Summary
Denna artikel beskriver en transplantation metod för att transplantera givare råtta däggdjur epitelceller i interscapular vit fett pad av mottagardjur. Denna metod kan användas för att undersöka värd- och/eller givareffekter på däggdjurepitelutveckling och eliminerar behovet av preclearing och därigenom utvidganyttan av denna teknik.
Abstract
Redan på 1970-talet har forskare framgångsrikt transplanterat däggdjursepitelceller i interscapular vita fettpad av råttor. Ympning bröst epitel med transplantation tekniker drar nytta av hormonell miljö som tillhandahålls av ungdomar gnagare värd. Dessa studier är idealiska för att utforska effekterna av olika biologiska manipulationer på bröstkörtel utveckling och dissekera många aspekter av bröstkörtelbiologi. En vanlig, men begränsande, funktion är att transplanterade epitelceller är starkt påverkade av den omgivande stroma och konkurreras ut av endogen epitel; För att använda inhemska bröstvävnad måste bukningsfettplattan rensas för att ta bort värdbröstepitel före transplantationen. Ett stort hinder när du använder råttmodellorganismen är att det inte är effektivt att rensa det utvecklande bröstträdet i postavväjt råttor. När transplanteras i körtelfria fett kuddar, givare epitelceller kan återbefolka den rensade värd fett pad och bilda en funktionell bröstkörtel. Den interscapular fett pad är en alternativ plats för dessa transplantat. En stor fördel är att den saknar kanalstrukturer men ger den normala stroma som är nödvändig för att främja epitelial utväxt och är lättillgänglig i råtta. En annan stor fördel med denna teknik är att det är minimalt invasiv, eftersom det eliminerar behovet av att kauterisera och ta bort den växande endogena bröstträd. Dessutom innehåller interscapular fett pad ett medial blodkärl som kan användas för att separera platser för ympning. Eftersom de endogena körtlarna förblir intakta kan denna teknik också användas för studier som jämför den endogena bröstkörteln med den transplanterade körteln. Detta dokument beskriver metoden för däggdjur epitelcell transplantation i interscapular vit fett pad av råttor.
Introduction
Postnatal bröstkörtel utveckling och duktal morfogenes är processer till stor del påverkas av hormonell signalering i början av puberteten. Hos möss och råttor, vanliga modellorganismer av bröstkörtelbiologi, börjar denna process runt 3 veckors ålder, där snabb spridning och differentiering resulterar i bildandet av den mogna parenkymen. Den mogna bröstkörteln kan genomgå många omgångar av expansion och involution, en fastighet som har varit under utredning sedan början av20-talet. Inom ramen för hyperproliferation och cancerutveckling utvecklades mammary körteltransplantationstekniker på 1950-talet1, och förstärktes avden kvantitativa metod som Gould m.fl. Förfining av transplantationstekniken hos gnagare har bidragit till stora framsteg när det gäller att förstå normala bröstkörtelbiologi som fortfarande används i stor utsträckning för att studera effekten av olika behandlingar och genetisk manipulation på normala bröstkörtelutveckling och sjukdomstillstånd.
Många hypoteser har genererats och därefter testats med hjälp av mammary körtel transplantation, först beskrivs av DeOme et al. 19591. Experiment under flera decennier visade benägenheten hos duktal vävnad strukits från givare bröstkörtlar att återbefolka hela fettpad5,6,7 och visade att en kritisk del av mammary körtel utveckling finns i dessa epitel strukturer. Senare studier på möss visade att en enda bröststamceller kan återbefolka en rensad fettpad och bidragit till upptäckten av en enda, gemensam stamfader av basala och luminal bröst epitelceller8,9,10. I linje med dessa slutsatser har det föreslagits att transplantation ökar poolen av celler med flerkantsrepopulering potential som ett resultat av plasticitet, vilket gör att ympade celler att växa en funktionell bröstkörtel7,10,11,12,13. Viktigt, användningen av transplantation tekniker hos gnagare övervinner begränsningarna i cellodling-inducerad avvikelser14 och ger ofta resultat på bara några veckor.
Medan förfarandet ursprungligen beskrevs i samband med preneoplastiska skador hos möss, var det snart utvidgas till råttor och används tillsammans med cancerframkallande behandling för att etablera multiplicity som ett mått på cancer känslighet15, men populariteten av transplantation tekniker har följt utvecklingen av genetiska verktyg för varje art. Även mus studier som innehåller transplantation har bidragit många translationella resultat, parenkymen av råttan bröstkörteln liknar människan närmare16,17 och erbjuder tydliga fördelar för att studera östrogen receptor-positiva (ER +) bröstcancer. Brösttumörer är förtrogna i båda arterna, men de skiljer sig när det gäller hormonkänslighet och genuttrycksprofiler. En primär skillnad är att råtta brösttumörer uttrycker och beror på funktionen av äggstocks- och hypofyshormonreceptorer, nämligen östrogen och progesteron (PR), liknande den luminal-A subtyp av bröstcancer hos människa. Faktum är att däggdjurepitelcelltransplantation, som beskrivs i detta protokoll, har använts för att studera genetiska varianter som är involverade i bröstcancer och bestämma den cellulära autonomin av effekter på däggdjurepitelceller18.
Förutom tumörbiologin uppvisar den dukta epitelen hos den normala råttets körtel en högre nivå av förgrening och flankeras av ett tjockare lager av stroma än musen. Stroma vikten är väldokumenterad i studier av epiteltransplantation. Däggdjur epitel måste interagera med fet stroma, och helst sin egen mesenchyme, att genomgå sin karakteristiska morfogenes19,20. Ympning vävnad i en mottagare bröstkörtel ger en optimal miljö; Förekomsten av endogen epitel kan dock störa resultaten. Preclearing bröstkörteln av endogen epitel utförs ofta i mus transplantation analyser och kräver kirurgiska excision av endogena bröstvävnad och / eller avlägsnande av bröstvårtan1,21,22. Även om det är möjligt, preclearing bröst epitel i post-weanling råttor är inte så allmänt utförs, främst på grund av ineffektiviteten i clearing den växande bröstträd i post-weanling råttor. Eftersom det har visat sig att regioner av fettvävnad någon annanstans i kroppen skulle kunna stödja tillväxten av transplanterade däggdjur epitel21,23,24,processen för preclearing kan lätt undvikas hos råttor genom ympning vävnad i interscapular vit fett pad.
