Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

אנו מתארים את גישת ההדמיה לקביעת המצב oligomeric הממוצע של megfp-מתויג-קולטן מתויגים oligomeric הנגרמת על ידי ליגנד קשירה ממברנה פלזמה של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B).

Abstract

למרות החשיבות והייתה של הקולטן, שיטות מעטות ישימות לגילוי אירועים באשכולות ומדידת מידת הקיבוץ. כאן, אנו מתארים גישה להדמיה כדי לקבוע את המצב oligomeric הממוצע של mEGFP-מתויג-קולטן הומוקומפלקסי בקרום של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B). N & B היא שיטה דומה ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS) והיסטוגרמה ספירת פוטון (PCH), אשר מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של fluorophores מפזרת פנימה והחוצה של תאורה אמצעי אחסון במהלך זמן התבוננות. בפרט, N & B הוא פישוט של PCH כדי להשיג מידע על המספר הממוצע של חלבונים בתערובות oligomeric. תנודות אינטנסיביות המוני מתוארים על ידי בהירות מולקולרית של fluorophore ואת המספר הממוצע של fluorophores בתוך עוצמת התאורה. כך, N & B רואה רק את הרגעים הראשונים והשני של התפלגות משרעת, כלומר, את העוצמה הממוצע ואת השונות. זה, באותו זמן, את הכוח והחולשה של השיטה. כי רק שני רגעים נחשבים, N & B לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל זה רק מעריך את מצב oligomeriטיזציה הממוצע של התערובת. עם זאת, זה יכול להיות מיושם על סדרת זמן קטן יחסית (לעומת שיטות רגע אחר) של תמונות של תאים חיים על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות הזמן של עוצמת הקרינה. זה מפחית את הזמן האפקטיבי לפיקסל לכמה מיקרו שניות, המאפשר רכישה בטווח הזמן של שניות לאלפיות השניה, אשר הכרחי עבור הקינטיקה מהירה של oligomerization. לבסוף, שטחי תאים גדולים כמו גם תאים תת סלולריים ניתן לחקור.

Introduction

אנו מתארים כולל השתקפות פנימית מספר ובהירות (TIRF-N & B) גישה להדמיה לקביעת מצב oligomeric הממוצע של מולקולות הקולטן בקרום פלזמה של תאים חיים, מכוון בקישור הרכבה הקולטן דינמיקה לתפקוד הביולוגי של החלבונים (איור 1).

עם ליגתאי ומחייב, קולטנים ליזום את האות תאיים התמרה האותות בהתאם הקונפורמציה שלהם, oligomerization, שיתוף הפוטנציאלי קולטנים והרכב קרום. למרות החשיבות והייתה של קולטן oligomerization, מוכר כאירוע מפתח באיתות סלולרי1,2,3,4,5,6, 7, כמה שיטות יכול לזהות אירועים באשכולות ולמדוד את מידת הניסויים באשכולות8,9. כרך קונפוקלית וקד (x, y ≈ 300 ננומטר, z ≈ 900 nm) הוא פתר מספיק להוכחת אינטראקציה מולקולרית וסטויכמטריה, גם לאחר אופטימיזציה על ידי אלגוריתמים שיקום התמונה10. הרכב התת-יחידתי של חלבון oligomers אינו ניתן לפענוח על בסיס מרחבי גרידא גם על ידי שיטות ברזולוציה גבוהה ב-x, y ברזולוציה של 20-70 ננומטר כגון PALM11, סטורם12, ו ההיסטד13. יתר על כן, הרזולוציה הטמפורלית שלהם (בסדר של דקות לכל תמונה) לא יכול לעקוב אחר הקינטיקה בטווח של שניות. מולקולה בודדת צעד הלבנת פותרת את סטויכיומטריה של oligomers חלבון רק אם הם משותק14.

אחת השיטות הרב-תכליתיות ביותר כדי למדוד צפיפות ו oligomerization של חלבונים מתויגים פלואורוסקופים בתוך תמונות בודדות היא התפלגות בעוצמה מרחבית ניתוח (SpIDA), אשר נשענת על דגימה מרחבית. הוא חל על תאים כימיים קבועים ולחיות, ומאפשר ניתוח של מספר אזורים של העניין של התא בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ קרינה רגילה15. לחילופין, שיטות רגע, כגון ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (fcs)16, היסטוגרמה לספירת פוטון (PCH)17, ומספר ובהירות (N & B)18,19, מתאימים לאולייומר כמותית דידות. שיטות אלה לנתח תנודות בעוצמה פלואורסצנטית כי ניתן להבחין בזמן כאשר fluorophores לפזר והחוצה של נפח התאורה. המוני התנודות באינטנסיביות ניתן לתאר באופן ייחודי על-ידי הבהירות המולקולרית של הזוהר (ε) והמספר הממוצע של fluorophores (n) בתוך כרך התאורה17 (איור 2). בדרך כלל, מקדם דיפוזיה של fluorophores ואת המספר הממוצע של מולקולות (הקשורים באופן הפוך לערך G (0) בתוך עוצמת התאורה ניתן להשיג על ידי FCS20. עם זאת, מאז זמן הדיפוזיה רק עם השורש העוקב של המסה, FCS אינו רגיש מספיק כדי לזהות שינויים במסה מולקולרית21. בפועל, לצבע אחד FCS אין אפשרות לזהות הדיסמזציה של קולטני הממברנה. PCH פותר תערובות של oligomers שונים במדויק. באמצעות יותר משני רגעים של התפלגות משרעת, הוא מזהה מולקולות של בהירות שונה התופסים את אותו נפח תאורה. סריקת FCS22 ופיתוחים, כגון מתאם זוג מעניין של בהירות מולקולרית (pcomb) גישה23, הציג כדי להאריך את מגוון הישימות של שיטות מתאם פלואורסצנטית במערכות ביולוגיות24 , השארו שיטות חד שונות חסרות יכולת של מדידות מהירות בשטח גדול של תא, הדורשות תצפיות רצופות רבות בכל פיקסל ורכישת נתונים בסדר השניות.

N & B הוא גרסה פשוטה של PCH הרואה רק את הרגעים הראשונים והשני של משרעת התפלגות הזריחה, כלומר את העוצמה ממוצע, < אני >, ואת השונות, σ2 (איור 2)18,19 ובגלל זה, זה לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל רק מעריך את המצב הממוצע oligomeriטיזציה של התערובת. עם זאת, N & B יש את היתרון של עבודה עם סדרת זמן קטן יחסית של תמונות של תאים חיים מאשר PCH על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות בזמן של עוצמת הקרינה. כיוון ש-N & B מפחית את הזמן בפיקסל למספר מיקרו-שניות, הוא יכול לעקוב אחר מהירות הקינטיקה המנותרת באזורי תאים גדולים, ולאפשר רכישת תמונה בסרגל זמן של שניות במיקרוסקופ סריקת רסטר (למשל, confocal וקד, 2-פוטון) ואלפיות השניה במיקרוסקופיה המבוססת על מצלמה (למשל, TIRFM).

מספר דוחות הפגינו את היכולת של N & B כדי לכמת את מספר יחידות המשנה באשכולות חלבונים על-ידי הדמיה של אזורי תאים מורחבים. אשכולות פעבלין-EGFP זוהו באתרי הדבקה ב-CHO-K1 תאים25, והצבירה התאיים של הפפטיד Httex1p הפתוגניים תוארה ב-COS-7 תאים26. N & B הוחל לאחר oligomerization מונחה ליגאן של הקולטן ErbB27, ואת ההשפעה של ליגFGF21 על קלותוב (klb) ו FGFR1c בתאי הלה28. השילוב של הדמיה TIRF ו-N & B ניתוח שימש כדי להראות כי דינמיות ב-2 היא בעיקר tetrameric לאורך כל קרום התא29. החלתי N & B לשני סריקת רסטר ותמונות tirf להוכיח dimerization מונחה ליגור של upar ו FGFR1 תא קולטנים קרום30,31.

