Summary
Migração de células coletivas em desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase oncológica é muitas vezes guiada pelos gradientes de fatores de crescimento ou moléculas de sinalização. Descrito aqui é um sistema experimental que combina microscopia de tração com um sistema microfluídico e uma demonstração de como quantificar a mecânica da migração coletiva gradiente bioquímico.
Abstract
As células alteram os padrões de migração em resposta a estímulos químicos, incluindo os gradientes dos estímulos. A migração celular na direção de um gradiente químico, conhecida como quimiotaxia, desempenha um papel importante no desenvolvimento, na resposta imune, na cicatrização de feridas e na metástase do câncer. Enquanto a quimiotaxia modula a migração de células simples, bem como coleções de células in vivo, in vitro pesquisa centra-se em quimiotaxis de uma única célula, em parte devido à falta de ferramentas experimentais adequadas. Para preencher essa lacuna, descrita aqui é um sistema experimental único que combina microfluídica e micropadronização para demonstrar os efeitos de gradientes químicos na migração de células coletivas. Além disso, a microscopia de tração e a microscopia de estresse monocamada são incorporadas ao sistema para caracterizar mudanças na força celular no substrato, bem como entre as células vizinhas. Como prova de conceito, a migração de ilhas circulares micromodeladas de células de rim canino Madin-Darby (MDCK) é testada um gradiente de fator de crescimento de hepatócitos (HGF), um fator de espalhamento conhecido. Encontra-se que as pilhas situadas perto da concentração mais elevada de HGF migram mais rapidamente do que aquelas no lado oposto dentro de uma ilha da pilha. Dentro da mesma ilha, a tração celular é semelhante em ambos os lados, mas o estresse intercelular é muito menor no lado da maior concentração de HGF. Este novo sistema experimental pode proporcionar novas oportunidades para estudar a mecânica da migração quimotáxica por coletivas celulares.
Introduction
A migração celular em sistemas biológicos é um fenômeno fundamental envolvido na formação de tecidos, na resposta imune e nacicatrização de feridas1,2,3. A migração celular também é um processo importante em algumas doenças como o câncer4. As células geralmente migram como um grupo em vez de individualmente, o que é conhecido como migração de célula coletiva4,5. Para que as células se movam coletivamente, a detecção do microambiente é essencial6. Por exemplo, as células percebem estímulos físico-químicos e respondem alterando a motilidade, interações entre células e células, resultando em migração direcional aolongo de umgradiente químico7,8, 9,10. Baseado nesta conexão, os avanços rápidos foram feitos nas tecnologias Lab-on-a-chip que podem criar microambientes químicos bem controlados tais como o inclinação de um chemoattractant11,12,13 . Quando estes microfluídica Lab-em-um-chip-baseados tiverem sido usados previamente para estudar quimiotaxia do Ensemble celular ou dos esferoides celulares14,15,16,17, têm sido utilizados principalmente no contexto da migração de uma única célula18,19,20,21. Os mecanismos subjacentes a uma resposta coletiva celular a um gradiente químico ainda não são bem compreendidos14,22,23,24,25,26 . Assim, o desenvolvimento de uma plataforma que possibilite o controle espaciotemporal dos fatores solúveis, bem como a observação in situ das células biofísicas ajudarão a desvendar os mecanismos por trás da migração de células coletivas.
Desenvolvido e descrito aqui é um sistema microfluídico multicanalizado que possibilita a geração de um gradiente de concentração de fatores solúveis que modulam a migração de aglomerados de células padronizadas. Neste estudo, o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) é escolhido para regular o comportamento migratório das células do rim canino de Madin-Darby (MDCK). HGF é conhecido por atenuar a integridade celular e aumentar a motilidade das células27,28. No sistema microfluídico, a microscopia de tração da transformada de Fourier e a microscopia de tensão monocamada também são incorporadas, o que permite a análise da motilidade, da força contrátil e da tensão intercelular induzida pelas células constituintes em resposta a um HGF Gradiente. Dentro da mesma ilha, as células localizadas perto da maior concentração de HGF migram mais rápido e apresentam níveis de estresse intercelulares inferiores aos do lado com menor concentração de HGF. Os resultados sugerem que este novo sistema experimental é adequado para explorar outras questões em áreas envolvendo migração celular coletiva gradientes químicos de vários fatores solúveis.