Transplantationsmetoden som beskrivs i detta dokument innebär injektion av enzymatiskt separerade bröstkörtelorganoider (fragment av bröstduksepitel och andra celler typer som kan morfogenes) eller monodispersed celler i interscapular fettpad inavlade, isogenic eller kongena stammar av råttor laboratorium2. Eftersom interscapular fett pad normalt saknar bröstvävnad, det ger en lämplig miljö för flera transplantation platser utan att behöva pre-clear endogena epitel. Som ett resultat är värddjurets endogena, bukljumskar inte föremål för kirurgisk manipulation, utvecklas normalt och kan inte störa tolkningen av resultaten. Dessutom kan intakta bröstkörtlar användas för jämförelse för att utvärdera värd kontra givareffekter på bröstepitel utveckling och tumorigenesis18,25. Även om återpopulationen av bröstkörteln från en enda stamceller är tillgänglig för möss, har det ännu inte utvecklats för råtta, främst på grund av bristen på tillgång till antikroppar att välja för råtta däggdjur stamceller25,26,27. Trots detta kan transplantation av monodispersed bröst epitelceller för att kvantifiera repopulating potential framgångsrikt utföras, och dessa celler kommer att utvecklas normalt när ympade i lämplig ram2,3,4. Medan organoider är bra för många ändamål, monodispersed celler krävs för kvantitativa tillämpningar, till exempel för att bestämma antalet däggdjur epitelceller som krävs för cancer inledande efter joniserande strålbehandling28 eller för att jämföra egenskaper flöde cytometrically utvalda däggdjur epitelcell populationer29.
Hittills är det förfarande som beskrivs här den mest robusta metoden för att utföra mammary körtel transplantation i råtta med ett övergripande mål att studera bröstkörtel utveckling och mekanismer underliggande bröstcancer utveckling. Ofta exponeras donatorn och/eller mottagardjuren för olika variabler före, under eller efter epiteltransplantationen. Exempel är enskilda genstudier som involverar kemiska cancerframkallandeämnen 30,strålning28,31,32,genetisk manipulering av värd/donatorgenom18, och hormonell manipulation12. En stor fördel med den enzymatiska dissociation som beskrivs i detta protokoll är möjligheten att isolera epitelial organoider eller monodispersed celler för kompletterande experiment med flödecytometri, 3D-kultur, genredigering och mycket mer. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer att omfatta ytterligare manipulering av givare och / eller värdvävnad med genteknik. Till exempel kan givarceller vara genetiskt modifierade ex vivo på alla valda genomiska locus med hjälp av CRISPR-Cas9 genredigeringssystem. På samma sätt kan mottagarråttor också ändras genetiskt för att studera samspelet mellan givare och mottagarkonstruerade genetiska faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur var inrymt och underhålls i en AAALAC-godkänd anläggning, och experiment som beskrivs i detta protokoll godkändes av MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Djur för användning vid ömsesidig transplantation bör vara en inavlad eller isogen stam, med kongen status föredras eller backcrossed i minst 6 generationer.
1. Skörd givare råtta mammary körtel epitel
- Bestäm hur många donatorråttor som behövs för transplantation.
OBS: I allmänhet kan 1 givare råtta (4 veckors ålder) ge tillräckligt med celler för transplantation till 4 mottagardjur. Vissa program i detta protokoll kommer att kräva ytterligare antal celler, och det kan finnas stamspecifika skillnader i total avkastning. - Märk alla tillbehör och säkerställa tillgänglig placering för kirurgen(tabell 1).
- Registrera kroppsvikten hos varje kvinnlig donatorråtta. Följ institutionella riktlinjer för att helt södinra eller avliva givaren råtta. Kontrollera om bedövningsdjupet är djupt av bristen på svar på tånypa.
- Flytta djuret till det sterila operationsfältet. Placera djuret på ryggen och spraya hela ventralytan med 70% etanol.
- Gör ett sagittalt, X-format snitt, vilket ger tillgång till bröst, buk och ljumske bröstkörtlar. Dissekera all bröstkörtelvävnad från givaren råtta med sax(figur 1). Ta bort alla synliga lymfkörtlar.
- Extrahera bröstvävnaden med hjälp av pincett och placera i en märkt 60 mm maträtt på is. Tillsätt 500 μl serumfria DMEM/F12-media till 60 mm skålen. Justera placeringen av bröstkörteln vävnad så att den förblir helt våt.
- Finhacka bröstvävnaden med sax. För att göra det, skär vävnaden i bitar 1-2 mm3 i storlek(figur 1C). Håll körteln på isen tills all donatorvävnad har skördats (överskrid inte 60 min).
OBS: Ytterligare personal kan färsa bröstkörtlar och dessutom förbereda kollagenomlösning medan kirurgen fortsätter med vävnadextraktioner.
2. Extrahera hjärnvävnad från avlivade donatorer
- Vänd försiktigt över donatordjurets kropp för att placera den i ett utsatt läge. Säkra med stift. Spraya huvudet och övre delen av ryggen med 70% etanol.
- Hitta basen av skallen och gör ett snitt under de occipital condyles. Sätt in vass sax under huden och skär huden bort från skallen, inklusive sidorna av huvudet.
- Använd benfräsar eller stark sax för att skära skallen längs mittlinjen, från occipital till främre ben. Håll bladet så ytligt som möjligt och vinkel uppåt för att förhindra förstörelsen av den underliggande hjärnvävnaden.
- Skala bort benet med hjälp av rongeurs eller starka pincett. Sätt in verktyget lateralt i lillhjärnan för att bryta benet på vardera sidan, utsätta beniga hörselgången. Bryta anslutningarna till hjärnhinnorna.
- Lyft försiktigt hjärnan med böjda, finspetsapincett. Placera hjärnan på en bit folie och spela in vikten, och sedan omedelbart överföra till en 15 ml rör med lika mycket (w:v) av media, lagras på is.
- Använd valfri finspetspincett för att ta bort hypofysen (som finns under hjärnan) för ytterligare användning i transplantationsproceduren, om det behövs.
- Använd en mekanisk homogenisator för att störa vävnaden. Homogenisera hjärnan för 10-15 s på låg hastighet. Låt blandningen sitta på is i minst 1 min, och sedan homogenisera igen. Homogenisering är tillräcklig när den slutliga blandningen är fri från stora bitar.
