsentrasjon i kammeret.
- Spill inn VC detektor røret lesing i laboratoriet notisbok og sammenligne med den teoretiske verdien. Kast VC-detektor røret og forbehandle røret i en egnet beholder.
8. opphør av eksponerings eksperiment ved innånding
Merk: etter ønsket timepoint av eksponering, for eksempel, 6, 8 og/eller 12 uker etter starten på innånding, blir eksperimentene avsluttet og dyr vil bli euthanized (se figur 1 for tidslinje).
- Rask musene 4 h før tiden for døds aktiv.
Merk: denne prosedyren gjør det mulig å bestemme fastende blod glukose og insulin nivåer for metabolsk analyse. - Bruk en dødshjelp tilnærming i samsvar med American veterinary Medical Association (AVMA) retningslinjer, slik som anestesi etterfulgt av exsanguination.
- Administrer ketamin/xylazine (100/15 mg/kg) ved intraperitoneal injeksjon til hver mus for å indusere anestesi.
Merk: unngå natrium pentobarbital som en pre-døds-bedøvelse, som vinylklorid eksponering kan hemme dens effektivitet. - Samle blod fra den underlegne vena cava til natrium citrate løsning (endelig, 0,38%), for å forhindre blodpropp og for prøve bevaring.
- Fjern leveren og/eller andre ønsket organ. Analysere leveren og snap-fryse porsjoner i flytende nitrogen, legge i frossen prøve medium, og fikse i 10% bufret formalin for histologi.
- Skill plasma fra blod via sentrifugering og Overfør citrerte plasma til et egnet rør og oppbevar ved-80 ° c til det er nødvendig for analyse.
- For å evaluere histologiske indekser av leverskade, Utfør hematoksylin og eosin (H & E) farging med 5 μM formalin fast parafin embedded lever seksjoner og få bilder med et brightfield mikroskop.
- For å få plasma aspartattransaminase nivåer, utføre både alanin alaninaminotransferase (ALAT) og aspartate alaninaminotransferase (AST) kinetisk analyser på citrerte plasma ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kits.
Merk: for kvalitetskontroll bør plasma levertransaminaser for C57Bl/6J-mus være i det normale området (35 − 45 IU/L) for LFD + VC-gruppen, mens verdiene bør heves (~ 150 IU/L) for HFD + VC-gruppen (Figur 3C).
Representative Results
I løpet av eksperimentet, dyr kroppsvekt og mat forbruk ble overvåket ukentlig for å sikre dyrehelse og evaluere in vivo metabolisme. Figur 3a avbilder kroppsvekt og mat forbruk for en 12 ukers eksperiment. Kroppsvekten ble målt en gang per uke og mat forbruk ble målt to ganger per uke for alle grupper. Alle mus fikk vekt i løpet av studiet. Mens, som forventet musene i HFD gruppene fikk mer vekt som musene i LFD grupper, musene eksponert for VC ikke få mer vekt enn mus i den respektive kontrollgruppen. Mat forbruket var ikke forskjellig mellom alle grupper12,24.
Figur 3B skildrer representative fargefotomikrografier av lever seksjoner beiset med H & E for analyse av generell morfologi. I LFD-gruppen forårsaket VC ingen åpenbare patologisk endringer. HFD fôring betydelig økt steatosis (fett akkumulering) og VC eksponering økt denne effekten. Videre resulterte VC-eksponering i HFD-gruppen i noen inflammatoriske prioriteringer12,24.
Plasma aspartattransaminase (ALAT og AST) nivåer ble målt som indikatorer for leverskader og en forhøyet aspartattransaminase nivå er en indikator på leverskader. I LFD gruppen, VC ikke øke aspartattransaminase nivåer. HFD alene litt økt aspartattransaminase nivåer og viktigere VC betydelig forbedret denne effekten (Figur 3C)12,24.
Lever vekt til kroppsvekt prosenter ble beregnet for hver gruppe. HFD betydelig økt leveren til kroppsvekt prosenter. Men VC ikke signifikant øke denne effekten (Figur 3D)12.
Figur 1: oversikt over prosedyren for inhalasjons modell. Mus er matet de respektive lite fett (13% mettet fett) eller høy-fett (42% mettet fett) dietter annonse lib for 1 uke for å akklimatisere seg dem til renset dietten. Etter en uke introduseres mus til inhalasjons regimet. For det er mus plassert i State-of-the-art hele kroppen innånding kamre for eksponering for en sub-OSHA nivå VC konsentrasjon av < 1 ppm (0,85 ppm ± 0,1 ppm) eller rom luft (kontroll) for 6 h/dag, 5 dager/uke, for 12 uker. Under innånding er musene tillatt fri tilgang til mat og vann. På 12 uker er mus euthanized i morgen. Denne modellen kan utvides til lengre perioder med kronisk eksponering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: innånding kammer design. Det vises et diagram over et automatisk eksponerings system for innånding som gir homogene toxicant konsentrasjoner. Tilpasset programvare gjør det mulig for brukeren å endre, overvåke og registrere miljømessige variabler ved innånding eksponeringer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: vinyl klorid alene ikke forårsaker åpen leverskade, men forbedrer kosthold-indusert leversykdom. (A) kroppsvekt og mat forbruk ble overvåket ukentlig. (B) representativ fargefotomikrografier av generell lever morfologi av H & E flekker vises (forstørrelse = 200x). (C) citrerte plasma ble samlet inn på slutten av eksponerings perioden og analysert for aspartattransaminase enzymatisk aktivitet som en indeks av leverskader. (D) lever vekt ble bestemt på ulike eksperimentelle tid poeng og sammenlignet med hele kroppsvekt. Resultatene er presentert som gjennomsnittet ± SEM.a, p < 0,05 sammenlignet med respektive LFD kontroll; b, p < 0,05 sammenlignet med fravær av VC. Prøver størrelse per gruppe n = 8 − 10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne modellen av VC-forbedret NAFLD er en ny metode for å evaluere effekten av sub-OSHA grense VC eksponering i en hel-kropp innånding paradigme. Denne modellen gjør at etterforskerne å studere sub-hepatotoxic og sensibiliserende effekter av lave nivåer av VC alene. Faktisk, oppnår denne co-eksponering modellen forbedret leverskade, heving av plasma ALAT og AST og moderat betennelse, mens i stor grad ikke påvirker andre organsystemer, som hjerte, ved denne konsentrasjonen23. Denne kroniske modellen krever hele kroppen innånding kamre men minimerer stress og eksponering konsentrasjoner. Selv om protokollen som presenteres her er en Software-drevet tilnærming, har vår erfaring vist at den manuelle tilnærmingen er også en nøyaktig og konsistent metode for eksponering12,24. Videre er det lett tilgjengelig for flere forskningsområder, inkludert andre organskade23 forårsaket av flyktige organiske sammensatte eksponering22. Spesielt, denne modellen kan ligne nærmere på patogenesen av menneskelige co-eksponeringer til miljømessige kjemikalier og underliggende sykdom5.