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Protocol
Nota: litografia de moldes SU-8 para Estênceis (espessura = 250 μm) e partes de microcanais (espessura = 150 μm), gravura em vidro (profundidade = 100 μm) e fabricação de elenco foram terceirizadas enviando projetos usando software de design assistido por computador para os fabricantes.
1. fabricação do estêncil do polidimetilsiloxano (PDMS) e do Microchannel
- Projete o micropadrão do estêncil e do microchannel.
- Fabricar ou terceirizar os moldes SU-8 (espessura de ~ 250 μm para stencils e ~ 150 μm para microcanais) em wafers de silício (4 "de diâmetro).
- Prepare a mistura de PDMS misturando o elastómetro baixo e o agente de cura em uma relação de 10:1.
- Coloque 15 mL do elastômero de base num tubo cónico de 50 mL e adicione 1,5 mL de agente de cura. Prepare dois destes.
- Vórtice a mistura PDMS por 5 min. Centrifugue a mistura PDMS a 196 x g durante 1 min para remover as bolhas.
- Para fabricar o estêncil de PDMS, derrame ~ 1 mL da mistura de PDMS na bolacha, ao evitar as regiões modeladas SU-8 de modo que o PDMS toque o lado dos pilares SU-8 mas não a parte superior do teste padrão SU-8.
- Coloque a bolacha sobre uma superfície plana por mais de 30 min à temperatura ambiente (RT). Cure o PDMS em um forno seco a 80 ° c por mais de 2 h.
- Descasque com cuidado o PDMS do molde SU-8 e apare a membrana fina de PDMS usando um perfurador oco de 14 milímetros. Retire a poeira na superfície das peças PDMS usando fita adesiva e autoclave os stencils PDMS.
- Para fabricar o microcanal PDMS, despeje ~ 30 mL de mistura PDMS sobre o molde SU-8.
- Degas por 30 min em uma câmara de vácuo e curar o PDMS em um forno seco a 80 ° c por mais de 2 h.
- Descasque com cuidado o PDMS do molde SU-8 e corte o PDMS a um tamanho de 24 milímetros x 24 milímetros. Em cada bloco de PDMS, crie uma tomada e três entradas usando um perfurador da biópsia de 1 milímetro.
2. preparação de vidro inferior com gel de poliacrilamida (PA)
- Fabricar ou terceirizar vidros de slides retangulares (24 mm x 24 mm x 1 mm) com um micro-poço retangular (6 mm x 12 mm, 100 μm de profundidade29) por óculos de corte e gravura.
- Silanize a superfície de um vidro inferior30.
- Prepare uma solução de silano de ligação misturando 200 mL de água deionizada (DIW), 80 μL de ácido acético e 50 μL de 3-(trimetoxisililo) de metacrilato de propilo (TMSPMA) por 1 h.
PRECAUÇÃO: o TMSPMA é um líquido combustível. Siga as recomendações em fichas de dados de segurança de material. Use apenas em uma capa de fumaça química. - Retire a poeira da superfície do vidro por fita adesiva e autoclave do vidro.
- Cubra a superfície gravada do vidro inferior com 100 μL da solução de silano de ligação e deixe o vidro na RT durante 1 h.
- Enxague o vidro com DIW 3x e deixe o vidro secar à temperatura do ar ambiente ou soprando ar.
- Prepare uma solução de silano de ligação misturando 200 mL de água deionizada (DIW), 80 μL de ácido acético e 50 μL de 3-(trimetoxisililo) de metacrilato de propilo (TMSPMA) por 1 h.
- Prepare uma solução de gel para o gel de PA31.
- Prepare uma solução fresca de 0,5% (w/v) de persulfato de amônio (APS) dissolvendo 5 mg de APS em 1 mL de DIW.
- Prepare a solução de gel PA constituída por 138 μL de solução de acrilamida a 40%, 101 μL de solução de 2% de bis-acrilamida, 5 μL de solução de partículas fluorescentes (0,2 μm) e 655 μL de DIW.
Atenção: as soluções de acrilamida e bisacrilamida são tóxicas. Use luvas de proteção, roupas e proteção ocular. Proteja a solução do gel do PA que contem partículas fluorescentes da luz.