- Filtrera homogenatet genom att passera den genom ett 100 μm-filter. Håll filtratet på is tills användning (mindre än 4 h).
3. Matsmältning och bearbetning av bröstkörtelextrakt
- Tina eller varma reagenser enligt vad som anges(tabell 1). Följ lämpliga steg för att återställa organoider eller monodispersed celler.
- Förbered 10 ml serumfria matsmältningsmedier (utan kollagen) för varje donatordjur (Supplemental File 1 ).
OBS: Mängden matsmältningsmedier som används kan justeras (skalas upp eller ner) för att rymma den grupperade vävnaden, om tillämpligt.- För organoider hoppa till 3,3.
- För monodispersed celler, förbereda färsk monodispersion blandning och inaktiveringslösning (Supplemental File 2, Supplemental File 3) utöver serum-fri kollagen matsmältningsmedier. Fortsätt till steg 3.3.
- När all bröstvävnad från givare har extraherats och malets, tillsätt kollagenenzymet till den varma (eller rumstemperatur) matsmältningsmedier(Supplemental File 1 ). Blanda genom att invertera.
- Passera kollagenmatsmältningsmediet genom ett 20 μm-filter. Fördela 10 ml filtrerat media i de märkta 50 ml-rören för matsmältning.
- Använd en ny 1000 μL pipettspets för varje prov och överför den hackade givarvävnaden från varje 60 mm-skål till kollageniska matsmältningsröret. Skär 1 cm från änden av en 1000 μL spets och placera den manuellt på enheten före användning. Blanda försiktigt den hackade vävnaden genom att pipetta upp och ner 1-2 gånger.
OBS: Om vävnaden är svår att pipette under överföringen, använd en liten mängd av kollagen matsmältningsmedier från 50 ml röret, och sedan överföra tillbaka den. - Placera proverna i horisontellt läge i en skakningsinkubator och låt proverna smälta 1,5-2 h vid 37 °C, 200-220 rpm.
- För organoider hoppa till 3,7.
- För monodispersed celler tillsätt DNase I (0,2 μg/ml) till blandningen för de sista 10 min av matsmältningen. Inkubera som tidigare, med kraftig skakning. Fortsätt till steg 3,7.
- När vävnaden är helt smält, pellet suspensionen med kall centrifugering (4 °C) i 10 min vid 1200 x g (figur 1D).
OBS: Håll rörpå is mellan varje steg för att öka cellernas livskraft. - Se till att en pellet har bildats, och sedan försiktigt hälla av supernatant och fett skikt. Försiktigt resuspend pelleten i 10 ml färska DMEM/F12 media.
- Snurra kort vid 68 x g för ca 10 s. Längden på spinn (men inte hastigheten) kan ökas om det inte finns någon tydlig separation av celler. Inspektera pelleten visuellt innan du fortsätter (figur 1D).
- Ta försiktigt bort supernatanten och lämna efter sig en liten volym. Fortsätt till nästa steg, baserat på om organoider eller monodispersed celler behövs.
OBS Det är viktigt att lämna en liten mängd media i röret eftersom pelleten kommer att vara mycket lös. Den återstående medievolymen kommer att spädas genom tvättsteg.- För organoider, tillsätt ytterligare 10 ml volym DMEM/F12 media och upprepa tvätt / spinn. Efter den andra tvätten, resuspend cellerna i en mindre volym (1-2 ml) av DMEM/F12 media för filtrering. Fortsätt till steg 3.11.
- För monodispersed celler, lös i 2 ml förvärmd AHBSS med 0,025% (w /v) Trypsin och 6,8 mM EDTA. Smält i 3-5 min vid 37 °C. Inaktivera omedelbart.
- Lägg till 4 ml DMEM/F12 med 10% FBS för att stoppa inaktiveringen av trypsin.
- Snurra cellerna på 270 x g i 5 min, och sedan avbryta i DMEM/F12 med 10% FBS igen. Fortsätt till steg 3.11 för att filtrera cellerna.
- Filtrera cellerna med en 40 μm cellsil som placeras i ett nytt 50 ml-rör. Förvåt silen genom att pipetting 1 ml av samma basmedium som används för att hänga upp cellerna, och sedan passera cellfjädringen genom filtret med hjälp av en pipett för att samla duktal fragment /organoider.
OBS: Den ungefärliga avkastningen av filtrerad epitel från bröstkörteln vävnad en enda, 4 veckor gammal givare råtta är 1 x 106 celler.- För organoider, kasta filtratet. Bröstorganoider kommer att förbli inne i korgen av cellsil och mindre, oönskade celler kommer att elimineras. Vänd in cellsilen över ett nytt 50 ml-rör och skölj med alla volymer som behövs för att samla cellerna. Fortsätt till steg 3.12.
- För monospridda celler, kasta cellsil en och hålla filtratet eftersom bröst epitelcellerna kommer att passera genom filtret, tillsammans med mindre stromal och immunceller. Skölj röret som användes för matsmältningen/centrifugeringen med en annan volym DMEM/F12 med 10% FBS och passera genom samma cellsil. Pellet de monodispersed cellerna genom centrifugering vid 1.200 x g för 5 min. Fortsätt till steg 3.12.
De återsuspenderade cellerna är klara för efterföljande program.
- Puls snurra lösningen och säkerställa bildandet av en cellpellet innan du fortsätter till nästa steg. Puls snurra igen, om det behövs.
- Ta försiktigt bort supernatanten. Återsuspendpelleten i en liten volym (1 000-2 000 μL DMEM/F12) för att koncentrera cellerna för räkning.
- Räkna celler och späd a om det behövs. Resuspend önskat antal celler för transplantation i 20 μL DMEM/F12 media för varje djur. Håll alltid celler på is.
Obs: Donatorcell räknas i intervallet 1 x 105 - 1 x 106 celler kommer att krävas för varje moderplantor webbplats baserat på slutpunkten för studien. Cancerframkallande experiment kräver till exempel ofta ett större antal transplanterade celler, i förhållande till andra tillämpningar. Antalet celler som behövs måste bestämmas experimentellt för varje stam. Det förfarande som beskrivs i detta protokoll utnyttjade 250 000 donatorceller i 20 μL-medier per moderplantor, innan de blandades med hjärnhomogenat, enligt beskrivningen i steg 3.16. - Förbered alla aliquot(er) celler som behövs för andra experiment (t.ex. FACS isolering3,26,27,30,33).