שיטות מתאם פלואורסצנטית, כגון N & B, FCS ו-PCH, מבוססות על הרעיון שבנפח פתוח מספר הכיבוש של החלקיקים עוקב אחר התפלגות פואסון. כי רק את הפוטונים כי פולטות fluorophores ניתן להבחין, ערך ממוצע של עוצמת הזריחה נמדד לעומת הזמן בפיקסל של התמונה ,, הוא התוצר של המספר הממוצע של fluorophores נפח התאורה, n, ואת ה בהירות מולקולרית, ε17:

כאשר ε מבוטא כמספר הפוטונים הנפלטים ליחידת זמן (מקובל לשניה) לכל מולקולה כאשר המולקולה נמצאת במרכז עוצמת התאורה.

בהירות היא תכונה של כל fluorophore ברכישה נתונה להגדיר, בעוד האינטנסיביות הוא הסכום של כל התרומות מכל fluorophores. בתחרויות ביולוגיות, הבהירות יגדל עם הגידול של מספר fluorophores המתאחד יחד, נותן מידע על המצב oligomerization של חלבון fluoresc, מתויג. מגביר תנודות בפיקסל נתון נמדד מן השונות של האות הפלואורסצנטית, σ2:

כאשר המשמעות של ריבוע העוצמה , והריבוע של העוצמה , מחושבים מערכי העוצמה האינדיווידואליים בכל פיקסל בכל מסגרת:

כאשר K הוא מספר המסגרות הכוללות בסידרת הזמן. ניסויים, יש צורך לחשב עבור סדרת התמונות כולה את השונות המתארת את פיזור ערכי העוצמה הבודדת בכל פיקסל של תמונה אחת סביב ערך העוצמה הממוצע. השונות כוללת את כל התנודות במקורות שונים. בקירוב ראשון, השונות הנובעת מהחלקיקים הניתנים לפיזור בעוצמת התאורה, σ20, יכולה להיות מופרדת מן השונות עקב רעש שוט הגלאי, σ2ד. שני השונויות הן עצמאיות; לפיכך, השונות הכוללת ניתנת על-ידי הסכום שלהם:

השונות, עקב תנודות מולקולריות של עוצמת האיתור והיציאה, תלויה בצורה לינארית בבהירות ובעוצמה המולקולרית:

מסידור מחודש של eq 6 לפי eq .1:

על פי המושג האופייני ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית, משוואה 7 קובעת כי השונות בשל מספר התנודות תלויה בריבוע של בהירות החלקיקים.

לאחר מכן, השונות עקב תנודות גלאי היא פונקציה קווית של העוצמה שזוהתה, תחת ההנחה כי הגלאי מופעל מתחת למגבלת הרוויה שלה19:

במקרה של גלאים של ספירת פוטון a= 1 ו- c= 0, ולכן שונות הגלאי שווה לעוצמה הממוצעת:

כדי להחיל מושגים אלה על מדידות אמיתיות בתאים חיים, Gratton ועמיתים18 להגדיר את הבהירות לכאורה, B, עבור כל פיקסל כיחס של שונות על העוצמה הממוצעת:

B הוא הפרמטר הנמדד באמצעות הניסויים. בעבודה זו, סדרת הזמן תמונות של קולטני FGFR1 בקרום פלזמה של תאי הלה נלכדים על ידי מיקרוסקופ TIRF ואת הבהירות לכאורה הממוצעת, B, נקבעת על ידי ניתוח N & B. לאחר מכן, לאחר הוספת FGF2, סדרת הזמן ברציפות נלכדים לבצע את השינויים העצמית הרכבה של מולקולות הקולטן במשטח הקרום לאחר גירוי של הקולטן עם ligand קאנוני.

עם זאת, מאז גלאי המיקרוסקופ TIRF הוא מצלמה EMCCD, הביטוי לבהירות לכאורה צריך להיות שונה19:

כאשר היסט הוא היסט האינטנסיביות של האלקטרוניקה לאיתור שהוא מאפיין של הגדרות הגלאי. השונות והעוצמה הממוצעת עבור גלאי אנלוגי ניתנות בהתאמה על-ידי:

כאשר G הוא רווח אנלוגי ברמות דיגיטליות (DL/פוטונים), S, הרמות הדיגיטליות לכל פוטון19, ניתנת על ידי השיפוע של עוצמה לעומת מזימה שונות עבור מקור אור עם עוצמה מתמדת (אין תנודות בזמן). הפקטור הγ קשור לצורה של אמצעי האחסון לזיהוי פיקסלים. לדברי האסלר ואח '32, הפקטור γ שווה 0.3 עבור הדמיה tirf עבודה ברווח המקסימלי של מצלמת האיתור19. היסט, S ו-G פרמטרים הם מאפיינים של המצלמה ואת המיקרוסקופ. הבהירות לכאורה, B, מתקבלת על ידי סידור משנה של eq. 11 לפי eq .12 ו -13:

ניסויים, ε היא פונקציה מורכבת של עוצמת לייזר ויעילות הזיהוי של המערכת. עם זאת, מאחר ש-B/S תלוי באופן ליניארי ב ε, חשוב רק לקבוע את הערך היחסי של ε עבור מצב זיהוי נתון:

כאשר ε ' הוא פרופורציונלי לε. עדיין, כיול מבוצע באמצעות הפניה פנימית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה לדוגמא

  1. . היום הראשון זרעים הלה התאים בינוני מלא בריכוז של 100,000-200000 cell/mL במנות התחתון זכוכית. . זרע 6-8 משכפל מנות
    הערה: בדוגמה זו, המדיום הוא שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל סרום שור העוברי (FBS), 1 mM נתרן פירובט, 100 U/100 μg פניצילין/סטרפטומיצין. מספר מנות שכפול מוכנות.
  2. . היום 2-3 כאשר התאים הם בשטף משנה, מחצית מנות הכלים עם הפלסמיד החלבון והמחצית השנייה עם התייחסות פלמידים (מונומר ו dimer), במדיום ללא סרום.
    הערה: החצייה מורכבת מסרום בינוני בחינם בתוספת אנטיביוטיקה, 0.1% מאגר העור של סרום והוא 25 מ"מ, ללא פנול אדום.
  3. . היום 3-4 בדוק כי תאים מזוהמים הם מחסיד לתחתית הכלים ואת קרום התא הוא פלורסנט. התעלם מכלים עם תאים מגודלים או עם זריחה נמוכה מאוד.
    הערה: אל תתנו לתאים לצמוח יותר מדי. התאים חייבים להיות מבוזרים היטב ולהיות מדבקה לאזור הזכוכית של המנה (איור 1א). מנות זכוכית מצופות מראש ניתן להשתמש כדי להעדיף הדבקה תא. תרבות התא נבדקת לזיהום mycoplasma לפני כל ניסוי. בדוגמה זו, תאים מצוידים עם a (A207K) mEGFP-FGFR1 פלמיד ואת התאים התייחסות הם מזוהמים עם GPI-(A207K) mEGFP ו GPI-(A207K) mEGFP-(A207K) ממגה פלמידים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור מיקרוסקופ תאים חי, מומלץ מדיום נטול מחוון; מאגר HEPES 25 מ"מ נוסף כדי למנוע שינויי pH במהלך ההדמיה.