For å oppnå lignende resultater må det oppnås visse kritiske trinn for protokoll optimalisering. For eksempel må etterforskere fastslå at konsentrasjonen av VC eller andre toxicant innenfor kamrene er innenfor ønsket område av eksponering (dvs. lavt nivå, sub-OSHA, eller akutte nivåer). Optimalisering av dette trinnet i innånding kammeret er avgjørende for en vellykket modell av menneskelig eksponering av interesse. For det andre, justere tidspunktet for eksponering per dag og varighet av eksperimentet kan også endres. Per interessene til denne gruppen, en yrkesmessig eksponering ble oppnådd, og en ekstra parameter for kosthold ble også studert. Imidlertid kan miljømessige og akutte eksponeringer også være modellert med denne protokollen.
Dette arbeidet utfordrer paradigmet som gjeldende eksponeringsgrenser VC (yrkesmessig og miljømessig) er trygge. Faktisk, selv om gjeldende OSHA eksponeringsgrense for VC er 1 ppm, har denne modellen bevist at konsentrasjoner av VC under denne grensen er tilstrekkelig for å forbedre leverskader forårsaket av HFD i mus. Denne protokollen gjør at etterforskerne å studere og karakterisere en roman toxicant eksponering paradigme og modell TASH.
Dette er den første modellen av kronisk, lav dose VC eksponering. Tidligere arbeid brukte svært høye konsentrasjoner av bolus, akutte eksponeringer eller aktive metabolitter som surrogater for VC-eksponering. Alle disse tilnærmingene redusere relevansen av funnene til menneskelig eksponering. Derfor, denne romanen modell av TASH-NAFLD interaksjon gir den nødvendige plattformen for etterforskere å undersøke komplekse interaksjoner av lavt nivå VC eksponering.
Denne modellen av toxicant-indusert leverskade kan brukes til andre flyktige organiske forbindelser og også for å studere andre interaksjoner som kan påvirke leveren og andre organsystemer8,22,23. Videre har denne modellen vært, og kan bli ytterligere, brukes til å undersøke intervensjon terapi og grundig mekanistisk studier av handlings modus for denne utbredte toxicant24. Som VC er en kjent kreftfremkallende26,27,28, denne eksponeringen paradigmet kan også endres for studiet av VC-indusert kreft. Andre Co-morbidities som alkoholholdige leversykdom kan også bli forsterket av VC co-eksponering. I tillegg vil det være av interesse å studere ulike typer fett, for eksempel flerumettede fett18,29,30, eller ulike typer karbohydrater31 og deres co-eksponering med VC i denne modellen. Faktisk, alle disse faktorene er kjent for å ha differensial effekter på utviklingen av leverskade og kan spille en rolle i VC-indusert hepatic sykdom.
Avslutningsvis er dette en roman innånding modell av miljømessige toxicant-indusert leverskade og etablerer en eksponering paradigme for kroniske, lavt nivå VC eksponering. Konsentrasjonen av VC brukes i denne modellen er sub-hepatotoxic av seg selv, mens det forbedrer leverskade forårsaket av en annen faktor (HFD) i mus. Denne modellen vil tillate etterforskere å studere mekanismer og intervensjoner for kroniske VC toksisitet og kan være nyttig for translational studier ser på eksponert menneskelige og på den høyeste risikoen for eksponering.
Disclosures
WT gullsmed har økonomisk interesse i IEStechno, som er malen for systemet som er beskrevet. De resterende forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av tildelinger fra National Institutes of Health (K01 DK096042 og R03 DK107912) til Juliane Beier. Forskning ble også støttet av en institusjonell utvikling Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under stipend nummer P20GM113226 og National Institute on Alcohol Abuse og alkoholisme av National Institutes of Health under Award Number P50AA024337. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
| CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
| Eosin | Sigma | E6003 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
| Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
| Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
| Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |
References
- Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
- ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
- Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
- Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
- Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer's Hepatology. Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. , Saunders. Philadelphia, PA. 476-492 (2012).
- Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
- EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
- Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
- Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
- Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
- Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
- Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
- Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. Biochemistry. 18 (23), 5177-5182 (1979).
- Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
- Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
- Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. Cancer Research. 62 (2), 5183-5188 (2002).
- Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
- Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
- Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
- Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
- Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
- Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
- IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , Lyon, France. (2008).
- IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, Pt F 9 (2012).
- Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
- Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
- Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
- Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).