- För organoider, fortsätt till steg 3.16.
- För monospridda celler, kvantifiera de livskraftiga cellerna med trypan eller metylenblå färgning och fortsätt sedan.
- Förbered enstaka partier av givarmaterial för alla transplantationsmottagare. Kombinera lika volymer av cellsuspensionen (20 μL) med 50% hjärnhomogenat (20 μL) för varje transplantationsställe.
OBS: Totalt 40 μL per anläggning kommer att injiceras på varje plats, men det rekommenderas att inkludera minst 25% extra volym för avfall. - Fortsätt omedelbart att transplantation eller frysa celler för transplantation senare (potentiell stopppunkt).
Obs: Frysta celler har inte testats med detta protokoll och kommer att kräva optimering i förväg för att generera en kohort av djur för transplantationexperiment. Det rekommenderas starkt att transplantera färska celler.
4. Transplantationsförfarande (mottagarråttor 4-5 veckors ålder)
- Väg varje mottagartjåtta och beräkna rätt dos av godkänd smärtstillande medel som kommer att användas i proceduren.
OBS: Kroppsvikter kan mätas upp till 24 timmar före proceduren. Följ institutionella riktlinjer för att begränsa eller kort söva varje djur under rakningstiden. - Raka operationsområdet på varje djur med hjälp av elektriska klippare. Identifiera skallens bas och början av ryggraden. Ungefär en tredjedel av vägen ner för ryggraden, raka en 3 cm x 2 cm område på den övre bröstdelen av ryggen.
OBS: Rakning kan också utföras under anestesi på transplantationsdagen men måste utföras utanför det sterila fältet. Återlämna råttan till sin hembur tills den behövs. - Hitta alla de förnödenheter som behövs för transplantation(tabell 1).
- Utvärdera laboratoriedjuranestesisystemet före användning. Toppa bort alla vätskor och byt ut tankar eller delar som behövs. Se till att gasledningen till anestesikammaren är öppen och att alla perifera linjer är stängda så isoflurananestesi och syre fritt kan flöda till djuret när den är placerad i kammaren.
- Varma värmedynor för att stödja kroppstemperaturen hos mottagardjur.
- Generera det sterila fältet som kommer att användas för kirurgi. Ordna förbrukningsmaterial enligt beskrivningen i tabell 1.
- Administrera preoperativa smärtstillande medel till mottagarråttor enligt institutionellt godkända djurvårdsprotokoll.
- Spola Hamiltonsprutorna med sterila DMEM/F12-media för att förhindra förlust av celler. Se till att nålen är fastsatt i sprutans kropp, sätt in nålen i vätskan och dra tillbaka kolven. Fyll på den maximala volymen. Tryck ner kolven och utvisa innehållet i ett soprör. Upprepa 3-5 gånger.
- Ladda hela volymen av donatormaterial (beredd i steg 3.16) i en separat spruta för varje tillstånd (t.ex. kontroll, behandlad, wildtype, knockout, etc.). För in nålspetsen i vätskan, dra tillbaka kolven och håll nålen under blandningens yta när volymen i röret minskar.
OBS: Inkludera minst 10 % extra volym i varje spruta. Kassera inte den återstående blandningen stänga röret och förvara den på is om det behövs mer. - Vänd sprutan efter att den är fulladdad och tryck kolven något för att ta bort luftbubblor på nålspetsen. Fortsätt till nästa steg när allt är förberett.
OBS: Se till att nålspetsen aldrig vidrör någon annan yta, även inom det sterila fältet. Det är bra att vila kroppen av sprutan över en liten behållare med is för att främja cellernas livskraft. - Placera det mottagande djuret i anestesikammaren och slå på maskinen.
- När djuret är helt avslappnat (reagerar inte på att knacka eller mild rörelse i kammaren), rikta anestesin till näskonen och överför djuret till det sterila fältet.
OBS: Förlängd varaktighet anestesi tolereras inte väl av råttor. Fyll i proceduren för varje djur i 10 minuter eller mindre. - Placera djuret i ett utsatt läge (på magen) så baksidan av huvudet och den övre ryggraden är tillgänglig.
OBS: Se till tillräckligt värmestöd för djuret hela tiden och regelbundet bedöma djupet av anestesi med hjälp av en fast tå nypa. - Alternativt, applicera oftalmiska veterinärsalva för att förhindra torkning av ögonen.
- Rengör det nyrakade området för att ta bort överflödigt hår. Använd en cirkulär rörelse och applicera 70% etanol (eller annan reagens, enligt institutionella riktlinjer) på huden, följt av en antiseptisk (t.ex. jod) och upprepa. Placera en handdukdraperi över djuret så att endast regionen för det rakade området exponeras.
- Se till att djuret förblir svarar inte på djupa stimuli med en fast tå nypa, och sedan gå vidare till nästa steg.
- Gör ett litet (2 cm) interscapular snitt med hjälp av ett vasst kirurgiskt blad.
OBS: Snittet måste vara ytligt, eftersom fettdynan ligger precis under huden. - Placera det mediala blodkärlet för orientering (figur 2B).
- Lyft huden på ena sidan av snittet med hjälp av pincett och håll den borta från fettplattan medan transplantationen utförs (figur 2B). För in nålen i transplantatstället.
- Alternativt, flytta spetsen på nålen inuti vävnaden och skapa en liten ficka för att samla cellerna. Använd en liten, repetitiv rörelse. Ta inte bort nålen.
Det här steget rekommenderas för första gånganvändare av protokollet. Var ytterst försiktig när du skapar en ficka, eftersom interscapular fett pad vävnad är mycket känslig.
- Alternativt, flytta spetsen på nålen inuti vävnaden och skapa en liten ficka för att samla cellerna. Använd en liten, repetitiv rörelse. Ta inte bort nålen.
- Injicera försiktigt 40 μl av cellblandningen i interscapular fettpadvävnad. Ta bort nålen långsamt.
- Håll vävnaden på plats och låt de transplanterade cellerna nöja sig med 3-5 s. Använd ytterligare ett par pincett, om det behövs.