Nota: vórtice a solução de cordão fluorescente antes de introduzir pipetagem para obter um número uniforme de grânulos fluorescentes por lote. - Depois de adicionar 100 μL da solução APS e 1 μL de tetrametilenodiamina (TEMED), transfira 10 μL de solução de gel mista para o micro-poço retangular e coloque no topo uma cobertura circular (18 mm).
Nota: para encher o vidro inferior com gel de PA sem bolhas, coloque solução de gel suficiente na ranhura do vidro inferior, deslize cuidadosamente a lamínula sobre a solução de gel e retire qualquer solução em excesso de gel.
Cuidado: o gel é curado lentamente por aproximadamente 40 min. O procedimento a seguir para os géis de centrifugação deve ser efectuado o mais rapidamente possível. - Vire a montagem de vidro personalizado, solução de gel, e lamínula, em seguida, centrifugar por 10 min em 96 x g para trazer partículas fluorescentes para a camada superior de gel PA.
- Retire a montagem da centrífuga e coloque-a sobre a superfície plana com a lamínula virada para baixo.
Nota: começando com a etapa 2.3.6, manipule amostras em um gabinete de biossegurança. - Após 30 min, vire o conjunto e coloque-o em uma placa de Petri de 35 mm, encha com 2 mL de DIW, e (usando fórceps) retire suavemente a lamínula deslizando-a para um lado.
Nota: o gel curado do PA pode ser armazenado em DIW por 1 mês. No entanto, uma vez que o colágeno é revestido no gel PA, ele deve ser usado em um experimento dentro de 1 dia.
- Revestimento de colágeno no gel PA.
- Dissolver 1 mg/mL de sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-SANPAH) em warm 50 mM HEPES buffer. Soltar 200 μL da solução na superfície do gel e ativar por luz UV (comprimento de onda de 365 nm) durante 10 min.
Nota: Proteja o sulfo-SANPAH da luz. - Enxague o gel com 0,1 M [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineetanoesulfonic acid; HEPES] buffer 2x e com PBS 1x.
- Coat o gel do PA com solução do colagénio (100 μg/mL em PBS, tipo I do colagénio da cauda do rato) em 4 ° c durante a noite. No dia seguinte, lave com PBS 3x.
- Dissolver 1 mg/mL de sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-SANPAH) em warm 50 mM HEPES buffer. Soltar 200 μL da solução na superfície do gel e ativar por luz UV (comprimento de onda de 365 nm) durante 10 min.
3. micropatterning de consoles da pilha
- Prepare a solução F-127 (tabela de materiais) [2% (p/v) em PBS] e mergulhe o estêncil PDMS autoclavado na solução f-127. Mantenha-o em uma incubadora de 37 ° c por 1 h.
- Prepare a solução da pilha (2 x 106 Cell/ml) nos meios de cultura da pilha que consistem em: Dulbecco ' s modificou o meio da águia (DMEM) com o soro bovino fetal de 10% (FBS) e o antibiótico-antimycotic de 1% (AA).
- Lave o estêncil de PDMS com PBS 3x e remova o líquido do estêncil de PDMS e do gel do PA. Coloc o estêncil de PDMS no gel do PA e adicione o PBS ao estêncil.
- Remova as bolhas nos furos do estêncil de PDMS pipetando delicadamente. Depois de remover bolhas, remova o PBS da superfície do estêncil PDMS.
- Após ter põr 200 μL da solução da pilha no estêncil de PDMS, mantenha o gel do PA em uma incubadora para 1 h de modo que as pilhas anexem ao gel do PA.
- Lave delicadamente a solução da pilha com meios de cultura da pilha, remova o estêncil de PDMS, e adicione mais meios da cultura de pilha. Verifique a formação de ilhas de células um microscópio.
4. montagem do gel do PA com Microchannel de PDMS
- Remova a poeira no Microchannel de PDMS usando a fita adesiva, então autoclave.
- Trate a superfície do Microchannel de PDMS com plasma do oxigênio (80 W, 50 quilohertz) para 30 s.
- Após ter removido todo o líquido no vidro inferior gel-enchido PA, coloc o Microchannel de PDMS sobre o vidro inferior e põr o conjunto sobre o suporte de vidro feito encomenda.
- Preencha o microcanal com meio de cultura celular.
