Summary
Målet med detta protokoll var att utveckla en murin modell av låg nivå toxiskt exponering som inte orsakar öppen leverskada, utan snarare förvärar redan existerande leverskada. Detta paradigm rekapitulerar bättre mänsklig exponering och de subtila förändringar som sker vid exponering för toxiskt koncentrationer som anses säkra.
Abstract
Vinylklorid (VC), en riklig miljöförorening, orsakar steatohepatit på höga nivåer, men anses säker på lägre nivåer. Även om flera studier har undersökt rollen av VC som en direkt hepatotoxicant, konceptet att VC ändrar känsligheten i levern till andra faktorer, såsom alkoholfria fettlever (NAFLD) orsakad av fettrik diet (HFD) är ny. Detta protokoll beskriver ett exponerings paradigm för att utvärdera effekterna av kronisk, låg nivå exponering för VC. Möss är acklierade till fettsnål eller fettsnål diet en vecka före början av inhalations exponeringen och kvar på dessa dieter hela experimentet. Möss exponeras för VC (del OSHA-nivå: < 1 ppm) eller rumsluft i inhalations kammare under 6 timmar/dag, 5 dagar/vecka, i upp till 12 veckor. Djuren övervakas varje vecka för viktökning och livsmedelskonsumtion. Denna modell av VC-exponering orsakar ingen öppen leverskada med VC inandning ensamt. Emellertid, kombinationen av VC och HFD förbättrar signifikant leversjukdom. En teknisk fördel med denna Co-Exposure modell är hela kroppen exponering, utan återhållsamhet. Dessutom, villkoren närmare liknar en mycket vanlig mänsklig situation av en kombinerad exponering för VC med underliggande alkoholfria fettlever och därför stödja den nya hypotesen att VC är en miljö riskfaktor för utveckling av leverskada som en komplikation av fetma (dvs. NAFLD). Detta arbete utmanar paradigmet att de nuvarande exponeringsgränserna för VC (arbets-och miljö) är säkra. Användningen av denna modell kan sprida nytt ljus och oro för riskerna med VC-exponering. Denna modell av toxicant-inducerad leverskada kan användas för andra flyktiga organiska föreningar och att studera andra interaktioner som kan påverka levern och andra organsystem.
Introduction
Många gifter är närvarande i luften vi andas på mycket låga nivåer. Vinylklorid (VC) är monomerisk gas som används av industrin för att skapa polyvinylklorid (PVC) plastprodukter1. Det är en utbredd miljö hepatotoxicant, känd carcinogen, och rankas #4 på ATSDR prioriterade ämne lista2. För att bättre förstå de toxiska effekterna på människors hälsa och interaktioner med befintliga komsjukligheter är det avgörande att fastställa exponeringsmodeller som efterliknar exponeringen hos människor. Det primära intresset för denna grupp är att studera levereffekterna av kronisk VC-exponering vid låga koncentrationer. VC utövar sina huvudsakliga effekter på levern, där det har visats (vid höga koncentrationer) att orsaka steatos, och toxicant-associerade steatohepatit (Tash) med nekros, fibros, cirros3,4, samt Hepatocellulär cancer (HCC) och den annars extremt sällsynta hepatiska hemangiosarcoma5. Tash har sannolikt funnits i befolkningen i årtionden men förblev okarakteriserad och underskattat av utredarna4,6. Som ett resultat av forskning som visar de direkta toxicitetsproblemen för VC-exponering sänkte arbetsmiljö förvaltningen (OSHA) den godtagbara exponerings tröskeln till 1 ppm under en 8 h arbetsdag7. Även om exponerings tröskeln har sänkts, är effekten av denna koncentration av VC på människors hälsa oklar7. Dessutom, effekten av VC exponering på befintliga comorbidities, såsom leversjukdom, är till stor del okänd8. Detta kunskapsgap är särskilt viktigt i dag på grund av den ökande globala prevalensen av alkoholfria fettlever (nalfd)4,6,7,9,10,11,12. Viktigt, VC har nyligen visat sig vara en oberoende riskfaktor för leversjukdom från andra orsaker13. Målet med detta protokoll var därför att utveckla en relevant inhalations modell för exponering för den flyktiga miljötoxikan, VC i samband med underliggande leverskada, för att efterlikna mänsklig exponering och identifiera potentiella, nya mekanismer för VC-inducerad eller VC-förstärkt leverskada.