- Ta bort nålen. Upprepa injektionsproceduren (steg 4.18-4.21) vid det andra transplantationsstället.
OBS: Epitelet från en givargrupp kan injiceras i samma sida av fettdynan i varje djur, eller alternerande sidor för att förhindra partieffekter från handdominans av kirurgen. - Stäng operationssåret med sårklipp eller suturer och avbryt sedan anestesi.
- Tillhandahålla postoperativa smärtstillande medel enligt institutionellt godkänt protokoll.
- Flytta omedelbart djuret till en återhämtningbur med värmestöd. Övervaka för tecken på ångest såsom blödning från snittet eller andningssvårigheter.
OBS: Djuret bör återhämta sig helt inom 5-10 min. Se institutionella riktlinjer för att återvända djur till kolonin och postoperativ övervakning efter överlevnadsförfaranden. - Alternativt utför cancerframkallande studier vid transplantatstället genom att administrera cancerframkallande ämnen till mottagarråttorna 3-4 veckor efter transplantation.
OBS: Typiskt, råtta bröst cancerframkallande utförs med hjälp av en kemisk cancerframkallande behandling vid 50-57 dagar. Denna behandling dikterar åldern på transplantationskirurgi (som måste göras mellan 29-36 dagar) för att ge tillräckligt med tid för de ympade cellerna att inleda tillväxten av bröstkörteln.
5. Bedömning av epitelutväxt
- Övervaka råttornas estruscykel genom daglig vaginal lavage och undersöka cytologin på ett mikroskopr. Börja 8-12 dagar före studiens slutpunkt. Offra alla råttor i samma skede. Detta är ett valfritt steg.
OBS: Råtte estrus cykeln är 4-5 dagar. Att låta djuret gå igenom 1-2 hela cykler kommer att underlätta tolkningen, eftersom lavage bilder från tidigare cykler kan användas för jämförelse. - Offer transplantation mottagare råttor 6-8 veckor efter transplantation, enligt institutionella riktlinjer.
UTväxt är vanligtvis detekterbar 3-6 veckor efter transplantation, men ytterligare tid kan krävas. - Placera djuret i ett liggande läge och rengör kroppen med 70% etanol. Lyft huden med pincett och gör ett snitt längs kotkolonnen för att exponera den interscapular fettdynan. Dissekera huden bort från vävnaden så majoriteten av fettdynan är synlig.
- Identifiera det mediala blodkärlsom separerar transplantatplatserna i den interscapular fettpad. Punktsätt hela dynan som en enda bit vävnad eller skär längs blodkärlet och ta bort sidorna individuellt.
- Placera vävnaden på en positivt laddad mikroskopbild för hela fästet. Använd 2 par trubbiga pincett och försiktigt sprida vävnaden för att återställa sin ursprungliga konformation på bilden.
OBS: Råttbröstvävnad är extremt känslig. Vävnadens kanter kan krypa under sig själv. Hantera alltid försiktigt och håll på plats tills vävnaden fäster vid bilden (några sekunder). - Hela fästet minst en av de endogena buk-inguinal bröstkörtlarna (med lymfkörtlar för orientering) för jämförelse.
- Placera bilderna i 70% etanol i 7-10 dagar för att defat vävnaden. Fyll på etanol så ofta som behövs för att säkerställa att vävnaden inte torkar ut.
- Förbered alun-carmine fläck och bearbeta diabilder när vävnaden är tillräckligt ogenomskinlig. Låt fläcken svalna före användning(Kompletterande fil 4).
OBS: Fläcken kan förberedas upp till en dag före fixering och rehydrering steg. Lösningen kan förvaras vid 4 °C och har begränsad risk för återanvändning. - Fixa vävnaden genom att placera bilderna i 25% glacial ättiksyra: 75% etanol i 60 min.
- Rehydre vävnaden genom en serie av 3 tvättar i en serie av minskande koncentration av etanol: 70% etanol för 15 min, 50% etanol för 5 min och dH2O i 5 min.
- Fläck med aluncarmine i 4-8 dagar. Kontrollera baksidan av bilderna varje dag för att avgöra om fläcken har helt trängt in i vävnaden. Fortsätt till nästa steg när färgningen är klar.
OBS: Färgning är klar när de tjockaste delarna av körteln har en lila nyans och inte längre visas vit. - Destain och torka av vävnaden genom att överföra rutschkanorna genom en serie av ökande koncentration av etanol: 70% etanol för 30 min, 95% etanol för 30 min och 100% etanol i 30 min.
- Placera uttorkade diabilder i xylen i 3 + dagar för att rensa vävnaden. Överför till mineralolja för långtidsförvaring.
- När bilderna har rensats, använd lågeffektljusmikroskopi eller högupplöst digital fotografering för att få bilder av bilderna för analys. Se till att bildanskaffningsparametrarna är konsekventa för alla bilder.
Obs: Epitelias utväxt måste vara klart urskiljbar. - Behandla närvaron av utväxt som ett binärt utfall.
- Beräkna medelvärdet av antalet transplanterade epitelceller som producerade ≥1 bröstutväxt i 50% av graft-platserna med hjälp av de förvärvade bilderna. Kvantifiering andra fysiska egenskaper, efter behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Donator- och mottagarkörtlar
Stegen för att isolera och förbereda råtta däggdjur epitelceller för transplantation visas i figur 1A. Vid 4 veckors ålder har givarens endogena bröstkörtel börjat mognad och epitel visualiseras på hela monterade diabilder som färgas med alunkarmin(figur 1B). En donatorråtta vid denna ålder kommer att ge cirka 1 x 106 celler för transplantation. Om mängden donatorvävnad som samlats in eller efterföljande malning är otillräcklig kan cellernas avkastning efter kollagenmatsmältningen vara låg. Som sådan är det viktigt att samla in så mycket bröstkörtelvävnad som möjligt från givarna. Helt smält bröstkörtelvävnad bör ha ett oljigt utseende, utan synliga bitar av vävnad i suspensionen(figur 1C). Fullständig matsmältning av bröstkörteln vävnad från en enda givare bör resultera i bildandet av en synlig pellet som innehåller bröst organoider, som visas i (Figur 1D). Om en pellet inte syns kan analysen kräva optimering. I figur 2visas råttabröstkörtel och interscapular fat pad platser. Resultaten kan inte tolkas om inte biologiska referenspunkter identifieras korrekt vid tidpunkten för vävnadsinsamling(figur 2A)och transplantation(figur 2B). I denna analys används det mediala blodkärlet i interscapular white fat pad som en biologisk referenspunkt.