Cuidado: Certifique-se de remover todas as bolhas presas nos canais, liberando suavemente a mídia morna com uma pipeta. Além disso, ao remover bolhas, certifique-se de não desanexar ilhas de células micromodeladas.
5. sistema microfluídico integrado
- Ligue os Tubings.
- Prepare os conectores cortando a ponta das agulhas (18 G) e dobrando-a 90 °.
- Prepare linhas de tubulação para três entradas e uma tomada.
- Para a tubulação da entrada, conecte a agulha aparada e uma linha do mini-volume de 30 cm com uma torneira de três sentidos. Prepare três destes.
- Para tubos de saída, conecte a agulha aparada e uma linha de mini volume de 75 cm com uma torneira de três vias. Prepare um desses.
- Encha as tubulações com o meio que foi pré-aquecido por 1 h.
PRECAUÇÃO: Certifique-se de que remove todas as bolhas presas nas linhas da tubagem, liberando suavemente os suportes quentes com uma seringa.
- Prepare reservatórios removendo os êmbolos das seringas e conectando as linhas da tubulação de entrada.
- Conecte os conectores da agulha de cada linha de tubulação nas três entradas e uma saída do dispositivo microfluídico.
- Encha os reservatórios com 3 mL de meio fresco ou meio condicionado cada.
- Para o teste de gradiente, encha o reservatório de entrada à esquerda com 20 ng/mL de HGF no meio de cultura celular.
- Para a visualização do gradiente de concentração, adicione um corante fluorescente de 200 μg/mL (rodamina B-Dextran, 70 kDa) ao reservatório de entrada esquerdo.
- Ligue a linha da tubagem de saída a uma bomba de seringa.
Nota: o modo de funcionamento da bomba da seringa é "retirada". A taxa de fluxo é mudada de acordo com a capacidade da seringa e da velocidade de funcionamento da bomba da seringa.
- Coloque o sistema microfluídico integrado no estágio de um microscópio epifluorescente convencional.
Cuidado: para gerar um gradiente suave de HGF no canal microfluídico, a vazão deve ser tão lenta quanto 0,1 μL/min. Isto é suficientemente sensível de modo que exija a estabilização para 2 h, e o cuidado deve ser tomado para evitar o distúrbio físico durante o experimento.
6. aquisição de imagens
- Tirar imagens a cada 10 min para até 24 h usando um microscópio automatizado alojado em uma incubadora. Em cada timepoint, tome um jogo das imagens usando uma lente objetiva 4x em três canaletas diferentes, incluindo a imagem da fase para visualizar a migração da pilha, a imagem fluorescente verde para visualizar os grânulos fluorescentes incorporados no gel do PA, e a imagem fluorescente vermelha para Visualizar gradiente de concentração de um produto químico.
- Depois de tomar imagens de lapso de tempo, inutilizar 0,25% Trypsin-solução de EDTA em microcanais para separar as células do gel de PA. Depois de remover completamente as células do gel, tome uma imagem fluorescente verde para ser usado como uma imagem de referência para microscopia de tração.
7. análise de dados
Nota: um código personalizado para análise de dados foi desenvolvido usando o MATLAB, e detalhes foram descritos em outros lugares32,33,34,35,36.
- Para análise de imagem de fase, calcule deslocamentos em duas imagens de fase consecutivas usando a velocimetria de imagem de partícula36.
- Para a microscopia de tração de transformada de Fourier, compare cada imagem fluorescente verde com a imagem de referência e calcule os deslocamentos em cada imagem usando a velocimetria de imagem de partícula36. Dos deslocamentos, recupere a tração feita por pilhas no gel do PA usando a microscopia da tração da transformação de Fourier33,34,37.
- A partir dos dados de tração, calcule o estresse dentro da monocamada da ilha da célula usando a microscopia de tensão monocamada com base nos métodos de elementos finitos32,34,38.
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Representative Results
Para explorar a migração coletiva gradiente químico, foi integrado um sistema microfluídico com microscopia de tração (Figura 1). Para construir o sistema integrado, o gel do poliacrilamida (PA) foi fundido no vidro do costume-corte, e as pilhas de MDCK foram semeadas dentro das Ilhas micromodeladas feitas por um estêncil de PDMS. Para este experimento, foram criadas doze ilhas de células MDCK (quatro fileiras por três colunas, diâmetro de ~ 700 μm). Após células anexadas a géis PA, o estêncil PDMS foi removido para iniciar a migração coletiva. O canal microfluídico pré-fabricado foi colocado em cima dos géis PA para construir canal microfluídico acima das Ilhas celulares (Figura 1a).
