上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト子宮内膜は、体内で最もホルモン応答性の組織の一つであり、妊娠の確立に不可欠です。この組織はまた、病気になり、罹患率、さらには死を引き起こす可能性があります。ヒト子宮内膜生物学を研究するモデルシステムは、単一細胞型のインビトロ培養系に限定されている。また、子宮内膜の主要な細胞型の一つである上皮細胞は、培養中に生理的形質をうまく伝播したり保持したりしないため、子宮内膜生物学に対する理解は限られています。ヒト子宮内膜の上皮細胞と間質細胞の両方からなる子宮内膜オルガノイドを初めて生成しました。これらのオルガノイドは、外因性足場材料を必要とせず、上皮細胞がスフェロイド様構造を包含し、コラーゲンを産生し分泌する中心の間質細胞と偏光するように特異的に組織化する。エストロゲン, プロゲステロンおよびアンドロゲン受容体は、上皮および間質細胞で発現され、エストロゲンとテストステロンの生理学的レベルで治療は、オルガノイドの組織を促進します.この新しいモデルシステムは、以前は不可能だった方法で正常な子宮内膜生物学と疾患を研究するために使用することができます。
概要
ヒト子宮内膜は子宮腔を直線し、移植中に胚の最初の接触として機能する。子宮内膜は、ルミナルおよび腺上皮細胞、支持性間質線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞から構成される。一緒に, これらの細胞タイプは、性ステロイドホルモン1に最も応答性の組織の一つである子宮内膜組織を構成します。.各月経周期の間に起こる変化は顕著です。子宮内膜の適切な成長および改造は、胚移植が起こることを可能にするために必要とされる。エストロゲンおよびプロゲステロンに対する異常な応答は、妊娠の確立を可能にしない難治性子宮内膜をもたらし、子宮内膜新生物を含む疾患をもたらす可能性さえある。
子宮内膜で起こるホルモン応答および本質的な変化を研究するために、手術中または子宮内膜生検中に患者から取り除かれた子宮内膜組織からの細胞は、細胞培養において伝播されている。子宮内膜間質細胞は、好ましく増殖し、容易に伝播し、プロゲステロンによって誘導される分化のプロセスは、インビトロで要約することができる。その結果、この分化プロセスの間に多くのことが学び、デシデュアル化2、3と呼ばれる。しかし、子宮内膜の他の主要な細胞型は、発光および腺上皮細胞は、従来の単層と同様に成長せず、極性を失い、老化し、増殖性が限られている。その結果、ヒト子宮内膜における生物学およびその役割につい....
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プロトコル
子宮内膜サンプルは、ノースウェスタン大学プレンティス女性病院で良性子宮状態のための日常的な子宮摘出術を受けている閉経前の女性から採取された。書面による同意は、研究に含まれるすべての女性から得られた。
1. アガロース金型の調製
- 細胞の単離を開始する前に、鋳造し、メーカーの指示に従ってオルガノイドを収容するために1.5%アガロースマイクロ金型(材料のテーブル)を平衡化します。
2. 子宮内膜オルガノイドの生成
- 一次間質および上皮細胞の収穫
- 無菌技術を用いてバイオセーフティキャビネット内で、酵素溶液(2.5mg/mLコラゲナーゼI+0.1mg/mL DNase I 10mLのディスパーゼ[500単位])を37°Cで調製し、0.2μmシリンジフィルターを用いて溶液を15mLに無菌フィルターします。
- 無菌技術を用いたバイオセーフティキャビネットでは、子宮生検や軟体組織から子宮内膜をこすり落とし、フードの下の軟体組織をメスで非常に小さな部分にします。
注:少なくとも20mm x 10 mm x 1 mmである子宮内膜組織は、十分な数のオルガノイドを生成するために必要とされる。 - 15 mL円錐管で酵素溶液にみじん....