Kvalitativ och kvantitativ bedömning av epitelutväxt
Förekomsten, frånvaron eller överflödet av epitelet kan utvärderas för att avgöra experimentets framgång, liksom autonomin hos effekter relaterade till experimentella variabler. För den senare kan vissa studier kräva hela monterade diabilder med den endogena buken-inguinal bröstkörteln av värden för jämförelse. Som en preliminär åtgärd kan ljusmikroskopi användas för att dokumentera epitelial utväxt som ett binärt utfall. Dessa data kan analyseras statistiskt för att testa hypotesen att graft avstötning är beroende av givare eller mottagare variabler. Ett ömsesidigt transplantationsexperiment där var och en av dessa faktorer har 2 nivåer, till exempel wildtype (WT) vs knockout (KO), kommer att skapa 4 transplantationsgrupper för hypotestestning(figur 3A). Transplantationsgrupperna, uttryckta som donator:mottagare genotyp, är: WT:WT, WT:KO, KO:KO, KO:WT. När isogenic eller nära-kongena djur används, graft avstötning är mindre och förekommer lika över transplantationgrupper. En fördel med flera platser för transplantation inom interscapular fett pad är en minskning av mottagardjur som behövs, eftersom 2 givare celltyper kan utvärderas i en enda värd. Dessutom kan båda platserna användas för att testa en enda givare cell typ med en högre incidens hastighet, med samma antal råttor. Med genotyp som exempel visas detta i figur 3B.
Den epitelutväxt en kan också analyseras med hjälp av bilder av de bilder som tidigare förvärvats. Ett exempel på en hel monterad interscapular fett pad som innehåller epitel utväxt på båda transplantat platser (registreras som positiva resultat) visas för ett experiment med hjälp av bröstcell transplantation protokoll som beskrivs här(figur 3C). Brist på epitel i interscapular fettpad över många prover kan tyda på ett tekniskt problem med förfarandet och behandlas som ett negativt resultat.
Resultatet av ömsesidiga transplantationsexperiment kan användas ytterligare för att skilja effekter som är självständiga eller icke-autonoma till däggdjursepitelceller. För att testa hypotesen att en effekt drivs av processer i däggdjursepitelcellerna (cellautonoma) eller påverkas av värd-/mikromiljön (icke-självständig), behandlas konklämtaven av givarens cellfenotyp till värdens (endogena) fenotyp som ett disigt utfall. I ett exempel som en carcinogenesanalys kan tumörincidens analyseras som binärresponsdata och logistisk regressionsanalys som används för att avgöra om givaren, värd- eller givarvärdinteraktionen bidrar avsevärt till tumörincidensen vid transplantationsplatsen. Om effekten drivs av givarens egenskaper kan ett liknande transplantationsresultat observeras mellan mottagargrupper, oavsett värdens tillstånd. Om givaren epitel utvecklas som om det var endogena för värden, på grund av ett bidrag från värdens genotyp eller behandling, kan effekten vara icke-autonom. I båda situationerna bör transplantationsgrupperna där donatorepitelceller matchade värden (själv)tolkas som kontroller och slutsatser som stöds av statistiska analyser.
För att visa resultat av autonoma och icke-autonoma effekter på transplanterad epitel har en illustration tillhandahållits (figur 4A), tillsammans med bilder från ömsesidig transplantation av vild typ och Cdkn1b knockout råtta däggdjur epitel experiment. Resultaten av denna studie föreslog icke-däggdjur cell-autonoma effekter18 (figur 4B). För ömsesidiga transplantationsresultat som klassificeras som binärt svar kan sannolikheten för resultatet (t.ex. konfession av fenotyp för att vara värd för epitel eller framgångsrik utväxt i kvantitativa analyser) beroende av kategoriska variabler (t.ex. givare eller mottagare genotyp) testas genom att bygga en logistisk regressionsmodell för huvudeffekter och interaktionstermer.
Figur 1: Beredning av donatorkörtlar. (A)Översikt över förfarandet för att extrahera bröstkörtelvävnad från donatordjur och återvinna organoider för transplantation. (B)Helmonterade endogena buk-inguinal bröstkörtlar av en 4-veckors gammal råtta (typisk ålder av transplantation givare), efter aun carmine färgning. Vid 4 veckors ålder, bröst epitel var i färd med att expandera, men duktalträdet inte helt penetrera fett pad, vilket framgår av närheten till de centrala lymfkörtlarna. (C)Konsistensen av den hackade bröstkörteln visas efter hackning (rosa) i en 60 mm maträtt på is, med en lämplig mängd DMEM/F12-media för att hålla den fuktig. De intilliggande bilderna ger en jämförelse av den malet epitel efter överföring av slam till Kollagen matsmältningen Media och när matsmältningen är klar, 90-120 minuter senare. (D)De pelleta epitelorganoiderna och lagerseparationen är synliga efter centrifugering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Identifiering av gränser för vävnadsinsamling och däggdjursepitelcellinjektion. (A)Platser för råtta bröstkörtlar för vävnadsinsamling visas. Den ungefärliga placeringen av endogena buk-inguinal bröstkörtlar skördas från givare och mottagare beskrivs. (B)Efter rakning och ett ytligt snitt exponeras en transplantationsmottagares vita interscapular fettpad. Översta bilden: det mediala blodkärlet (gul pil) syns i mitten av snittet. Bottenbild: huden på ena sidan av snittet lyfts för att visa bredden på IS fettdyna under huden, i förhållande till det mediala blodkärlet (gul pil). Givaren epitel injiceras under denna flik i fettdynan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Ömsesidigt transplantationsschema. (A) Typisk experimentell design för ömsesidig transplantation visas, med genotyper som exempel. Genom att testa en enda experimentell variabel, till exempel genknockout (KO) i förhållande till wildtype (WT) skapar du 4 mottagargrupper för transplantation. (B)Exempel på utformning för ett enda mottagardjur som får 2 injektioner av donatormaterial. Flera platser för ympning är tillgängliga när du använder interscapular vit fettpad på grund av närvaron av ett blodkärl längs mittlinjen. Separata preparat av vild typ och knockout givare epitel (eller andra testförhållanden) kan injiceras till vänster och höger om blodkärlet. (C)Representativ helmonterad IS fettpadvävnad