Den huvudsakliga exponeringsvägen för många miljögifter och föroreningar sker via inandning. När inhalerat, föreningen kan ange systemisk cirkulation genom lungorna, resa till levern, och bli metaboliskt aktiveras av leverenzymer innan de utsöndras14,15,16. Det är ofta dessa aktiva metaboliter som orsakar toxicitet och skador i kroppen. Tidigare studier av denna grupp och andra har använt VC metaboliter som ersättningar för exponering för VC gas17,18. Andra grupper har använt inhalations modeller av VC; emellertid, extremt höga exponeringsnivåer (> 50 ppm) genomfördes för att inducera akut toxicitet, allvarlig leverskada, och tumörutveckling19. Även om dessa studier har gett viktig information och mekanismer för VC-inducerad cancerogenitet, de inte recapitulate de subtila effekter och komplexa interaktioner med andra bidragande faktorer och därför är mindre relevanta för människors exponering.
Den VC-inandning plus fettrik diet (HFD) modell som beskrivs här (se figur 1 för tidslinje), är den första modellen av kronisk, lågdos VC exponering (dvs., sub-OSHA koncentration), där möss utsätts för toxiskt under förhållanden som imiterar människors exponering mycket närmare. I själva verket, data från denna modell återfått resultat observerats hos människor som exponeras för VC, såsom inverkan på metaboliska vägar20, oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion4. Andra musmodeller av inandning, såsom huvud-bara och näsa-endast modeller21, kräver att djuret vara återhållsamma, orsakar stress för djuret. Här, denna hela kroppen exponeringsmetod kräver inte injektion eller onödiga stress till djuren. Djuren har AD libitum tillgång till mat och vatten och placeras inom den större inhalations kammaren för ett bestämt antal timmar per dag och dagar per vecka. Dessutom, konceptet att VC ändrar känslighet för en annan hepatotoxicant är ett nytt fynd, först visat av denna grupp12 och har konsekvenser för VC exponering vid koncentrationer långt under de som behövs för direkt levertoxicitet.
Denna metod för inhalationsexponering kan användas för att efterlikna exponering för en mängd olika gasformiga gifter, inklusive andra flyktiga organiska föreningar, som finns i vår miljö. Faktum är att flyktiga organiska föreningar är en stor grupp av miljögifter och vanligare i industrialiserade områden, vilket resulterar i att vissa populationer har högre risk för kronisk exponering22. Detta protokoll kan modifieras för att passa olika experimentella frågor. Längden på tid och koncentration av sammansatta administreras kan varieras. Även initialt utvecklats för bestämning av leverskada, andra organsystem kan och har studerats med denna modell23. Utredare som syftar till att studera kroniska exponeringar med djur, men vill minimera djurens stress, bör överväga att använda denna modell.
Protocol
Alla djur/VC experiment godkändes av Institutionen för miljö hälsa, säkerhet föreningen för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg och förfaranden godkändes av den lokala institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. experimentell uppläggning och acklimatisering till renad, experimentell kost
- Bestäm det totala antalet möss med C56Bl/6J (minimalt 6 − 8 möss per grupp).
Observera: djur i varje diet grupp kommer att delas upp ytterligare i exponerings grupper. Se till att ta hänsyn till det totala antalet djur som behövs vid planeringen av studien. - Identifiera och väga djuren. Registrera dessa data.
- Byt kostvanor från vanliga Chow till renad låg fetthalt (LFD) eller fettrik diet (HFD) en vecka före start av inandning experiment för att vänja möss till den nya Dieter (se figur 1 för tidslinje).