2. הדמיה TIRF – יישור קו הלייזר ואופטימיזציה של תאורה TIRF

  1. 4 שעות לפני הניסוי, להפעיל את החממה טמפרטורה של המיקרוסקופ ב 37 ° c.
  2. הפעל את המיקרוסקופ, מחשבים ומצלמות ולחכות המצלמות להגיע לטמפרטורת העבודה הנכונה.
    הערה: טמפרטורת העבודה של המצלמה המשמשת במחקר זה היא-75 ° c.
  3. הניחו טיפת שמן קטנה על המטרה. . שים צלחת דגימה במקומה סגרו את דלתות החממה והרשו לטמפרטורת המנה להיות מעורפלת (~ 10 דקות).
  4. הפעל את המנורה האפינטית ואת לייזר 488 ננומטר.
  5. בחר במצב ניגודיות אפיפלואורסצנטית כדי לחקור את המדגם, חיפוש בתא כדי להתמקד מן העינית.
    הערה: השימוש במנורה פלורסנט לחיפוש שוקת בתאי העינית אינה חובה. במקום זאת ניתן להשתמש בקו לייזר מתאים.
  6. בחר את המסנן המתאים לאיסוף הפליטה הירוקה דרך מצלמת המיקרוסקופ (הלהקה Pass לשעבר 490/20 (500) הלהקה להעביר Em 525/50, או דומה.
  7. לעבור מתוך העינית ליציאת המצלמה (המצלמה #1 באיור 1) במצב epiפלואורסצנטית, למקד את המוקד ולשנות למצב tirf. מצבי מסוג אפיטאין ומצב TIRF עשויים להיות בעלי שם עם מינוח שונה בהתאם למותג של המיקרוסקופ.
    הערה: ייתכנו בעיות התמקדות או יישור לייזר אם אין סמנים פלורסנט בממשק coverslip. כדי ליישר את הלייזר כראוי (חיוני עבור TIRF טוב), להתמקד על coverslip. לעתים קרובות קשה מאוד לקבוע אם הcoverslip בפוקוס. כהצעה, התמקד בקצות התאים.
  8. הפעל את היישור האוטומטי בעקבות הוראות מיקרוסקופ TIRF.
    הערה: בקצרה, עבור צעדים מ 2.4 כדי 2.8, תחילה למצוא את התאים דרך העינית ולהתמקד בהם, ולאחר מכן לשלוח את הפליטה ליציאת המצלמה של מיקרוסקופ TIRF, למקד מחדש את התאים על מסך המחשב במיקרוסקופ ולהפעיל את ההליך עבור יישור לייזר. היישור מורכב ממציאת הזווית הקריטית שבה התאורה הופכת לאוונהאור (איור 3). מיקרוסקופים מסחריים עשויים להיות בעלי פרוטוקולי יישור שונים במקצת וגם להיות אוטומטיים לחלוטין; אחרים עשויים להיות מצלמה קטנה להקלה על ויזואליזציה של תנאי זווית קריטית.
  9. בחרו עומק תאורה מתאים ומטב את כיוון שדה האוונ, (איור 3).
    הערה: עומק החדירה נשמר קבוע עבור כל הפקדים והדגימות.

3. הדמיה TIRF: לכידת סדרת הזמן

  1. הגדר אזור מעניין (ROI) של לפחות 256 x 256 פיקסלים.
    הערה: בהגדרה זו, הלכידה מתבצעת עם #2 המצלמה תחת תוכנה השולטת ישירות על המצלמה (ראה איור 1 מקרא).
  2. הגדר את החשיפה ל-1 אלפיות הראשונה ול1,000 EM (מדובר בפקטור G ב-eq .12 ו-13). במהירות כזו, ייתכן שיהיה צורך לכוונן או להגדיל את כוח הלייזר. כאן כוח לייזר הוא 0.5 mW.
    הערה: בהתאם לסוג של המצלמה ואת המגבלות המוטלות על ידי מקדם דיפוזיה של החלבון, העוצמה הפלואורסצנטית והרקע, הקריטריונים הכלליים לקביעת כוח הלייזר הם לא להרוות את הגלאי, למזער את הלבנת התמונות, וללכוד כמו מהיר ככל האפשר ב-S סבירים/N. הרווח ה-EM מוגדר תמיד למקסימום של המצלמה (ראה מבוא).
  3. הפעל רצף ניסיון ראשון תחת תנאים ראשוניים והערכת ערך S/N בערך. התנאים מקובלים ב-S/N = 2-3 או יותר, כפי שנמדד במסגרת הראשונה של סדרת הזמן הראשונה.
  4. השתמש במחוון של מערכת הפליטה פיצול מצלמה המחבר #2 למיקרוסקופ עבור המסיכה של צד של התמונה (איור 1B, איור 4א-ב)
    הערה: בהגדרה זו מחבר הדמיה רב-ערוצית מותקן במצלמה #2 כדי לאפשר רכישה של שתי תמונות זהות בו. המערכת מצוידת בשקופיות להרכבת מסנני פליטה שונים. אחד המחוונים טוען מסיכה שחורה כדי לכסות צד של התמונה. האזור עם המסיכה משמש לכיול הפנימי של כל סדרת הזמן, כדי לקבוע את פרמטרי המצלמה (eq .12 ו-eq .13). בדרך זו אין צורך בצעד כיול עצמאי, וחשוב מכך, כיול מבוצע במקביל ללכידת כל סדרת הזמן. בהעדר מערכת זו, ניתן לכייל את המצלמה להחלת פרוטוקולים שפורסמו33.
  5. בחר את אפשרות השמירה האוטומטית של קובץ המצלמה.
  6. התחל את הרכישה של סדרת התמונות. השג מינימום של 700 מסגרות ביחס S/N מינימלי של 2.
    הערה: מספר המסגרות הנחוצות לניתוח תלוי ביציבות המדגם לפוטולבנת ובפיזור הנתונים. לכן, האיכות של כל סדרת זמן מוערך במהלך ניתוח N & B.
  7. , בלי להוציא את הצלחת ממיקרוסקופ. הוסיפו את הליגורק
  8. בחר תא עם קרום זריחה בהיר במהירות להתחיל את סדרת הפעם הראשונה של הפעלה קינטית.
    הערה: אם התוספת של הליומתבצעת במהירות, הלכידה הראשונה מגדירה את הנקודה = 0 זמן של ליגו הקינטיקה. התוכנה רושמת את הזמן המדויק של הלכידה.
  9. חיפוש תא שני ולרכוש את נקודת הזמן השנייה של הקינטיקה.
    הערה: רוטינות ביקור נקודה זמינות בכמה מיקרוסקופים מצויד x, y, z בשלבים ממונעים. אלה מאפשרים שינון של תפקידים מרובים על צלחת התא, והוא יכול לעזור לשמור על מרווח קבוע יותר של זמן בין סדרת תמונות על תאים שונים.
  10. לכוד תא חדש לכל נקודת זמן של הפעלה קינטית.
    הערה: לאחר הלכידה, תא מולבן באופן חלקי ואינו ניתן לדימות מחדש. בגלל זה, הקינטיקה מושגת על ידי שילוב של סדרת הזמן של תאים רבים, כל אחד נלכד בנקודת זמן שונה.
  11. עבור כל מנה חדשה, חזור על הפרוטוקול משלב 2.3 עד 3.9.
    הערה: לקבלת מנות התייחסות, להוסיף נפח של הרכב (PBS בתוספת עם 0.01% בסרום פרה אלבומין) שווה ערך לזה המשמש את ligand.