från en transplantationsmottagare visas i samma riktning som i exemplet som presenteras i (B). Mammary epitelial utväxt syns på två platser för transplantation på en helmonterad bild med alun-carmine färgade vävnad. Den interscapular fett pad punkterades som en enda bit 6 veckor efter transplantation. Ytterligare tid för epitelutveckling kan behövas men kan också underlätta överväxt och svårigheter att skilja enskilda donatortransplantat. Vanliga biologiska artefakter kan vara synliga: MS = muskel, TP = transplanterad epitel, BF = brun fettvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Mammary cell autonoma och icke-autonoma resultatanalys. (A)Simulering av resultat som kan observeras när det finns betydande bidrag av autonoma och icke-autonoma effekter på fenotyp av givaren epitel. I det här exemplet används de endogena bukinguinalkörtlarna från värden som jämförelse. Concordance av fenotyp av givare epitel utväxt, jämfört med endogena körtel, kan användas som referens, men bör inte användas för att uteslutande bestämma effekter. (B)Givarens epitelutväxt visas på transplantationsplatsen, intill bilder av den endogena körteln för alla 4 grupperna i ett ömsesidigt transplantationsexperiment. Icke-autonoma effekter på däggdjur epitel observerats efter knockout av en enda gen, Cdkn1b, vilket tyder på värdens mikromiljö påverkar utvecklingen råtta bröst körtel18. Skala barer representerar 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg behövs | Föremål på is | Upptinad/Förvärmd | Objekt nära kirurg |
| 1. Beredning av bröstkörtel epitel | 60 mm skålen | Sterila kirurgiska verktyg | |
| Aliquot av DMEM/F12 | 70% etanol | ||
| 2. Givare hjärnan utvinning | Aliquot av massmedia i 15 eller 50 ml rör (ca. 1-2 mL/donor) | Balans för vägning av hjärnan, inom sterilt fält | |
| Märkt 15 ml rör för varje givare, lämplig för homogenisering | Folie | ||
| Pipette och tips (1000 μL, eller elektroniska med 5 ml serologiska rör) | |||
| Mekanisk homogenisator | |||
| 3. Enzymatisk matsmältning av donatorkörtlar | Tillräcklig DMEM/F12 för tvättar | Serumfri matsmältningsmedia | Lab skala (g) |
| DNAse I | Monodispersion blandning | Inkubator/shaker | |
| Inaktiveringslösning | 50 ml rör (märkt) för varje givare | ||
| 10 ml (eller större) spruta för sterilfiltrering kollagen matsmältningsmedier | |||
| 20-40 μM filter | |||
| Aliquot av media till pre-våtfilter(er) | |||
| 50 ml rör för insamling av filtrerad enzymlösning | |||
| Steril sax för att skära engångsrörsspetsar | |||
| Stor bägare för insamling av supernatant, eller vakuumlinje för aspirating | |||
| 4. Transplantation | Givaren epitel + hjärnan homogenat blandning | Hamilton sprutor – 1 per donator genotyp/tillstånd | |
| Aliquot av DMEM/F12 till huvudsprutor | Skala | ||
| Sterila kirurgiska förnödenheter (skalpell/sax, flera pincett) | |||
| Sårklämr/suturer | |||
| Gasväv | |||
| 70% etanol eller isopropanol | |||
| Beta-äta eller jod | |||
| Smärtstillande | |||
| Värmestöd för mottagardjur | |||
| Pappershanddukar eller känsliga uppgiftsservetter |
Tabell 1: Artiklar som kräver förskottsersättning vid varje steg. Denna förteckning är utformad för att användas som referens vid utarbetandet av ett experiment och bör inte anses uttömmande. Reagenser får endast vara nödvändiga för specifika tillämpningar av protokollet, baserat på införande/uteslutning av valfria åtgärder. I alla experiment måste dessa objekt vara tillgängliga utan dröjsmål när proceduren har startats.
Kompletterande fil 1: Serum-fri kollagen matsmältning media beredning. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 2: Monodispersion blandning beredning. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 3: Inaktiveringslösning förberedelse. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 4: Alum-Carmine Stain Förberedelse. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en däggdjur epitelcell transplantation teknik optimerad för att arbeta med råttor. Isolerade däggdjur epitel organoider från givare råttor (3-5 veckors ålder) ympas in i interscapular vit fett pad av mottagarråttor (även 3-5 veckors ålder). Resultaten kan tolkas så lite som 4-6 veckor senare, med hjälp av ljusmikroskopi för att undersöka den ympade vävnaden; Den optimala tiden mellan transplantation och uppoffring måste dock bestämmas innan ett fullständigt experiment genomförs. Om för lite eller för mycket tid har gått, kommer resultaten varken att vara tolkningsbara eller meningsfulla. För att optimera protokollet, analysera utväxten i en liten uppsättning djur 6-8 veckor efter transplantation. Om det transplanterade epitelet är närvarande, men underutvecklad, öka tiden. Om transplantaten är väl utvecklade men överlappande funktioner i epitelet störa analyserna, överväga att minska antalet veckor för epitel utväxt. Om tiden inte kan förkortas (t.ex. i cancerframkallande experiment) rekommenderas att samma typ av donatorepitel injiceras i båda transplantationsplatserna (en på varje sida av det mediala blodkärlet), eftersom resultaten inte kan tolkas från enskilda sidor med 100% säkerhet. Om någon typ av interaktion (autokrin, paracrine) misstänks, rekommenderas det starkt att inkludera ytterligare kontrolldjur injiceras med samma typ av givare epitel i båda transplantation platser. Kritiska steg i förfarandet inkluderar korrekt kvantifiering av donatorceller efter enzymatisk matsmältning, och enhetlig blandning med hjärnan homogenisera. Extra försiktighet måste iakttas vid dessa åtgärder för att säkerställa att antalet transplanterade celler är konsekvent mellan mottagardjur. Också, under injektionen, se till att den ympade vävnadblandningen inte läcker ut ur interscapular fettpad. 3. Excising interscapular fett pad i slutet av experimentet. Hela dynan kan tas bort som en enda bit, men försiktighet måste iakttas om man väljer att separera de 2 sidorna av interscapular fettpad, skära först efter att identifiera det mediala blodkärlet. Det kan vara svårt att bestämma den sida från vilken utväxt har sitt ursprung, särskilt när ett transplantat har vuxit över till den andra, vilket gör avlägsnande som en enda bit mer idealisk.
