Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Resumen

Describimos un enfoque de imagen para la determinación del estado oligomérico promedio de los oligómeros receptores etiquetados con mEGFP inducidos por la unión de ligandos en la membrana plasmática de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B).

Resumen

A pesar de la importancia y la ubicuidad de la oligomerización de receptores, pocos métodos son aplicables para detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres. Aquí, describimos un enfoque de imagen para determinar el estado oligomérico promedio de los homocomplejos de receptores etiquetados con mEGFP en la membrana de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B). N&B es un método similar a la espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS) y el histograma de recuento de fotones (PCH), que se basan en el análisis estadístico de las fluctuaciones de la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos que se difunden dentro y fuera de una iluminación volumen durante un tiempo de observación. En particular, N&B es una simplificación de PCH para obtener información sobre el número medio de proteínas en mezclas oligoméricas. Las amplitudes de fluctuación de intensidad se describen por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos dentro del volumen de iluminación. Por lo tanto, N&B considera sólo el primer y segundo momento de la distribución de amplitud, a saber, la intensidad media y la varianza. Esta es, al mismo tiempo, la fuerza y la debilidad del método. Debido a que sólo se consideran dos momentos, N&B no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, se puede aplicar a series temporales relativamente pequeñas (en comparación con otros métodos de momento) de imágenes de células en vivo píxel por píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones de tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Reduce el tiempo efectivo por píxel a unos pocos microsegundos, lo que permite la adquisición en el intervalo de tiempo de segundos a milisegundos, lo que es necesario para la cinética de oligomerización rápida. Por último, se pueden explorar grandes áreas celulares, así como compartimentos subcelulares.

Introducción

Describimos un enfoque de imagen de Fluorescencia-Número de Fluorescencia Y Brillo de Reflexión Interna Total (TIRF-N&B) para determinar el estado oligomérico promedio de las moléculas receptoras en la membrana plasmática de las células vivas, con el objetivo de vincular el conjunto del receptor dinámica a la función biológica de las proteínas (Figura 1).

Tras la unión de ligandoextra extracelular, los receptores inician la transducción de la señal intracelular dependiendo de su conformación, oligomerización, posibles coreceptores y composición de la membrana. A pesar de la importancia y ubicuidad de la oligomerización de r....

Protocolo

1. Preparación de muestras

1. Día 1. Células HeLa de semillaen en medio completo a una concentración de 100,000-200,000 células / ml en platos con fondo de vidrio. Semilla 6-8 replicar platos.
   NOTA: En este ejemplo, el medio se complementa con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor, piruvato sódico de 1 mM, 100 U/100 g de penicilina/estreptomicina. Se preparan varios platos replicados.
2. Día 2-3. Cuando las células están en subconfluencia, transfectar la mitad de los platos con el plásmido proteico y la segunda mitad con plásmidos de referencia (monómero y dimer), en medio libre de suero.
   NOTA: La tr....

Resultados

Los resultados de dos células representativas de HeLa-mEGFP-FGFR1 sembradas en el mismo plato de cultivo se muestran en la Figura 5 y en la Tabla Suplementaria 1. Las dos celdas fueron capturadas en el tiempo 0 min(Figura 5A, superior) y 7 min(Figura 5A,inferior) después de la adición del ligando FGF2.

Discusión

N&B requiere varias precauciones en la elección del modelo celular y la estrategia de etiquetado. Solo se puede aplicar a las celdas vivas que permanecen establemente adheridas durante el tiempo de captura de imágenes. Las fluctuaciones adicionales debidas al desplazamiento rígido de toda la celda podrían manejarse con los enfoques adecuados de restauración de imágenes^38. Sin embargo, generalmente cuando una célula se mueve, la membrana celular también se deforma, y la deformación de la estructura.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio invertido Fast TIRF Leica AM TIRF MC de 3 colores, con alineación TIRF smi-automática. El microscopio está equipado con un láser de diodo de 488 nm, un objetivo TIRF de aceite 100x 1.46, filtros de paso de banda Ex/Em a 490/20 y 525/50, incubadora de temperatura/CO2 y cámara EMCCD Andor DU 8285 VP. El microscopio es operado por el software Leica LIF.	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania
Albúmina de suero bovino 98% mínimo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.	A7906-100G
DMEM sin rojo fenol con 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, EE. UU.	21063029	Usado sin suero para microscopía
DMEM de alta glucosa GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, EE. UU	10566-016	Se utiliza para el medio completo
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, Francia	X0515-500
Sistema de división de emisiones Fotometría DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, EE. UU
Suero fetal bovino, calificado, Brasil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, EE. UU	10270106 Suplemento	inactivado al 10% para medio completo
Fondo de vidrio de 35 mm estéril 1,5 placas	MatTek, Ashland, MA, EE. UU	P35G-0,170-14-C	sin recubrimiento, espesor del vidrio 0,17 micras
Prisma GraphPad GraphPad	Software Inc., San Diego, CA, EE. UU
Carcinoma cervical humano (HeLa), células de componentes animales (CA) sin suero	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Alemania	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (retroiluminado) Cámara ANDOR controlada por el software ANDOR Solis	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Reino Unido		Esta cámara, instalada en un puerto adicional del microscopio, se utiliza para adquirir el N& Serie temporal
B Matlab Ejecutable N& Unidad	de Microscopía e Imagen Dinámica, CNIC, Madrid, España		descargar en https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicilina:Estreptomicina para cultivo de tejidos 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, EE. UU	LONZA 17-602E	suplemento para medio en Penicilina / Estreptomicina 100 U / 100 µ g.
Vector de expresión de pN1-mEGFP-FGFR1	Unidad de Investigación en Oncología Ginecológica, Instituto Europeo de Oncología IRCCS, Milán, Italia		Zamai et al., 2019
Unidad de Microscopía e Imagen Dinámica del	vector pN1-N-Gly-mEGFP-GPI		Hellriegel et al., 2011
vector pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI	Unidad de Microscopía e Imagen Dinámica, CNIC, Madrid, España		Hellriegel et al., 2011
FGF2 recombinante	PeproTech EC, Ltd., Londres, Reino Unido		Solución de ligando: 20 ng/mL de FGF2 en PBS suplementado con 0,01%BSA.
Piruvato de sodio GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1 mM suplemento para medio
TransIt-LT1 Reactivo de transfección	MirusBio LLC, Madison, WI, EE. UU	MIR 2300
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, EE. UU.	25200056
Tipo F Líquido de inmersión 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	Suplemento al 0,1 % para medio sin rojo de fenol utilizado para transfecciones

. . . . .<. , CNIC, Madrid, España Unidad de Microscopía e Imagen Dinámica del.