- Ge mat och vatten AD libitum. Övervaka livsmedelskonsumtionen genom att väga och registrera maten som ska ges per bur, och vägning och registrering av resten av livsmedlet vid varje utfodringsdag. Om huset 4 möss per bur, ge ~ 50 g mat två gånger per vecka. Om bostäder 5 möss per bur, ge ~ 60 g mat två gånger per vecka.
Obs: under utfodring av den renade Dieter, bör mängden mat kontrolleras varje dag för att säkerställa att möss har tillräckligt med pellets. Om det finns otillräckliga pellets möss tenderar att "hamstra" mat och öka intaget. Dessutom, särskilt HFD tenderar att falla sönder mycket mer än LFD, orsakar en liknande effekt. - Övervaka djur under hela experimentet för att säkerställa djurens hälsa bibehålls.
Obs: veckans viktökning och livsmedelskonsumtion, tillsammans med metabolisk övervakning kan göras för att ge ett index av övergripande djurhälsa.
2. vinylklorid inandning exponeringssystem
Obs: det finns flera inhalations exponeringssystem kommersiellt tillgängliga, allt från "näsa-bara" till "hela kroppen" exponering och manuell till automatiserade system. Data som tidigare publicerats av denna grupp härrör från ett helkropps handbok system12,23,24. Ett diagram som beskriver det automatiserade inhalations exponerings systemet visas i figur 2.
- Säkerställ att utspädningsluften i både försöks-och kontroll kammaren är högeffektiv partikel luft (HEPA) och aktivt kol filtrerat, torkat och tryck reglerat innan de matar in sina respektive flödes Mätningsanordningar (massflödesregulator [MFC ] – experiment kammare, rotameter – kontroll kammare).
Anmärkning: i kontroll kammaren reglerar rotameter luftflödet till möss. Luften kommer in i toppen av kammaren, passerar av möss, sedan är utmattad under möss och passerade genom ett HEPA-filter innan den kemiska huven. Temperatur och relativ luftfuktighet (RH) mäts i kammaren. I experiment kammaren blandas spädningsvätskan med luft från en VC-tank. Båda flödena regleras med MFCs. Förhållandet mellan de två blandningarna bestämmer koncentrationen av VC i experiment kammaren. VC kommer in i toppen av exponerings kammaren genom en disperser med sju strålar som pekar i olika riktningar. Den VC passerar av möss och sedan utmattad genom 12 separata portar som är placerade under bur rack. Denna kammare design har visat sig ge homogena koncentrationer toxicitet tidigare25. - Säkerställ att trycket, temperaturen och RH övervakas inifrån försöks-och kontroll kammare.
- Kontrollera att kammarens avgassystem leds genom ett HEPA-filter, en CO2 -sond och ett aktivt kolfilter innan du går in i avgasområdet på den kemiska huven och att co2 -nivån övervakas för att säkerställa att mössen får godtagbar ventilation.
- Använd den anpassade programvaran för att ändra, övervaka och registrera miljövariabler vid inhalations exponeringar.
Anmärkning: om ett manuellt system används bör variablerna som beskrivs i steg 2.1 − 2.4 övervakas och kalibreras vid behov regelbundet under hela exponeringsperioden.
3. Ställ in före exponering
- Stäng av alla luftflöden i experiment-och kontroll kammare för teknikers säkerhet.
- För varje kammare, öppna kammaren dörren och placera absorberande strömaterial (absorberande sida upp) ovanpå utsönta pannan. Blöt absorberande material för att ge en behaglig fuktighetsnivå (40 − 60% RH) under hela exponeringsperioden.
- Ställ in önskad exponeringsnivå för VC i kammaren. För del OSHA gräns koncentrationer använda 0,85 ppm av VC. Använd antingen den programvaruhanterade, detektor-baserade feedbackkontrollen av VC-leveransen till kammaren eller Använd manuella justeringar av systemet.
Anmärkning: den sistnämnda metoden kräver kännedom om kammar volym, kammar uppdateringsfrekvens, luftflöde och leverans hastighet för VC-gasen från lagertillförseln. dessa beräkningar måste därefter valideras och kalibreras genom mätningar av VC-koncentrationerna i kammaren vid steady state12,24. Den vanligaste tekniken för mätning av VC i kammaren är via Gaskromatografisk analys av prov luft12,24. Fördelarna med den programvarustyrda metoden när det gäller noggrannhet och precision hos VC-leveransen är tydliga. Det har dock visats att den manuella metoden också är korrekt och konsekvent12,24.