En vanlig ändring av förfarandet är tillsats av en cancerframkallande behandling av den mottagande råttan25,29. Den ympade vävnaden kan behålla känsligheten för cancerframkallande ämnen som var besatt av givaren råtta25, eller omvänt, givaren vävnad kan anta känsligheten hos värd30. Dessa effekter kan endast bestämmas när du använder interscapular fett pad som platsen för transplantation, eftersom endogena bröstkörtlar förblir intakt och fungerar som en positiv, intern kontroll.
Vid användning av bröstkörtelorganoider för transplantation, avsaknad av epitel utväxt kan bero på problem med givaren cell förberedelse eller injektion förfarande. Graft avstötning kan också uppstå när mottagaren och givaren stammen inte är kongeniska, orsakar ett immunsvar i värden. I sådana fall erkänner mottagarens immunsystem givaren vävnad som icke-själv, initierar ett immunsvar, och den ympade vävnaden misslyckas med att växa. För att minska risken för transplantatfel när givare och mottagare befinner sig på olika genetiska bakgrunder rekommenderas minst 6, och helst rekommenderas mer än 10 generationer av backcrossing för att förhindra utmaningar som kan påverka resultattolkningen. Vid 6 backcross generationer, de flesta ympkvistar kommer att växa ut, men en minoritet kan fortfarande misslyckas. Vid felsökning av givarcellberedning som orsaken till transplantatfel, överväga om den enzymatiska matsmältningen var för hård, hölls cellerna på för höga eller för låga temperaturer, föroreningskällor, optimering av givare cellnummer som används för analysen eller andra protokollavvikelser som påverkar cellens livskraft och utväxt.
Enstaka däggdjur stamceller har visats i musen för att kunna rekonstruera en funktionell bröstkörtel, vilket illustrerar att tillägg av hormonellt stöd inte är nödvändigt för det primära resultatet. Tillägget av hjärnan homogenat avsevärt förbättrar resultatet av transplantation genom att fungera som en strukturell matris för givaren celler och minska risken för migration transplantation avstötning3,34,35,36. I kombination med hjärnhomogenat minskas det minsta antalet däggdjursepitelceller som krävs för transplantation mer än 10 gånger, jämfört med alternativ3. Viktigt, blandning av syngeneic hjärnan homogenat har inte visat sig påverka fenotyp av transplanterad epitel, och har producerat konsekventa resultat i bröst cancerframkallande ämnen och känslighet studier i över 40 år.
Vissa kan hävda att interscapular fett pad inte är representativför endogena bröst fett pad på grund av anatomiska distinktioner: närheten till IS fett pad till brun fettvävnad, potentiella skillnader i blodkärl densitet resulterar i skillnader i exponering för hormoner eller förekomsten av framstående lymfkörtlar i inguinal-buken fettpad, som kan utsätta epitelet till olika nivåer av cytokiner. Även om detta inte specifikt har testats på råttor, båda dessa depåer är subkutan och utvecklas före visceral fett37,38; i mänskliga fett, större molekylära skillnader finns i fettregioner, och heterogenitet inom grupper är inte helt klarlagt38,39. En ytterligare faktor att tänka på är att den vita interscapular och bröst fett kuddar dela Myf5+ mesenchymal föregångare härstamning, men skiljer sig i antalet celler som härrör från denpopulationen 40. Trots detta finns det tillräckliga bevis för att föreslå den vita interscapular fett pad ger en mikromiljö som liknar den lägre bröstkörteln. Mammary epitel recombined med sin egen mesenchyme utvecklar en typisk bröst mönster20, en effekt som är väl dokumenterai gnagare studier och stöder observationer i mänskliga fettvävnad19,20 ,24,41,42. Framför allt är de primära bestämningsfaktorerna för däggdjursepiteltransplantation framgång hos både råttor och möss storleken och integriteten hos fettpad43,44. Vid användning av denna teknik, många bröstcancer känslighet studier har visat att funktionella bröstvävnad kan effektivt och rutinmässigt genereras när transplanteras i den vita interscapular fett pad18,30,45.
På grund av den höga kompatibiliteten är den epitelutväxten mottaglig för däggdjurscellautonoma och icke-autonoma faktorer och kommer att reagera på hormonell manipulation av mottagarråttorna, till exempel för att främja differentiering eller funktionell utsöndring av mjölk. Transplantation av organoider används ofta för att studera faktorer som påverkar bröstkörtelutveckling och/eller cancerframkallande ämnen. Organoider kan ytterligare smältas till enstaka cell suspensioner för att underlätta kvantitativ tolkning av resultat. Medan den metod som beskrivs i detta dokument kan anpassas till transplantat intakta delar av bröstkörtelvävnad (som vanligen utförs hos möss), gör de enzymatiska dissociation sett mer detaljerade slutsatser som kan göras. Eftersom preclearing endogena bröst fett pad i råttan är inte möjligt, detta är för närvarande den enda metoden som möjliggör ympning av råtta bröst epitel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilot forskningsfinansiering från National Institutes of Health(https://www.nih.gov/), och medel från Institutionen för patologi & laboratoriemedicin vid Medical University of South Carolina. Vi vill tacka Marijne Smiths för att ha spelat in intervjuuttalandena.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | - | - | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | - | - | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | - | - | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | - | - | |
| Clean animal cages for recovery | - | - | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | - | - | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | - | - | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | - | inactivation solution |
| Gauze | - | - | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | - | monodispersion mixture |
| Heating pads | - | - | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | - | - | |
| Incubator with orbital rotation | - | - | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | - | - | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | - | - | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | - | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | - | - | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | - | - | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | - | - | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | - | - | electric clippers, or other |
| Staining jars | - | - | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | - | - | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | - | - | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | - | - | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
- Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
- Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
- Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
- Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
- Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
- Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
- Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
- Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
- Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
- Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
- Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
- Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
- Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
- Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
- Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
- Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
- Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
- Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
- Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
- Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
- Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
- Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
- Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
- Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
- Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
- Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
- Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
- Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
- Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
- Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