4. מספר & בהירות (N & B): בדיקת איכות של סדרת הזמן

  1. המר ושמור בשם. TIFF הקבצים שנרכשו עם תוכנת המצלמה (קבצי. sif בדוגמה זו).
  2. ייבוא. קובצי TIFF בשגרת תוכנת הניתוח על-ידי הפעלת ממשק המשתמש הגרפי N & B (GUI) MATLAB.
    הערה: משתמשים כאן בMatlab הפעלה מותאמת אישית N & B שגרה כאן (ניתוח N & B ב-https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). על-ידי פתיחת מיובא. TIFF, השגרה יוצרת את תמונת העוצמה הממוצעת, פרופיל העוצמה הממוצע, והיא מאפשרת בדיקה על הסדרה מסגרת אחר מסגרת (איור משלים 1). תוכנות אחרות זמינות לניתוח N & B (לדוגמה, תוכנת SimFCS).
  3. השמט סדרה שפרופיל העוצמה הממוצעת מציג יותר מ-10% photobleaching לבנה, והסדרה שבה היתה עיוות תא בולט או תרגום ממברנה במהלך הרכישה.
  4. חיתוך מסגרות שאינן מתמקדות בעליל.
    הערה: כלי חיתוך מיושם בשגרה כדי לוחק מסגרות בודדות או מרובות בתוך סדרת התמונות. פעולה זו מותרת מכיוון שזמן מסגרת למסגרת אינו קריטי בעוד שזמן השימוש בפיקסל (זמן חשיפה) הוא (ראה דיון).
  5. לשמור על הניתוח רק סדרה עם לפחות 500 מסגרות זמן.

5. מספר & בהירות (N & B): קביעת פרמטרי המצלמה (היסט, σ ו-S)

  1. הפעל את מצלמת כיולהשגרה.
  2. בחר שטח של לפחות 20 x 50 פיקסלים באזור הרעש של הגלאי (איור 4).
    הערה: השגרה מקורו בהיסטוגרמה של הערכים (הוגדרה גם ' רמה דיגיטלית ', DL) ומחזירה מגרש לוגריתם בתדר לעומת רמות דיגיטליות.
  3. בתדר יומן הרישום לעומת מגרש ברמה הדיגיטלית, הזז את הסמן האדום הליניארי כדי להפריד את התרשים הגאוסיאני והחלק הליניארי של העקומה.
    הערה: הסמן האדום מחלק את שני החלקים של העקומה, ומפעיל את השגרה המחזירה את ההיסט, המהווה את מרכז הפונקציה הגאוסיאנית של תגובת המצלמה, את הσ של ההתאמה הגאוסיאנית ואת הפקטור S, שהוא השיפוע של החלק הליניארי של המצלמה e (איור 4C-D).

6. מספר & בהירות (N & B): חישוב ערכי B באזור נבחר-of-הריבית (ROI)

  1. הפעל את מקש B .
    הערה: פעולה זו יוצרת את תמונת העוצמה הממוצעת (איור 5, עמודה ראשונה) ותמונת B שבה כל ערך b משויך לפיקסל הקשור בתמונה (איור משלים 1).
  2. החל מינימום (2 2) כדי להקטין את פיזור הנתונים וכלה בהפקת היסטוגרמה B-I (איור 5, עמודה שנייה).
    הערה: ההיסטוגרמה B-I מייצגת את התפלגות ערכי B של כל הפיקסלים בתמונה לעומת עוצמת הפיקסל. Y = B/S; X = ( -היסט)/S (איור משלים 1 ו-eq .11 ו -15).
  3. בדוק את ההיסטוגרמה B-I באמצעות הסמן הריבועי האינטראקטיבי.
  4. בחר ROI מרובע עבור הניתוח (איור 5, עמודה שלישית).
    הערה: הסמן מסנכרן מסיכה ניידת על תמונת העוצמה הממוצעת, הדגשת הפיקסלים שנבחרו בתוך אזור הסמן המרובע (איור משלים 1). בבדיקה זו, ניתן להוציא מהניתוח את הרקע והאזורים בעוצמה נמוכה מאוד.
  5. צור את ה-B-map של ה-ROI הנבחר (איור 5, עמודה רביעית).
  6. שמור את קובץ ה-ASCII של ערכי B המשויכים לבחירה.
  7. יבא את קובץ ה-ASCII בתוכנה גרפית כדי לחשב את התפלגות התדירות של הנתונים ולקבל את הממוצע B-value ± S. E (איור 5, העמודה החמישית).
    הערה: אם הנתונים הם הומוגניות, התפלגות התדירות של ערכי B מקירוב התפלגות גאוסיאנית.
  8. החל את eq. 15 כדי להפיק את הבהירות הממוצעת = -1 [(ספירות/מולקולה) לכל תא בזמן הריצה הקינטית. נרמל את הנתונים בהתאם ל:

    כאשר הוא ערך b-value הממוצע הנמדד בזמן "t" לאחר התוספת, והוא ערך b-value הממוצע הנמדד בזמן t = 0 (10-20 s לאחר התוספת).
    הערה: הנורמליזציה של התוצאות מאפשרת השוואה ישירה בין הניסויים שבוצעו בימים שונים. היא מפצה על הבדלים בבהירות נמדד עקב כוח לייזר ותנודות טכניות.
  9. התווה את הבהירות הממוצעת המנורמלת לעומת זמן הרכישה כדי לבנות את ההפעלה הקינטית (איור 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות עבור שני תאים מייצגים הלה-mEGFP-FGFR1 שנזרע באותה צלחת תרבות מוצגים באיור 5 ו טבלה משלימה 1. שני התאים נלכדו בזמן 0 דקות (איור 5א, למעלה) ו -7 דקות (איור 5א, למטה) לאחר הוספת FGF2 ligand.

איור 5 גם מראה את התוצאות של שני תאי הלה מייצגים ביטוי או מונומר טהור, gpi-megfp (איור 5b, למעלה), או המקושרים מקושרים dimeric fluorophore Gpi-megfp-megfp (איור 5b, למטה ), נחשף בקרום התא ונלכד תחת אותם תנאים ניסיוניים.

בהירות לכאורה ממוצעת, B, בתאי הלה-mEGFP-FGFR1 עולה מ 1.070 ± 0.001 S.E. כדי 1.141 ± 0.001 S.E., בעוד ההפניה monomeric (איור 5b, למעלה) ו dimeric (איור 5b, למטה) דגימות לחזור B ערכים של 1.070 ± 0.001 S.E. ו 1.141 ± 0.001 S. E בהתאמה. כך, על ידי השוואה, הקולטן FGFR1 נמצא בעיקר בטופס monomeric במשטח הקרום התא בהתחלה, אבל זה מתקדם לעבר המדינה הדומיננטית dimeric על גירוי עם ליגוני הקנוניאל שלה FGF2. בממוצע אז, המצב הנפוץ של מולקולות FGFR1 בשני התאים הנציג הוא שונה בבירור.

על-ידי החלת הניתוח על מספר תאים באותה מנה, כל אחד מהם נלכד בנקודת זמן שונה, הבהירות הממוצעת כפונקציה של זמן מתקבלת (איור 6א). התנועה הקינטית באיור 6מתארת תהליך איטי של דימריזציה, הנמשך מספר דקות במשטח התאים. FGF2 FGFR1 dimerization המושרה והפנמה הבאים של הקולטן הוא מנגנון ידוע34; לכן, התוצאות הן הסכמה מלאה עם הרעיון הנוכחי על הFGFR1 אות התמרה, ולאשר את הפוטנציאל של הגישה TIRF-N & B לחקר oligomerization של קרום התא חלבונים עד לקביעת מעודן דינמיקה של מונומר-דיימר.

