פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
רירית האדם האנושי הוא אחד הרקמות הורמונאלי ביותר בגוף והוא חיוני להקמת ההריון. רקמה זו יכולה גם להיות חולה ולגרום לתחלואה ואפילו מוות. מערכות מודל ללמוד ביולוגיה רירית הרחם האנושי הוגבלה במערכות תרבות מבחנה של סוגי תאים בודדים. בנוסף, התאים האפיתל, אחד מסוגי התא העיקריים של רירית הרחם, לא מופצים היטב או לשמור על התכונות הפיזיולוגיות שלהם בתרבות, ולכן ההבנה שלנו של ביולוגיה רירית הרחם נשאר מוגבל. יצרנו, בפעם הראשונה, אורגנואידים רירית הרחם המורכבים משני התאים האפיתל ו סטרומה של האנדורירית האנושי. אורגנואידים אלה אינם דורשים כל חומר הגרדום האקסוגני ובמיוחד לארגן כך תאים אפיתל להקיף את המבנה דמוי ספרואיד ולהיות מקוטב עם תאים סטרומה במרכז המייצרים ומפרישות קולגן. אסטרוגן, פרוגסטרון וקולטנים אנדרוגן מבוטא בתאי אפיתל, סטרומה וטיפול ברמות פיזיולוגיות של אסטרוגן וטסטוסטרון לקדם את הארגון של האורגנואידים. מערכת זו מודל חדש יכול לשמש כדי ללמוד ביולוגיה רירית הרחם נורמלי מחלות בדרכים שלא היו אפשריות לפני.
מבוא
רירית הרחם האנושי קווי החלל הרחמי ומשמש כאיש הקשר הראשון עבור העובר בזמן השרשה. רירית האנדויום מורכב של לומיאל ותאים אפיתל הבלוטות, מסטרומה, בתאי האנדותל ותאי החיסון התומכים. יחד, אלה סוגים תא להפוך את רקמת רירית הרחם שהיא אחת הרקמות התגובה ביותר כדי למין הורמונים סטרואידים1. השינויים המתרחשים בכל מחזור וסת מרשימים. הצמיחה המתאימה שיפוץ של רירית המוח נדרש כדי לאפשר השתלת העובר להתרחש. התגובה החריגה אסטרוגן ופרוגסטרון יכול לגרום לרירית הרחם עקשן כי אינו מאפשר הקמתה מוצלחת של ההריון והוא יכול גם לגרום למחלות כולל רירית הרחם neoplasia.
על מנת ללמוד את התגובות הורמון ושינויים חיוניים המתרחשים רירית הרחם, תאים מרקמות רירי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות רירית הרחם נאספו מנשים טרום גיל המעבר שעברו כריתת רחם שגרתית לתנאי הרחם שפירים באוניברסיטת נורת'ווסטרן לנשים בבית החולים, על פי הלוח סקירה מוסדית מאושר פרוטוקול. הסכמה כתובה הושגה מכל הנשים הכלולות במחקר.
1. הכנת תבניות צמח
- לפני תחילת בידוד התא, הטלת ושיווי משקל 1.5% agarose תבניות מיקרו (לוח חומרים) לבית האורגנואידים על פי הוראות היצרן.
2. הדור של מארגני רירית הרחם
- בציר סטרומה ראשוני ותאי אפיתל
- ב הקבינט אבטחה טיחות באמצעות טכניקה אספטית, להכין פתרון אנזים (2.5 mg/ml כגון הסוג אני + 0.1 mg/ml dnase אני ב 10 מ ל של dispase [500 יחידות]) ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תרשים שרטוט של הפרוטוקול מתואר באיור 1. רקמת הרחם הושגה מהניתוח לאחר שנבדק על ידי פתולוגים. רירית רירית הרחם הופרד מ myometrium על ידי גירוד ואת רקמת רירית הרחם היה מתעכל בהתאם לתאים כפי שמתואר בפרוטוקול. תאים אפיתל וסטרומה נוספו למיקרוגל בתבניות agarose. לאחר שבעה ימים בתרבות, טופלו בארגון E ו-T במשך 7-14 ימים נוספים.
לעיבוד היסטולוגית, התבניות המאובנת המכילות אורגנואידים של רירית הרחם נסגרו בעקבות הקיבעון באמצעות קיבוע של 4% בעלי לילה. תבניות אלה עובדו עבור הטבע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יצרנו אורגנואידים רירית האדם מורכב של תאים אפיתל ו סטרומה של רירית הרחם ללא שימוש בחומרים לגרדום אקסוגני. אמנם זה כבר הוכח כי תאים הראשי האפיתל רירית הרחם יכול ליצור אורגנואידים6,7, תאים אלה היו מוטבעים במטריצה ז'לטין של חלבונים שמופרשים על ידי תאי סרקומה של העכבר (ראה טבלת חומרים) כדי לעזור יצירת מבנים דמוי ספרואיד. בנוסף, תאים סטרומה רירית הרחם נעדרו. אנו משערים כי התאים סטרומה במערכת שלנו, שהיא מרכיב תומך חיוני של רקמת רירית הרחם, בתנאי הפיגום.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
מחקר זה מומן על ידי הUG3 מענק (ES029073) ובית הספר נורת'ווסטרן פיינברג לרפואה גשר של הקרן (JJK). היינו רוצים להכיר את מתקן ליבת הפתולוגיה הצפון-מערבי לעיבוד האורגנואידים הקבועים להטבעת פרפין. היינו רוצים להכיר בצוות הUG3 כולו, כולל מעבדות וודרוף, בורדט ואורנק לדיונים ושיתופי פעולה בתובנה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agarose HS, ביולוגיה מולקולרית בדרגה | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| תבניות אגרוז | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| אמוניום כלוריד (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| קולגנאז, סוג II, אבקה | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| כתם אוזין | VWR | 95057-848 | |
| קולטן אסטרוגן (SP1), נוגדן חד שבטי ארנב | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield עם DAPI, מדיום הרכבה היסטולוגי | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום |
| תמיסת כתמי המטוקסילין | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | ניסוח האריס שונה, |
| תמיסת הפרין | STEMCELL Technologies | 07980 | נוסף למדיה של MammoCult |
| פתרון מלאי הידרוקורטיזון | STEMCELL Technologies | 07925 | נוסף למדיה של MammoCult |
| מדיה אורגנואידית - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | בתוספת 2 ומיקרו; L/mL הפרין ו-5 ומיקרו; L/mL הידרוקורטיזון |
| פרפורמלדהיד, תמיסה 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | תרמו פישר | 15140122 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט, pH 7.4 | קולטן פרוגסטרון Sigma-Aldrich | P3813 | |
| PgR 1294, לא מצומד, תרבית סופרנטנט | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| מטריצת חלבון - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| נוגדן נגד E-cadherin עכבר מטוהר | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| נוגדן אנטי-וימנטין רקומביננטי [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| ערכת ליזה ובידוד RNA | Zymo Research | R2060 | |
| נתרן ביקרבונט (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| טסטוסטרון | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| טריכרום כתם | Abcam | ab150686 | |
| סרט שעווה - Parafilm | VWR | 52858-000 |
מקורות
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualizati....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