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結果
プロトコルの概略図を図 1 に示します。子宮組織は病理学者によって検査された後、手術から得られた。子宮内膜の内層を掻き取ることによってミオメリウムから分離し、子宮内膜組織をプロトコルで概説したように細胞に酵素的に消化した。上皮および間質細胞をアガロース型のマイクロウェルに添加した。培養7日後、オルガノイドをさらに7−14日間EおよびTで処理した。
組織学的処理のために、子宮内膜オルガノイドを含むアガロース型をアガロースで密封し、続いて一晩4%のPFAで固定した。これらの型は、標準的なパラフィン埋め込みのために処理され、組織学、免疫蛍光または免疫組織化学のために切り分けおよび染色された。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色(図2A)は、外側と中心の細胞を裏打ちする単層の球体を持つスフェロイド状構造を明らかにした。子宮内膜上皮(E-カドヘリン)および間質細胞(ビメンチン)に対する細胞特異的マーカーは、中心に間質細胞を有するオ.......
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ディスカッション
外因性足場材料を用いずに子宮内膜の上皮細胞と間質細胞からなるヒト子宮内膜オルガノイドを生成した。原発性子宮内膜上皮細胞がオルガノイド6、7を形成できることが既に示されているが、これらの細胞はマウス肉腫細胞によって分泌されるタンパク質のゼラチン状マトリックスに埋め込まれた(材料の表を参照)。球状構造を形成する。また、子宮内膜間質細胞は存在しなかった。我々は、子宮内膜組織の必須支持成分である我々のシステムの間質細胞が、細胞型間で上皮細胞が付着しパラクリンシグナル伝達を行うための足場を提供したと推測する。間質細胞の周りの上皮細胞の組織は、生理学的手がかりを提供した2つの細胞タイプ間の活発な相互作用を示した。子宮内膜のホルモン応答は、上皮細胞と間質細胞4,8,9間のパラクリン相互作用に依存するとして、私たちの多.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
本研究は、NIEHS/NIH/NCATS UG3助成金(ES029073)とノースウェスタンファインバーグ医学部ブリッジ基金(JJK)が資金提供を受けました。パラフィン埋め込みのための固定オルガノイドを処理するためのノースウェスタン病理学コア施設を認めたい。ウッドラフ、バーデット、アーバネックのラボを含むUG3チーム全体に対して、洞察に満ちたディスカッションとコラボレーションを行いたいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロースHS、分子生物学グレード | デンビルサイエンティフィック | CA3510-6 | |
| アガロース金型 | シグマ-アルドリッチ | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| 塩化アンモニウム (NH<サブ>4Cl) | アムレスコ | 0621 | |
| β-エストラジオール | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| コラゲナーゼ、タイプ II、粉末 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 17101015 | |
| ディスパーゼ | コーニング | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | フィッシャーサイエンティフィック | BP120-1 | |
| エオシン染色 | VWR | 95057-848 | |
| エストロゲン受容体(SP1)、ウサギモノクローナル抗体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | RM-9101-S | |
| DAPI付きフルオロシールド、組織学封入剤 | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| ハンクス平衡塩溶液(HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない |
| ヘマトキシリン染色液 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 3530-32 | 改変ハリス製剤、水銀フリー |
| ヘパリン溶液 | STEMCELL Technologies | 07980 | が MammoCult 培 |
| ヒドロコルチゾンストック溶液 | STEMCELL Technologies | 07925 | が MammoCult 培地 |
| に追加 オルガノイド培地 - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | 2 & micro;L / mLヘパリンおよび5 µL/mL ヒドロコルチゾン |
| パラホルムアルデヒド、16% 溶液 | 電子顕微鏡 | Sciences 15710 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 15140122 | |
| リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| プロゲステロン受容体、PgR 1294、非抱合型、培養上清 | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| タンパク質マトリックス - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| 精製マウス抗E-カドヘリン抗体 | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| 組換え抗ビメンチン抗体 [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA溶解および単離キット | Zymo Research | R2060 | |
| 重炭酸ナトリウム (NaHCO3) | シグマ-アルドリッチ | S6014 | |
| テストステロン | シグマ-アルドリッチ | 86500 | |
| トリクロームステイン | アブカム | ab150686 | |
| ワックスフィルム-パラフィルム | VWR | 52858-000 |
参考文献
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualizati....
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