ניתוח הבהירות הממוצע המנורמל של התוצאות הוא כלי מתאים להשוואת ההשפעה של ליגלים שונים באותו קולטן. דוגמא אחת ניתנת באיור 6ב. הפרוטוקול חזר באמצעות אותם סטנדרטים ומגרה את התאים עם FGFR1 ligand לא קאנוני, NCAM-Fc (50 μg/mL). במקרה זה, הפרופיל הקינטי מגלה מעברים מהירים ומחזורי של הקולטן בתערובות oligomeric, אשר גם מגיע ערכי בהירות מעל זה של dimer. ערך ממוצע מנורמל של 3 נצפה שוב ושוב. עם זאת, הגבלת ניתוח N & B (רק שני רגעים של תנודות אינטנסיביות לעומת הזמן נחשבים) אינו מאפשר להפגין ללא ספק היווצרות של טופס trimeric. אותו בהירות מנורמל מנורמלת יכול להיות תוצאה של צירופים שונים של oligomers גדול ו ונומרים של הקולטן. עם זאת, התוצאות בבירור להדגים את ההבדלים זמן זמן של ההשפעה של שני ליגנדס על אותו קולטן.

Figure 1
איור 1: סקירה של הפרוטוקול הניסיוני. (א) תאים מצופים על מנות התחתונות בזכוכית ומנוכר עם קולטן מתויג fluorescently. (ב) תמונות סדרה זמן נלכדים על מיקרוסקופ tirf מסחרי מצויד tirf 100x 1.46 מטרת הנפט בחדר החממה. בכיוונון מסחרי זה, התוכנה אינה מאפשרת את המצלמה מובנית EMCCD #1 לעבוד בזמנים החשיפה קצר מאוד הדרושים לרכישת N & B זמן סדרת. זוהי נקודה חשובה מאז זמן החשיפה מגביל את טווח הdiffusions המולקולרי שניתן ללכוד. ככל שזמן החשיפה קצר יותר, כך הדיפוזיה המולקולרית מהירה יותר שניתן לנתח. חשיפות החל מ 0.5 ל 1 ms מספיק מהר עבור דיפוזיה חלבון ממברנה. לכן, מצלמה EMCCD השני (#2) מתווסף לנמל נוסף של המיקרוסקופ לעבוד ישירות תחת תוכנת המצלמה, עוקף את תוכנת המיקרוסקופ. בתצורה זו הותאמה, תוכנת המיקרוסקופ ו#1 המצלמה משמשים רק עבור יישור TIRF. סדרת הזמן TIRF נרכשים לאחר מכן באמצעות מצלמה #2 שפועל בשעות חשיפה קצר מאוד כגון 1 ms וברווח EM מקסימום. מצלמה #2 יש גם בגודל פיקסל של 124 ננומטר המאפשר דגימת יתר ו binning של התמונות (ראה פרוטוקול סעיף 6.2). תצורות אחרות כדי לצבור מהירות הדמיה אפשריים, בהתאם למאפיינים של מיקרוסקופים TIRF שונים, בעוד השימוש של מצלמות sCMOS אינו מומלץ, כי רעש הוא לא אקראי בתמונה35. (ג) לאחר לכידת, סידרת הזמן נבדקות כבדיקת איכות. הסדרה נמחקים אם הלבנה היא גבוהה יותר 10% כפי שניתן לקבוע על ידי התוויית עוצמת המסגרת הממוצעת לעומת מספר מסגרת. הסדרה מושלכים גם אם יש עיוות ברור של קרום התא או התרגום של התא במהלך הרכישה. (ד) העוצמה הממוצעת בכל אחד מהפיקסלים נשמרת. (ה) היסטוגרמה b-I המייצגת את הבהירות לכאורה, B, בכל פיקסל של התמונה נוצרת. (ו) ההיסטוגרמה B-I משמשת לבחירת ROI הנמצא מעל לרקע. (G) התפלגות התדר של ערכי b מנותח כדי לקבוע את הממוצע B-value ± S.E. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: העיקרון של N &Amp; B. N & B ככמת את מצב oligomerization הממוצע של fluorophores על ידי מדידת תנודות הזריחה המתרחשת כאשר הם עוברים והחוצה את עוצמת התאורה במהלך רכישת סדרת מחסנית זמן של תמונות "K". משרעת התנודות מאופיינת בסטטיסטיקה על-ידי חישוב היחס בין שונות של האות התנודות, σ2וערך העוצמה הממוצע . בתרחיש הפשוט ביותר (A), כאשר עוצמת התאורה ריקה (כלומר, ללא fluorophores), היחס מתאר רעש מכשיר. אם האות הפלואורסצנטית לא משתנה עקב fluorophores ניידים (ב, C), השונות "extra" ביחס ישיר לבהירות המולקולרית, ε (זוהו ספירות פוטון לכל מולקולה ולשנייה), של מולקולות הפיזור. ב (ב), יש 8 monomeric הפצת fluorophores ו ב (ג), fluorophores אותו לפזר כמו 2 tetrameric oligomers. בשני המקרים הללו, האינטנסיביות הממוצעת זהה, אך סטיית התקן והבהירות שונות (1ε, 4ε), משום שהעוצמה של התנודות שונה. ε = 0 כאשר fluorophores הם משותק או נעדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקרוסקופ TIRF. למרות N & B פועל טוב באותה מידה עם סריקת מיקרוסקופים סריקה מצויד multiphoton, גל רציף או פעמו לייזרים פוטון יחיד, אנלוגי או הפוטון גלאי, מיקרוסקופ TIRF אידיאלי עבור הדמיה בזמן מהיר של דינמיקה מולקולרית אירועים המתרחשים או ליד משטח התא עם מהירויות, רזולוציה ויחס אות/רעש (S/N) שאין אפשרות להשיג על ידי טכניקות דימות אחרות. (א) מיקרוסקופ tirf מעסיקה את העיקרון של השתקפות פנימית מוחלטת, שבה אור לייזר עירור בזווית מלהיב רק fluorophores כי הם רק מתחת ממשק מים זכוכית של coverslip. הלייזר מקרין את הדגימה בזווית של שכיחות גדול או שווה לזווית קריטית של השבירה ואילו אור לייזר עירור משתקף לחלוטין. ההשתקפות יוצרת שדה אלקטרומגנטי. דק מאוד בדגימה שנקראת גל האוונבי אור פלורסנט וכתוצאה מכך נפלט החלק המואר הזעיר של הדגימה נאסף באמצעות המטרה מיקרוסקופ ממוקם ניצב למטה לשקופית. (ב) הפאנל מציג דוגמה ייצוגית באורך גל נתון של האינטנסיביות היחסית של שדה אוונסי לעומת עומק, היורד באופן אקספוננציאלי עם המרחק הגובר מפני השטח, ומספק זריחה גבוהה ברזולוציה של צירית תמונות. הרזולוציה לרוחב מוגדר על ידי הצמצם המספרי ואת ההגדלה של המטרה ועל ידי גודל הפיקסל של מצלמת האיתור. הפנים תא אינו מואר והוא אינו תורם את האות עם התאמה אוטומטית תאיים. רב זווית מיקרוסקופ TIRF לאפשר בחירת במעמקי חדירה שונים. הם מספקים קנה מידה תלוי באורך הגל ובדרך כלל הולך מ 70 nm עד 250 עומק nm עבור תמונה בודדת TIRF צבע. עומק ההארה האוונאתי שנבחר לפרוטוקול זה הוא 110 ננומטר, והוא תוצאה של פשרה בין הצורך בשימוש בכוח לייזר נמוך ועוצמת האות הפלואורסצנטית הפוחתת בחדות עם ירידה של עומק החדירה. חשוב להימנע יותר מדי שדות אוונבי גדול שיכולים להאיר רבים תאיים ושלפוחיות האוכלוסייה