Varning: VC är en känd toxisk och cancerframkallande på höga nivåer. Utöva korrekt personlig skyddsutrustning och hantering av gasen samtidigt som du slår på och av kamrarna.
4. exponerings bur och djur beredning
- Ta bort mössen från deras hus kammare och placera dem i de enskilda burar av inhalationskammaren bur rack (en bur rack för kontroll möss, en för utsatta möss). Randomize varje mus placering i bur rack dagligen för att säkerställa att varje mus exponeras homogen i exponerings kammaren. Markera varje djurs antal och bur placering i laboratoriets anteckningsbok.
- Placera varje bur rack i dess respektive kammare och Stäng kammar dörrarna.
5. genomföra en exponering
- Säkerställ att ventilen för VC-gastanken är i öppet läge. Säkerställ att utspädnings flödet för försöks kammaren är inställt på 25 L/min.
- Starta spädnings flödet i experiment kammaren. Se till att rotameter på kontroll kammaren är inställd på 25 L/min.
- Se till att alla sensorer (flöden, temperatur, fuktighet, kammartryck, CO2 -nivå) fungerar korrekt och visar förväntade resultat i både experiment-och kontroll kammare.
Obs: VC-flödet beräknas och ställs in baserat på utspädnings flödet och önskad VC-koncentration. - Se till att exponeringstiden, utspädnings flödet, VC-flödet, temperaturen, luftfuktigheten, kammartrycket, CO2 -nivån och den teoretiska VC-koncentrationen under hela exponeringen visas, graferas och registreras. Kontrollera att temperatur och luftfuktighet för kontroll kammaren också visas, graferas och registreras.
Anmärkning: om ett manuellt system används ska VC-flödet kontrolleras och justeras vid behov under hela exponeringsperioden. - Om några problem uppstår under exponeringen, Ställ in VC-flödet till noll och öka utspädnings flödet till dess maximala värde för att snabbt rensa kammaren.
- När exponeringstiden (dvs. 6 h/dag) har uppnåtts stängs programvaran automatiskt av VC-flödet. Den 15 min säkerhet timer börjar sedan för tiden efter varaktigheten för experiment kammaren för att rensa VC. När det är säkert att ta bort djuren, klicka på OK knappen i dialogrutan. Systemet stoppar inspelningen mätningar till filen och exponeringen är över.
Anmärkning: om ett manuellt system används måste användaren manuellt stänga av VC-flödet i slutet av exponerings varaktigheten och tiden för VC-clearance i slutet av exponeringen måste beräknas.
6. efter exponering
- Vrid Avstängningskranen på ventilen för VC-gastanken till stängt läge och Stäng av alla luftflöden i exponerings kammaren. Vrid rotameter tills inget luftflöde rinner genom kontroll kammaren.
- Ta bort dörrarna från varje kammare för att ge ventilationen till mössen. Ta bort bur ställningar från kamrarna. Under en huva, ta bort mössen från deras exponering burar och placera dem tillbaka i sina bostäder burar. Transportera alla möss tillbaka till sitt bostadsrum för övernattning i vanliga burar.
- Kassera allt avfall från avföring i en avdelning för miljö hälso & säkerhet (DEHS)-godkänd behållare för biologiskt farliga ämnen, eftersom dessa kan betraktas som en kemisk fara genom institutionella miljö hälsotjänster. Rengör kammarens dörrar, utsönta Pan, exponerings bur rack och exponeringskammare för experimentella och kontrollsystem.
7. validering av VC-koncentration i kammare underexponering
- Utföra en mätning av VC-koncentrationen i experiment kammaren halvvägs genom varje exponering (3 h).