Para então estabelecer um gradiente de concentração dentro do canal microfluídico, a entrada esquerda foi conectada ao reservatório de suprimento contendo uma solução de corante fluorescente. Adicionalmente, o meio e as entradas direitas foram conectados aos reservatórios da fonte que contêm meios somente. Em seguida, a tomada foi conectada à bomba da seringa para remover o fluido do canal microfluídico. O sanduíche do vidro feito-à-medida e do canal microfluídicos foi introduzido no estágio costume-construído do microscópio. As amostras junto com o microscópio fluorescente automatizado foram mantidas dentro de uma incubadora para a imagem latente viva da pilha. Ao longo dos experimentos, as células foram mantidas a 5% CO2 e 37 ° c. Um gradiente da intensidade do corante fluorescente foi rapidamente estabelecido a uma vazão de 0,125-2 μL/min (Figura 2a). A inclinação do gradiente dependia da taxa de fluxo. Por exemplo, a uma vazão de 0,125 μL/min, o gradiente foi desenvolvido ao longo de 1,5 mm, que é o tamanho comparável das Ilhas celulares (Figura 2B).
Em seguida, o dispositivo integrado com células foi testado. As ilhas de células MDCK foram micromodeladas e montadas com o canal microfluídico, conforme descrito acima. Primeiramente, sem aplicar nenhum fluxo no microchannel, foi assegurado que a ilha celular se espalhou bem dentro do dispositivo. Durante um período de 12 h, a ilha expandiu-se, e a velocidade média de migração foi de ~ 0,1 – 0,2 μm/min. Quando havia umas variações entre consoles a respeito de quanto o console expandiu, todas as pilhas pareceram saudáveis na condição do nenhum-fluxo. Em seguida, o fluxo foi aplicado sobre estas ilhas, e verificou-se que a uma taxa de fluxo de 0,1 μL/min, a ilha celular se espalhou bem, e as células mantiveram uma velocidade média de migração de ~ 0,1 – 0,2 μm/min para 12 h. No entanto, ao aumentar a vazão para 0,5 μL/min, as células não se espalharam bem, e a velocidade média de migração diminuiu para abaixo de 0,1 μm/min. Além disso, morfologias das células apareceram diferentes e apareciam ser destacadas a partir dos géis de PA (Figura 3). Com base nesses dados, 0,1 μL/min foi escolhido como a vazão para os experimentos a seguir.
Para testar os efeitos de um gradiente químico na migração de células coletivas, o HGF foi escolhido32,34. A entrada esquerda foi conectada a 1) os meios de cultura da pilha da terra arrendada do reservatório da fonte com solução de HGF (20 ng/ml) e 2) os outros 2 entradas com os reservatórios que prendem meios de cultura da pilha. Com uma vazão de 0,1 μL/min, o fluxo sobre as ilhas de células migratórias (quatro linhas por três colunas) foi mantido por 10 h (Figura 4). Como mostrado em um experimento separado, a concentração de HGF na coluna esquerda estava próxima da concentração da solução de suppling (20 ng/mL), e na coluna da direita, esta era próxima de zero. A concentração de HGF na coluna média diminuiu gradualmente da metade esquerda à metade direita. Ao comparar o tamanho das Ilhas celulares após 10 h, as ilhas na coluna direita não se expandiram muito, mas aquelas na coluna esquerda tornaram-se significativamente maiores e expandidas em todas as direções (Figura 4a). Tais mudanças no tamanho da ilha foram apoiadas pelas trajetórias de células dentro de cada ilha (Figura 4B). Curiosamente, as ilhas na coluna do meio não se expandiram para a direita (onde a concentração de HGF foi baixa), mas expandiu-se preferencialmente para a esquerda (onde a concentração de HGF era alta). Quando houve pouca mudança na velocidade média da migração na coluna direita, nas colunas esquerdas e médias, a velocidade média da migração aumentou gradualmente para os primeiros 3 h, a seguir diminuiu gradualmente (Figura 4C).