תאיים של fluorophores. לכן, בהתאם לסוג של מדגם, במעמקי החדירה כמה יש לחקור, חיפוש אחר השילוב הטוב ביותר: יחס אות לרעש גבוה, כוח עירור נמוך, זמן חשיפה קצר, עומק חדירה קצר. לאחר מיטוב זה נעשה, עומק החדירה נשמר קבוע עבור כל הפקדים והדגימות. (ג) הנציגה האפינטית ותמונות tirf של תא של הלה-gpi-megfp לאחר האופטימיזציה של התוכנה מונחה העומק והכיוון של שדה אוונדרו. רב זווית מיקרוסקופ TIRF גם לאפשר למטב את הכיוון של שדה אוונסי. שלב זה מומלץ לצמצום הפיזור (כלומר, עלייה חדה בעוצמת העוצמה והתמונה הפחות חדה), וניתן לבצע זאת בהתאם להוראות המיקרוסקופ המסוים המשמש. בפרוטוקול זה, תוכנת המיקרוסקופ כוללת אופטימיזציה אוטומטית של הכיוון של שדה אוונזאני. למיטוב ידני, עיין בפרוטוקולים שפורסמו36,37. (ד) תא מייצג המבטא את המבנה megfp-FGFR1 באפיפלואורסצנטית ולאחר אופטימיזציה של התאורה tirf. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: לכידת סדרת הזמן וכיול של תגובת המצלמה לפוטונים בודדים. (א) דוגמה של המסגרת הראשונה מתוך 700-סדרת זמן מסגרת שנתפסו על תא של הלה-MEGFP-FGFR1 במצב חיישן שנחתך. שבב המצלמה הוא מסיכה חלקית (מלבנים אדומים) באמצעות מחבר תצוגה כפולה מותקן במיקרוסקופ TIRF (איור 1B). אזורי הכיול הפנימיים מזוהים בתמונת העוצמה הממוצעת (B) ומעובד (C) להערכת פרמטרי המצלמה על-ידי התוויית תדר היומן לעומת רמות דיגיטליות (D). מערכת איתור אנלוגית, כגון מצלמת EMCCD, מזהה פולסים של פוטוזרם במקום ספירות פוטון, ואת גובה הדופק פוטון התפלגות מעריכית-מעריכי. החלק הראשון של ההתפלגות נובע מהמגבר ומהממיר האנלוגי לדיגיטלי והוא תורם רעש בדיקה גאוסיאני (השונות שהוצגה על ידי הקלטת האותות). הערוץ המאוכלס ביותר (כלומר, הערך התכוף ביותר) של ההתפלגות הוא ההיסט (eq .13). באמצעות סמן אנכי בהתוויה של יומן רישום, החלק הראשון של ההתפלגות מופרד מהחלק השני האקספוננציאלי, מעל 250 DL, המייצג את תגובת המצלמה הממוצעת לפוטון בודד (השיפוע הוא פקטור S בeq .12). המדידה של פרמטרים אלה מאפשרת אומדן צפיפות הפוטונים הנרשמים במהלך הרכישה. ספירות (DL) נמצאות בסולם צבעים מדומה. פיקסל גודל = 124 ננומטר; תבנית תמונה = 256x256 פיקסלים, עומק החדירה של שדה אוונסקא ~ 110 ננומטר; כיול ROI #1 = 19x256 פיקסלים; כיול ROI #2 = 5x256 פיקסלים. DL = רמות דיגיטליות. חשיפה = 1 ms ו-EMGain (הגורם G ב eq. 12, 13 ו 14) = 1000. שים לב כי מצלמות לעבוד במצב ספירת פוטון עם הרקע הם שקולים גלאים אנלוגי עם S = 1 (eq. 12) עם σ2d ו היסט (eq .13) נמדד באותו אופן כמו עבור מערכת אנלוגית18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: N &Amp; B ניתוח של FGFR1 oligomטיזציה. (א) תוצאות הנציג משני תאי הלה באותה תבשיל המבטא mEGFP-FGFR1 ושנתפסו בזמן 0 דקות (למעלה) ו -7 דקות (למטה) לאחר תוספת של 20 ng/mL FGF2, ו (ב) שני תאים הלה המבטא את בונה הייחוס Gpi-Megfp (למעלה) ו-GPI-ממגה-מגטון (למטה). כל רצף הניתוחים מראה (משמאל לימין): העוצמה הממוצעת של סדרת הזמן; מגרש של כל ערכי B כפונקציה של עוצמה פלואורסצנטית שבה קוד הצבע מייצג את מספר הפיקסלים בעל ערך B זהה בתמונה ואת סמנים מלבני תוחמת את אזור הריבית (ROI), את הרקע (BG) ואת האזורים של נמוך מאוד אינטנסיביות (LI). שים לב כי fluorophores משותק ייתן B-value = 1 מאז העדר תנודות ε = 0; B-מפת ה-ROI הנבחר והיסטוגרמה הפצה B משויכת. התפלגות ערך B מצוידת בפונקציה גאוסימית (קו אדום מקווקו) כדי לחשב את הבהירות הממוצעת לכאורה, B (קו אדום מלא) ואת סטטיסטיקת ההפצה (טבלה משלימה 1) b-Value = b ' = b/S (eq. 15); עוצמה = ( - היסט)/s; M = מונומר; D = dimer; סולם ברים = 10 מיקרון. זמן גלם סדרת נתונים בסרט המשלים 1, משלימה סרט 2, משלים סרט 3, ו סרט משלים 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: קינטיקה של FGFR1 oligomerization הנגרמת על ידי הפעלת ליגנד. הנציג הקינטי מופעל על ידי הבהירות הממוצעת (eq. 16) של התאים הלה-mEGFP-FGFR1 לאחר גירוי עם 20 ng/mL FGF2 (A) או 50 μg/ML Ncam-Fc (ב). תאים באותה תבשיל נתפסו בהגדלת נקודות הזמן ואת הבהירות הממוצעת לכאורה, B ± S.E., חושבה מן היסטגרמות הפצה B. הדמות מותאמת עם אישור Zamai ואח ' היומן של מדעי התא (2019)31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: קינטיקה מהירה ופרשנות נתונים. פיזור מגרש של ערכי בהירות מנורמלת כל שהתקבלו מתוך שכפול מסלולים קינטי שבו התאים הלה-mEGFP-FGFR1 היו מגורה או עם NCAM-Fc (50 μg/mL) או FGF2 (20 ng/mL). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 1
איור משלים 1: תמונת מסך של שגרת הניתוח ב-MatLab. תמונת מסך של השגרה הMATLAB של ממשק המשתמש הגרפי N & B (GUI) המציגה את שלבי הניתוח ההתחלתיים: סדרת זמן העלאה; לחשב את העוצמה הממוצעת בתמונה, פרופיל העוצמה מחשב, חישוב B-map והיסטוגרמה B-I. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטר GPI-מגfp GPI-מגלוו-מגלוfp mEGFP-FGFR1 (זמן = 0) mEGFP-FGFR1 (זמן = 10 ')
ערך B ממוצע של גאוס 1.070 1.141 1.070 1.141
S.E. בערך B ממוצע 0.001 0.001 0.001 0.001
ש גויטיין של התפלגות B-ואי 0.059 0.067 0.077 0.075
95% מרווח ביטחון של ערך B ממוצע 1.069 עד 1.071 1.139 עד 1.143 1.069 עד 1.072 1.139 עד 1.143
ש גויטיין מרווח הביטחון של 95% של ערך B 0.058 עד 0.060 0.065 עד 0.069 0.075 עד 0.079 0.073 עד 0.078
התאמת אילוצים ש גויטיין > 0 ש גויטיין > 0 ש גויטיין > 0 ש גויטיין > 0
שגיאת תקן S.E.; סטיית תקן של ש גויטיין