- Bryt glaset tips på en VC detektor rör och en förbehandla röret. Fäst utflödes änden av VC-detektorröret till detektor rörs pumpen. Fäst flödet-i slutet av VC detektor röret till utflödet slutet av förbehandla röret med en kort bit slangar. Fäst en kort bit slangar till flödet-i slutet av förbehandla röret.
- Ta bort en kontakt från en av provtagnings portarna som ligger nära mössen andningszon. Fäst slangen från inflödes änden av förbehandling röret till provtagnings porten.
- Från fullt i läge, förlänga handtaget på kolven av detektor röret pumpen till full ut positionen. Detta kommer att dra 100 mL prov gas från kammaren till VC-detektorröret under en period av 90 s. Efter att ha väntat på 90 s, tryck tillbaka handtaget.
- Upprepa steg 7,4 tre gånger så att totalt 400 mL dras in i VC-detektorröret.
- Ta bort röret från provtagnings porten på kammaren och sätt tillbaka pluggen i porten. Undersök färgförändringen av VC-detektorröret för att kontrollera VC-koncentrationen i kammaren.
- Spela in VC-detektorns rör avläsning i laboratoriets anteckningsbok och jämför med det teoretiska värdet. Kassera VC-detektorröret och förbehandla röret i en lämplig behållare.
8. avslutande av experiment för inhalationsexponering
Anmärkning: efter önskad exponeringstid, till exempel 6, 8 och/eller 12 veckor efter inandningsexponering, avslutas experimenten och djuren kommer att avlivas (se figur 1 för tidslinje).
- Snabb möss 4 h före tiden för dödshjälp.
ANMÄRKNINGAR: denna procedur tillåter bestämning av fastande blodsocker och insulinnivåer för metabolisk analys. - Använd en dödshjälp metod som överensstämmer med American veterinärmedicinska Medical Association (AVMA) riktlinjer, såsom anestesi följt av exsanguination.
- Administrera ketamin/xylazin (100/15 mg/kg) genom intraperitoneal injektion till varje mus för att inducera anestesi.
Anmärkning: Undvik natrium pentobarbital som en pre-eutanasi bedövningsmedel, som vinylklorid exponering kan hämma dess effektivitet. - Samla blod från sämre Vena Cava i natriumcitratlösning (slutlig, 0,38%), för att förhindra blodkoagulation och för prov bevarande.
- Ta bort levern och/eller något annat önskat organ. Dissekera levern och Snap-Freeze portioner i flytande kväve, bädda in i fryst prov medium, och Fix i 10% buffrad formalin för histologi.
- Separera plasma från blod via centrifugering och överför citratplasman till ett lämpligt rör och förvara vid-80 ° c tills det behövs för analys.
- För att utvärdera histologiska index av leverskada, utföra hematoxylin och eosin (H & E) färgning med 5 μM formalin fast paraffin inbäddade lever sektioner och få bilder med ett brightfield Mikroskop.
- För att få plasmatransaminas nivåer, utför både alaninaminotransferas (ALAT) och aspartataminotransferas (ASAT) kinetiska analyser på citratplasma med kommersiellt tillgängliga kit.
Anmärkning: för kvalitetskontroll bör plasmatransaminaserna för C57Bl/6J-möss vara i det normala intervallet (35 − 45 IE/L) för LFD + VC-gruppen, medan värden bör höjas (~ 150 IU/L) för HFD + VC-gruppen (figur 3C).
Representative Results
Under loppet av experimentet, djurkroppen vikt och livsmedelskonsumtion övervakades varje vecka för att säkerställa djurens hälsa och utvärdera in vivo metabolism. Figur 3a skildrar kroppsvikt och livsmedelskonsumtion för ett 12 veckors experiment. Kroppsvikten mättes en gång per vecka och livsmedelskonsumtionen mättes två gånger per vecka för alla grupper. Alla möss fick vikt under studiens gång. Medan, som förväntat möss i HFD grupperna fick mer vikt som möss i LFD grupper, möss utsätts för VC inte få mer vikt än möss i respektive kontrollgrupp. Livsmedelskonsumtionen var inte annorlunda mellan alla grupper12,24.