Para medir a força contrátil e o estresse intercelular, a microscopia de tração37,39,40 e a microscopia de estresse monocamada foram combinadas com o canal microfluídico33,35, 38. Ao longo de 10 h durante a aplicação do gradiente químico, imagens de partículas fluorescentes foram colhidas em géis PA, e a força (por unidade de área) aplicada pelas células do substrato foi analisada utilizando-se a microscopia de tração de Fourier35, 37. Tração foi plotada em coordenadas polares. O azul representa a força para o centro da ilha, e o vermelho representa a força afastada do centro.
No tempo zero, todas as ilhas mostraram distribuições de tração semelhantes, com forte tração interna na borda e flutuação dentro da ilha. Essa flutuação foi semelhante à mostrada anteriormente34,35,41. Após 10 h de aplicação do gradiente de HGF, enquanto o grau de expansão da ilha foi diferente em cada coluna, as distribuições de tração foram em grande parte semelhantes ao tempo zero (Figura 5a). A tração média não foi alterada por 10 h (Figura 5C). No entanto, ao calcular a tensão de monocamada, cada coluna apresentou diferentes tendências. Na coluna da direita (onde a concentração de HGF era baixa), a tensão média dentro das ilhas foi mantida em torno de 200 PA ao longo de um período de 10 h. Na coluna da esquerda (onde a concentração de HGF era alta), a tensão média dentro das Ilhas diminuiu gradualmente de 230 Pa para 100 PA acima de 10 h, como mostrado anteriormente32,34. Na coluna do meio (onde a concentração de HGF era alta na metade esquerda e baixa na metade direita da ilha), a tensão média foi mantida em torno de 150 PA.
Figura 1: esquemático da preparação do dispositivo integrado. (A) para fabricar o dispositivo integrado, um vidro inferior com gel do PA em que as ilhas da pilha foram modelados usando um estêncil de PDMS foi coberto com um Microchannel de PDMS. (B) os dispositivos integrados foram fixados usando um suporte personalizado para evitar vazamento de fluido e dissociação de componentes. (C) após o dispositivo enchido com o líquido sem bolhas, os reservatórios foram conectados às entradas, e uma bomba da seringa foi conectada à tomada. Todos os set-ups experimentais foram colocados em um sistema de imagens de células ao vivo. (D) o esquema mostra o desenho e a composição dos canais microfluílicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: estabelecendo o gradiente uímico c. (A) as imagens de fluorescência da rhodamina B-conjugated dextrano (70 kDa) visualizam o gradiente de concentração o fluxo de fluido de 0,125 μl/min, 0,5 μL/min e 2 μl/min. os círculos pontilhado indicam a posição das ilhas de células padronizadas. (B) o perfil de intensidade da imagem de fluorescência mostra que o gradiente de concentração no dispositivo foi ajustável pela vazão. As barras de erro indicam desvio padrão. As barras coloridas indicam as posições de coluna da ilha de células padronizadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: migração de ilhas de células MDCK fluxo. (A) asimagens da fase em 12 h do console da pilha de MDCK em cada taxa de fluxo (0 μl/min, 0,1 μl/min, e 0,5 μL/min) mostram que as ilhas de pilha expandiram bem em uma taxa de fluxo baixa mas não se expandem em uma taxa de fluxo elevada. As linhas pontilhadas representam os limites em 0 h. (B) a média e o histograma da velocidade celular dentro de cada ilha a cada 10 min por 12 h. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: migração de ilhas de células MDCK gradiente de fluxo e química. (A) afaixa de intensidade relativa da rhodamina B-conjugada dextrano manteve um gradiente de concentração de HGF constante em cada coluna após a estabilização para 2 h. (B) imagens de fase a 10 h (linha pontilhada = limite de ilha de células a 0 h) da célula MDCK Ilha o gradiente HGF (da esquerda para a direita: 20 – 0 ng/mL) mostram que a ilha expandiu mais onde a concentração de HGF foi maior. (C) as trajetórias de caminhos de migração (codificação de cores indica o comprimento do caminho) das células nas ilhas de células MDCK. Linhas pontilhadas e linhas tracejadas representam os limites de cada ilha de célula em 0 h e 10 h, respectivamente. (D) a média e o histograma da velocidade celular dentro de cada ilha a cada 10 min por 10 h. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: interações mecânicas de ilhas de células MDCK. (A) osmapas de tração (interação célula-substrato) nas ilhas celulares a 0 h e 10 h o gradiente HGF. Os mapas foram plotados na coordenação radial, com tração externa usando cor morna e tração interna usando a cor fria. (B) os mapas de tensão monocamada (interações Cell-Cell) nas ilhas de células em 0 h e 10 h gradiente de HGF. (C) a parcela da tração média (quadrado cinzento) e da tensão (círculo azul) dentro das ilhas da pilha o inclinação de HGF sobre o tempo cada 10 minutos por 10 h. As bandas de cor representam o meio-quartil (~ 25% – 75%). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura complementar S1: distribuição adequada do talão necessária para uma qualidade de dados suficiente durante a análise da força de tração. São mostrados exemplos de boas imagens fluorescentes de talão de qualidade (esquerda) e ruim (à direita) com imagens ampliadas nas caixas brancas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A migração coletiva das células constituintes é um processo importante durante o desenvolvimento e a regeneração, e a direção migratória é muitas vezes guiada pelo gradiente químico dos fatores de crescimento4,23. Durante a migração coletiva, as células mantêm a interação com células vizinhas e substratos subjacentes. Tais interações mecânicas dão origem a fenômenos emergentes, como durotaxis42, plithotaxis33e kenotaxis43. No entanto, esta pesquisa foi realizada utilizando-se uma única concentração de fatores de crescimento, como os do soro fetal bovino. Para preencher a lacuna, este protocolo descreve uma nova plataforma experimental que pode medir interações mecânicas durante a migração coletiva de celular um gradiente químico.
A nova plataforma combina três sistemas experimentais que têm sido amplamente utilizados: micropadronização, microscopia de tração e microfluílicos. Primeiramente, o micropatterning de consoles da pilha para a migração coletiva foi executado. Em segundo lugar, tanto a microscopia de tração quanto a microscopia de estresse monocamada foram utilizadas para medições mecânicas das células migratórias. Finalmente, uma plataforma de microfluílicos foi usada para estabelecer gradiente químico sobre as células migratórias. Com este sistema experimental, demonstrou-se que as células dentro de uma única ilha migram diferentemente em resposta a diferentes gradientes químicos.
Conforme descrito na Figura 2, o gradiente químico forma apenas uma distância de 1 mm no meio do microcanal. Os consoles na coluna esquerda tornam-se expor à concentração máxima, e aqueles na coluna direita são expor à concentração mínima. Em contraste, as ilhas na coluna do meio são expostas ao gradiente químico. Desta forma, a resposta das Ilhas celulares é medida no máximo, mínimo, e um gradiente de concentrações de um fator solúvel durante o mesmo experimento. Usando esta disposição de consoles da pilha, um aumento gradual na velocidade celular da migração foi observado enquanto a concentração de HGF aumentou.
Para obter dados de alta qualidade, há etapas-chave no procedimento que exigem atenção especial. Os géis de PA em um substrato de vidro personalizado devem ser perfeitos em relação à distribuição de partículas fluorescentes e revestimento superficial de colágeno. Isso porque sem géis de PA de alta qualidade, um conjunto de dados de alta qualidade para análise de tração e análise de tensão de monocamada não pode ser adquirido. Exemplos de imagens de talão de alta qualidade são mostrados na Figura complementar 1. Os canais microfluílicos são muito pequenos, e as bolhas são facilmente presas neles. Estas bolhas não só perturbar o fluxo, mas também pode varrer as células de distância, se eles começam a se mover ao longo do fluxo. Portanto, é crucial preencher os canais microfluílicos sem bolhas. Para alcançar um gradiente estável dentro do microcanal, o equilíbrio de pressão dentro das três entradas é muito importante. Para evitar desequilíbrios entre eles, grandes reservatórios devem ser usados para que quaisquer desequilíbrios no início de um experimento possam ser facilmente ajustados. Esta nova plataforma ajudará a explorar ainda mais a mecânica da migração de células coletivas gradientes químicos, que é fundamental para a compreensão da regeneração, metástase do câncer e desenvolvimento.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP) (não. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant e o programa BK 21 Plus. Também foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
References
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