טבלה משלימה 1: ניתוח בהירות לכאורה. הפרמטרים המתאימים לסטטיסטיקה ולנתונים גאוסימטרים של הפצות B באיור 5 בוצעו. התאים הפחות מרובעים של גאוס הושגו תחת הגבלת סטיית התקן > 0 באמצעות X-טווח נבחר באופן אוטומטי ומקסימום איטראציות = 1000. R מרובע: megfp-FGFR1 מונומר = 0.9957, megfp-FGFR1 דיימר 0.9940; GPI-mEGFP = 0.9985; GPI-mEGFP-מגלוfp = 0.9970.

Supplemental Movie 1
משלים סרט 1: סדרת זמן של תא הלה-mEGFP-FGFR1 בזמן = 0 דקות לאחר גירוי FGF2 (20 ng/mL ב-PBS בתוספת עם 0.01% BSA) המוצג באיור 5. הסדרה של 800 מסגרות משוחזרים בדחיסה ב -7 fps. תמונה בפורמט = 256 x 256 פיקסלים; פיקסל גודל = 124 ננומטר; אזור הכיול הפנימי מזוהה כלהקות לרוחב כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Supplemental Movie 2
סרט משלים 2: סדרת הזמן המוצגת באיור 5 של תא הלה-megfp-FGFR1 בזמן = 7 דקות לאחר גירוי FGF2 (20 Ng/mL ב-PBS בתוספת עם 0.01% bsa) סדרה של 800 מסגרות מועתק לא דחוס ב 7 fps. תמונה בפורמט = 256 x 256 פיקסלים; פיקסל גודל = 124 ננומטר; אזור הכיול הפנימי מזוהה כלהקות לרוחב כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Supplemental Movie 3
משלים סרט 3: סדרת הזמן המוצגת באיור 5 של תא הלה-Gpi-megfp לאחר הוספת הרכב (PBS בתוספת עם 0.01% bsa). הסדרה של 1,000 מסגרות משוחזרים בדחיסה ב -7 fps. תמונה בפורמט = 256 x 256 פיקסלים; פיקסל גודל = 124 ננומטר; אזור הכיול הפנימי מזוהה כלהקות לרוחב כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Supplemental Movie 4
משלים סרט 4: סדרת הזמן המוצגת באיור 5 של תא של הלה-gpi-megfp-מגלית לאחר הוספת הרכב (PBS בתוספת עם 0.01% bsa). הסדרה של 1,000 מסגרות משוחזרים בדחיסה ב -7 fps. תמונה בפורמט = 256 x 256 פיקסלים; פיקסל גודל = 124 ננומטר; אזור הכיול הפנימי מזוהה כלהקות לרוחב כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

N & B דורש מספר אמצעי זהירות בבחירת דגם התא ואסטרטגיית התוויות. ניתן להחיל אותו רק על תאים חיים שנשארים ללא הפסק בזמן לכידת התמונה. תנודות נוספות בשל העקירה הנוקשה של התא כולו עשוי להיות מטופל עם גישות שחזור התמונה המתאים38. עם זאת, בדרך כלל כאשר התא זז, קרום התא גם deforms, ואת מבנה דפורמציה, הפקת שונות נוספת גדולה, מציג מגבלה רצינית ניתוח של חלבונים ממברנה. בעבודה זו, המבנה הפלורסנט מתבטא בקו התאים של הלה, משום שFGFR1 החוקתית היא זניחה. הנוכחות של חלבון קונסטיטוטיבי הוא מצב להימנע, אחרת אוכלוסיות מעורבות של פלורסנט ו-oligomers קולטן לא פלורסנט היה כנראה להיווצר. אפוא, ניתוח N & B, אשר מבוסס רק על הבהירות של אוכלוסיית החלבון fluorescently המתויג, יחזיר אומדן לא אמין של המדינה oligomeric הממוצעת. היבט זה חשוב במיוחד כאשר מיישמים את N & B כדי לזהות אירועי דימרזציה לקולטן שבהם הבהירות גדלה רק בפקטור של 2, כגון FGFR1 dimerization בנוכחות FGF2 ligand. במקרה כזה, הנוכחות של דימרים מעורבים יכולה להסתיר לחלוטין את האירועים הדימריזציה שניתן לזיהוי על-ידי N & B. הזיהום של oligomers פלורסנט עם צורות שאינן פלורסנט מסוג זה הוא אחד החסרונות הפוטנציאליים של כל גישה מבוסס על גילוי של ניאון, אלא אם החלבון מתויג הוא מבוטא במידה רבה. עם זאת, לימודי מחקר בתנאים של חלבון ביטוי יתר להעלות חששות לגבי המשמעות התפקודית שלהם. תאים הניתנים להעברה מרחוק יהיו כנראה רמות משתנה של קרינה פלואורסצנטית (כלומר ריכוז חלבון) והם שימושיים לבדיקת עצמאותה של הבהירות הממוצעת על ריכוז החלבון, מכיוון ש-N & B ניתן להחיל על מגוון רחב של ריכוזים, במצב של תגובה לינארית של הגלאי (ראה ההגדרה של הבהירות, eq .1).

אילוץ נוסף הוא התיוג הסטואימטרי של הקולטן באמצעות fluorophore יציב בתאים חיים. Halo-tags, חלבונים פלואורסצנטי (FP) או תגי פלורסנט אחרים בעלי ערך מתאים לקבל מספר מדויק של fluorophores מאוגד לכל מולקולה של חלבון בתא. כדי להפחית את המורכבות של ניתוח N & B, אנו משתמשים בחלבונים פלורסנט או ההילה-תגי מניב 1-ל-1 fluorophore-חלבון. FP של בחירה חייב להיות monomeric בצורה בוגרת, בעל נטייה לשיוך עצמי זניח כי, אחרת, עלול לגרום oligomerization מלאכותית של קולטנים FP מתויגים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים (A207K) megfp כי זה מוטציה נקודה אחת מבטל את הנטייה של המגה-fp המתכלה כמו בעבר הראה31,39,40. ללא קשר לאסטרטגיית התוויות, החלבון המתויג fluorescently יש לבדוק את השמירה של הפעילות הביולוגית במודל התא הנבחר, כמו הפונקציונליות של מולקולות מתויגות חיוני ליצירת קשר אירועים oligomerization כדי ל איתות הקולטן. במודל שלנו, הוכחנו את ההרצלציה האוטומטיים של הפלורסנט (A207K) mEGFP-FGFR1 לאחר גירוי תאים מזוהמים עם ליגיום הקולטן FGF231.