I figur 3B avbildas representativa mikrofotografier av lever sektioner som färgats med H & E för analys av allmän morfologi. I LFD-gruppen orsakade VC inga öppen patologiska förändringar. HFD utfodring signifikant ökad steatos (ansamling av fett) och VC exponering ökade denna effekt. Dessutom resulterade VC-exponering i HFD-gruppen i vissa inflammatoriska Foci12,24.
Plasmatransaminas (ALAT och ASAT) nivåer mättes som indikatorer på leverskada och en förhöjd transaminas-nivå är en indikator på leverskada. I LFD-gruppen ökade VC inte transaminas-nivåerna. Enbart med HFD ökade transaminas-nivåerna och huvudsakligen VC signifikant förbättrad denna effekt (figur 3C)12,24.
Viktförhållandet mellan levern och kroppsvikten beräknades för varje grupp. HFD ökade signifikant levern till kroppsvikt nyckeltal. Emellertid, VC inte signifikant öka denna effekt (figur 3D)12.
Figur 1: översikt över förfarandet vid inhalations modellen. Möss matas respektive låg fetthalt (13% mättat fett) eller hög fetthalt (42% mättat fett) Dieter AD libitum för 1 vecka att acklimatisera dem till den renade kosten. Efter en vecka introduceras möss till inhalationsschemat. För detta placeras möss i den State-of-the-art hela kroppen inhalations kammare för exponering för en sub-OSHA nivå VC koncentration av < 1 ppm (0,85 ppm ± 0,1 ppm) eller rums luft (kontroll) för 6 h/dag, 5 dagar/vecka, för 12 veckor. Under inhalations proceduren får mössen fri tillgång till mat och vatten. Vid 12 veckor, möss är euthanized på morgonen. Denna modell kan utökas till längre perioder av kronisk exponering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: inandnings kammarens utformning. Ett diagram över ett automatiserat inhalations exponeringssystem som ger homogena toxicitets koncentrationer visas. Anpassad programvara gör det möjligt för användaren att ändra, övervaka och registrera miljövariabler under inhalations exponeringar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: vinylklorid ensamt orsakar inte öppen leverskada men förbättrar diet-inducerad leversjukdom. A) kroppsvikt och livsmedelskonsumtion övervakades varje vecka. B) representativa foikrografer av generell levermorfologi med H & E färgning visas (förstoring = 200x). (C) citratplasma samlades in i slutet av exponeringsperioden och analyserades för transaminas enzymatisk aktivitet som ett index för leverskada. D) levervikt fastställdes vid olika experimentella tidpunkter och jämfördes med hela kroppsvikten. Resultaten presenteras som medelvärdet ± SEM.a, p < 0,05 jämfört med respektive LFD-kontroll. b, p < 0,05 jämfört med frånvaro av VC. Provstorlek per grupp n = 8 − 10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Denna modell av VC-förstärkt NAFLD är en ny metod för att utvärdera effekten av sub-OSHA gräns VC exponering i ett hela kroppen inandning paradigm. Denna modell tillåter utredare att studera sub-hepatotoxiska och sensibiliserande effekter av låga nivåer av VC ensam. Faktum är att denna Co-exponering modell uppnår förbättrad leverskada, förhöjning av plasma ALAT och ASAT och måttlig inflammation, men i stort sett inte påverkar andra organsystem, såsom hjärta, vid denna koncentration23. Denna kroniska modell kräver helkropps inhalations kammare men minimerar stress och exponeringskoncentrationer. Även om det protokoll som presenteras här är en mjukvarustyrd strategi, har vår erfarenhet visat att den manuella metoden också är en korrekt och konsekvent metod för exponering12,24. Dessutom är det lätt att tillämpas på flera forskningsområden inklusive andra organskador23 orsakas av flyktiga organiska sammansatta exponering22. I synnerhet kan denna modell närmare likna patogenesen av Human Co-exponeringar mot miljö kemikalier och bakomliggande sjukdom5.
För att uppnå liknande resultat måste vissa kritiska steg i protokoll optimeringen uppnås. Utredarna måste till exempel fastställa att koncentrationen av VC eller annan toxicitet inom kamrarna ligger inom det önskade exponeringsintervallet (dvs. låg nivå, subosha eller akuta nivåer). Optimera detta steg i inhalations kammaren är avgörande för en framgångsrik modell av mänsklig exponering av intresse. För det andra kan justering av exponeringstiden per dag och experimentets varaktighet också ändras. Enligt denna grupps intresse uppnåddes en arbetsmiljö exponering, och ytterligare en parameter av diet studerades också. Miljö-och akut exponeringar kan dock också modelleras med detta protokoll.
Detta arbete utmanar paradigmet att nuvarande exponeringsgränser för VC (arbets-och miljö) är säkra. Även om den nuvarande OSHA exponeringsgränsen för VC är 1 ppm, denna modell har visat att koncentrationer av VC under denna gräns är tillräckliga för att förbättra leverskada orsakad av HFD hos möss. Detta protokoll gör det möjligt för utredare att studera och karakterisera ett nytt toxiskt exponerings paradigm och modellera TASH.
Detta är den första modellen av kronisk, lågdos VC-exponering. Tidigare arbete används mycket höga boluskoncentrationer, akuta exponeringar eller aktiva metaboliter som ersättningar för VC-exponering. Alla dessa metoder minskar relevansen av resultaten för människors exponering. Därför, denna nya modell av TASH-NAFLD interaktion ger den nödvändiga plattformen för utredare att undersöka komplexa interaktioner av lågnivå VC exponering.
Denna modell av toxicant-inducerad leverskada kan användas för andra flyktiga organiska föreningar och även för att studera andra interaktioner som kan påverka levern och andra organsystem8,22,23. Dessutom har denna modell varit, och kan vara ytterligare, används för att undersöka interventions terapier och djupgående mekanistiska studier av verkningssätt för denna utbredda toxiskt24. Som VC är en känd cancerframkallande26,27,28, denna exponering paradigm kan också ändras för studiet av VC-inducerad cancer. Andra komsjuklighet som alkoholhaltiga leversjukdom kan också förstärkas genom VC Co-exponering. Dessutom, det skulle vara av intresse att studera olika typer av fett, såsom fleromättat fett18,29,30, eller olika typer av kolhydrater31 och deras co-exponering med VC i denna modell. Faktum är att alla dessa faktorer är kända för att ha differentiella effekter på utvecklingen av leverskada och kan spela en roll i VC-inducerad leversjukdom.
Sammanfattningsvis är detta en ny inhalations modell av miljötoxicant-inducerad leverskada och etablerar en exponering paradigm för kronisk, låg nivå VC exponering. Koncentrationen av VC som används i denna modell är sub-hepatotoxiska av sig själv, medan det förbättrar leverskada orsakad av en annan faktor (HFD) hos möss. Denna modell gör det möjligt för utredarna att studera mekanismer och interventioner för kronisk VC-toxicitet och kan vara till hjälp för translationella studier som tittar på exponerade försökspersoner och med den högsta risken för exponering.
Disclosures
WT Goldsmith har ekonomiskt intresse i IEStechno, som är mallen för det beskrivna systemet. De återstående författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades genom utmärkelser från National Institutes of Health (K01 DK096042 och R03 DK107912) till Juliane Beier. Forskning stöddes också av en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under Grant Number P20GM113226 och det nationella institutet för alkoholmissbruk och alkoholism av National Institutes of Health under tilldelnings nummer P50AA024337. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
| CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
| Eosin | Sigma | E6003 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
| Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
| Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
| Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |
References
- Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
- ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
- Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
- Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
- Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer's Hepatology. Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. , Saunders. Philadelphia, PA. 476-492 (2012).
- Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
- EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
- Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
- Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
- Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
- Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
- Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
- Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. Biochemistry. 18 (23), 5177-5182 (1979).
- Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
- Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
- Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. Cancer Research. 62 (2), 5183-5188 (2002).
- Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
- Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
- Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
- Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
- Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
- Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
- IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , Lyon, France. (2008).
- IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, Pt F 9 (2012).
- Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
- Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
- Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
- Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).