N & B מבוסס על דיפוזיה של מולקולות בעוצמת התאורה. בזיהוי מצלמה דיגיטלית, זמן החשיפה (כלומר, הזמן לשכון פיקסל בזיהוי אנלוגי, tהתעכב) חייב להיות קצר מספיק כי אחת ויחידה אחת התצורה של חלקיקים באמצעי האחסון המוקד נלכד. זה אומר כי ההסתברות של fluorophore להיכנס או לצאת נפח מואר בזמן החשיפה הוא קטן מאוד. זמן החשיפה חייב להיות קצר יותר מאשר הזמן מגורים fluorophore (τD) שהוא הזמן הממוצע כי fluorophore מבלה את נפח מואר. לכן, לפני שמתחילים בניסוי N & B, יש צורך לקבל מושג כלשהו על זמן המגורים (או מקדם הדיפוזיה) של חלבון היעד, אשר בקירוב הראשון, תלוי בלוקליזציה הסלולר והמסה המולקולרית. קצב המסגרות הוא ההופכי של הזמן הדרוש למצלמה כדי לרכוש תמונה ולאחר מכן לקרוא את התמונה באופן מלא, ולעתים קרובות, מחושב בקירוב מהמספר הכולל של הפיקסלים וקצב הבדיקה, בשילוב עם זמן החשיפה. למרות שקצב המסגרות אינו צריך להיות מהיר, זמן מחזור (tמחזור), שהוא סכום קצב המסגרות והזמן להכנת לכידת המסגרת הבאה, עלול להשפיע על הניתוח. אילוצים אלה יכולים להיות כללית כמו: tמחזור > > τD > > tלהתעכב. אם זמן המחזור מהיר מדי, המולקולות לא הועברו באופן מוגזם ממסגרת אחת לשנייה באותה תקופה, ותופיע כקפואה (B = 1). עם זאת, בגלל מאות מסגרות נחוצים לניתוח, רכיבה על אופניים מוגדר מהר ככל האפשר (הגדלת או להקטין את תבנית התמונה במספר פיקסלים) כדי למנוע תא displacements ועיוות של קרום התא שיוסיף שונות גדולה נוספת במהלך רכישת הסדרה. בדוגמה של פרוטוקול זה, זמן המחזור האיטי ביותר הוא 22 ms, כך 500 מסגרות ניתן לרכוש ב 11 s.

בהירות מולקולרית אינה כמות מוחלטת; זה תלוי בתכונות המולקולריות של fluorophore (חתך רוחב ותשואה קוונטית), על הניסוי להגדיר (גלאי ואופטיקה), כמו גם על תנאי עירור כגון כוח הלייזר. כך, הגישה TIRF-N & B התשואות בהירות לכאורה ובגלל זה היא בסיסית כדי להגדיר "תא התייחסות מודל" המבטא בניית התייחסות עם המדינה הווקאלית oligomeric. בניית ההתייחסות נושאת את התג fluorophore אותו החלבון תחת לימוד [כאן, (A207K) mEGFP] והוא מאתר באותו תא subcellular (כאן, קרום פלזמה). בעבודה זו אנו משתמשים הגליסיפוספוליפוגידילינילינטול (GPI) מעוגן-(A207K) mEGFP לבנות כי הדגמנו שוב ושוב להיות תקן בהירות monomeric אמין עבור קולטני פני שטח התא מתויג עם fluorophore אותו30, . בסדר, 31

חיסרון אחד גדול הוא המופע של הלבנה פוטופור, כי סביר מאוד קורה כאשר אותו תא נחשף שוב ושוב לאור במהלך לרוץ קינטי, ומוביל הערכה של המדינה oligomerization. כדי למנוע זאת, קינטיקה בהירות מושגת על ידי שילוב הבהירות הממוצעת של תאים שונים כל אחד נלכד בנקודת זמן שונה (איור 6). זה אומר שבצלחת פטרי כל תא הוא נקודת זמן שונה של הקינטיקה וצלחת פטרי מייצגת ריצה קינטית שלמה.

כאשר הדינמיקה של oligomerization היא מהירה ומורכבת, כגון FGFR1 oligomerization הנגרמת על ידי ליגוני לא קנונית, NCAM31, הפרופיל של הבהירות הממוצעת מנורמל לעומת הזמן יכול להיות משתנה ולא יציב (איור 6B ). במקרה כזה, לא ניתן לקבוע את האפשרות על ידי קריאת מנות שכפול של תאים בנקודות זמן מדויקות, בשל הצורך של העברת והתמקדות תא חדש בכל פעם, בחר ROI, לכידת ובדוק/התעלם סדרת זמן. כך, ניתן להעריך את האפשרות באמצעות הדמיון בפרופיל קינטי ומשרעת של שינויי הבהירות.

סקירה של התוצאות מוצגת באיור 7. העלילה פיזור ממחישה רק את הבהירות הממוצעת נמדד בתאים של אותה מנה, מזניחה את הזמן של כל לכידה. בעלילה זו ההבדל העיקרי שנגרם על ידי שני ליגנים על מצב oligomerization של הקולטן להישאר ברור, למרות כל המידע הקינטי מוסר. עם זאת, עבור שתי הערכות של ניסויים (FGF2-לעומת NCAM המושרה oligomerization), הגישה המקובלת של קביעת ממוצע ± ש גויטיין של כל לרוץ באיור 7 יוביל מסקנות מטעה מאז FGFR1 מולקולות מגורה על ידי FGF2 בבירור מעבר לשני מדינות מוגדרות היטב, בעוד NCAM גורם לא יציבה מחזורית oligomeric FGFR1 תערובות זה לא יהיה מיוצג היטב על ידי ערך ± ש גויטיין ממוצע.

לסיכום, מנקודת מבט ניסיונית, N & B מחייב גישה למיקרוסקופ המצויד במודול רכישה מהיר ובתוכנה ייעודית. חלבון העניין יכול להיות מתויג עם מגוון של חלבונים הפלורסנט monomeric או fluorophores אורגני, אבל מדידות כמותיים דורשים מספר תנאים כדי להתממש: התיוג הסטואיצ'ילי, התייחסות תקן בהירות, גלאי כיול וללא הלבנת התמונות. בהקשר זה, הגישה N & B הוא כלי רב עוצמה כדי לפענח את oligomאריזציה של חלבונים בתאים חיים. יתר על כן, ההתקדמות האחרונה של לדגימה מחדש נתונים גולמיים כדי לפתור את המשקל הסטטיסטי41 ושילוב של ספקטרוסקופיית צולבות מתאם פלואורסצנטית עם מתאם חוצה n & B42 הם זיקוק ושיפור ישימות של n הגישה & B ללימודי חלבון ולימודי אינטראקציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

CNIC נתמך על ידי משרד של Ciencia, מרכז האוניברסיטה והקרן הפרו CNIC, והוא המרכז המרכזי של אוצ'ואה מצוינות (צב-2015-0505). אנחנו גם נתמכים על ידי הקרן האירופית לפיתוח האזור (פדר) "אונה סון נרה דה האג אירופה". אוניברסיטת קליפורניה מכירה בתמיכה של האגודה לחקר הסרטן הבינלאומי (הידוע כיום כ מחקר הסרטן העולמי), ומשרד הבריאות האיטלקי. א. ש. מכירה בעמותת "פוננדאלקה דל מונטה די לומברדיה" לתמיכה חלקית בעבודתו עם מלגת PV "המקצוענים בצ" 2011-2012.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Tags

ביולוגיה גיליון 153 אשכולות הקולטן N & B מספר ובהירות ניתוח רגע חלבון oligomers קרום התא מיקרוסקופ TIRF
ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter