Summary
Децеллюлярная внеклеточная матрица (dECM) может обеспечить подходящие микроэкологические сигналы для повторения присущих им функций целевых тканей в инженеризированной конструкции. В этой статье разъясняется протоколы для децеллюляризации ткани поджелудочной железы, оценка поджелудочной ткани полученных dECM биоинки, и поколение 3D поджелудочной ткани конструкций с использованием техники биопечати.
Abstract
Трансплантация островков поджелудочной железы является перспективным лечением для пациентов, которые страдают от диабета типа 1 сопровождается гипогликемией и вторичными осложнениями. Тем не менее, трансплантация островков по-прежнему имеет ряд ограничений, таких как низкая жизнеспособность пересаженных островков из-за плохого прививок островков и враждебной среды. Кроме того, инсулин-производящие клетки продифференцированные от людских плюрипотентных стволовых клеток имеют лимитированную способность секретировать достаточные инкрети которые могут отрегулировать уровень глюкозы крови; поэтому, улучшение созревания путем культивирования клеток с надлежащей микроэкологические сигналы настоятельно необходимо. В этой статье мы разъясняем протоколы для подготовки поджелудочной ткани полученных децеллюлярной внеклеточной матрицы (pdECM) биоинки для обеспечения полезной микросреды, которые могут увеличить чувствительность глюкозы островков поджелудочной железы, а затем описание процессы генерации 3D ткани поджелудочной железы построены с использованием микроэкструзии на основе биопечати техники.
Introduction
В последнее время трансплантация поджелудочной железы является перспективным методом лечения для пациентов с диабетом типа 1. Относительная безопасность и минимальная инвазивность процедуры являются большими преимуществами этого лечения1. Тем не менее, он имеет ряд ограничений, таких как низкий уровень успеха изоляции островков и побочные эффекты иммуносупрессивных препаратов. Кроме того, количество привяженных островков неуклонно уменьшается после трансплантации из-за враждебной среды2. Различные биосовместимые материалы, такие как альгинат, коллаген, поли (молочно-когликолевая кислота) (PLGA) или полиэтиленгликоль (PEG) были применены к трансплантации поджелудочной железы, чтобы преодолеть эти трудности.
Технология 3D-печати клеток появляется в тканевой инженерии благодаря своему большому потенциалу и высокой производительности. Излишне говорить, что биоинки известны как важные компоненты для обеспечения подходящей микросреды и позволяет улучшить клеточные процессы в печатных конструкций ткани. Значительное количество гидрогелей, разжижающих сдвига, таких как фибрин, альгинат и коллаген широко используются в качестве биоинков. Тем не менее, эти материалы показывают отсутствие структурной, химической, биологической и механической сложности по сравнению с внеклеточной матрицы (ECM) в родной ткани3. Микроэкологические сигналы, такие как взаимодействие между островками и ECM являются важными сигналами для повышения функции островков. Децеллюлярный ECM (dECM) может воссоздать тканевый специфический состав различных компонентов ECM, включая коллаген, гликозаминогликанов (GAGs) и гликопротеинов. Например, первичные островки, которые сохраняют свои периферийные ЭКМ (например, i тип I, III, IV, V, и VI коллаген, ламинин и фибронектин) обладают низким апоптозом и лучшей чувствительностью к инсулину, что указывает на то, что взаимодействие клеток-матрицы типа I, III, IV, V и VI, имеют низкий уровень апоптоза и лучшую чувствительность к инсулину, что указывает на то, что взаимодействие клеток-матрицы, специфичное для тканей, имеет важное значение для повышения их способности функционировать аналогично оригинальной ткани4.
В этой работе мы разъясняем протоколы для подготовки поджелудочной ткани полученных децеллюлярной внеклеточной матрицы (pdECM) биочернила для обеспечения полезных микроэкологических сигналов для повышения активности и функций островков поджелудочной железы, а затем процессы для генерации 3D поджелудочной ткани конструкций с использованием микроэкструзии основе биопечати техники (Рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Свиные ткани поджелудочной железы были собраны с местной скотобойни. Эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Медицинского центра Асан, Сеул, Корея.
1. Децеллюляризация тканей
- Подготовьте решения для децеллюляризации.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1x фосфат-буферный солен (PBS), используемый во всех препаратах раствора, разбавляется путем добавления дистиллированной воды в 10x PBS.- Для 1% Triton-X 100 раствор, растворить 100 мл 100% Triton-X 100 раствор в 900 мл 1x PBS с помощью магнитного перемешивания бар с перемешиванием при перемешивании при 150 об/мин на 6 ч. Сделать 400 мл 1% Triton-X 100 раствор с 40 мл 10% Triton-X 100 раствора PBS подготовлен ы перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10% Раствор Triton-X 100 может храниться при комнатной температуре до тех пор, пока это необходимо. - Для раствора перацетической кислоты 0,1% разбавлять 8,5 мл 4,7% перацетической кислоты в 22,8 мл 70% этанола с 368,7 мл дистиллированной воды непосредственно перед использованием.
- Для 1% Triton-X 100 раствор, растворить 100 мл 100% Triton-X 100 раствор в 900 мл 1x PBS с помощью магнитного перемешивания бар с перемешиванием при перемешивании при 150 об/мин на 6 ч. Сделать 400 мл 1% Triton-X 100 раствор с 40 мл 10% Triton-X 100 раствора PBS подготовлен ы перед использованием.
- Удалить периферических тканей поджелудочной железы и нарезать ткани до децеллюляризации.
- Вымойте резекционированную свиную поджелудочную железу с проточной водопроводной водой и удалите периферийные ткани с помощью стерилизованных ножниц.
- Перенесите поджелудочную железу в полиэтиленовый пакет с щипками и заморозить при -80 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы помочь сократить поджелудочной железы эффективно для следующего шага.
- Нарежьте замороженную поджелудочную железу на кусочки толщиной 1 мм с помощью терки.
- Перенесите 50 г нарезанной ткани в пластиковый контейнер объемом 500 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковый контейнер с крышкой рекомендуется здесь, чтобы защитить ткани от загрязнения и предотвратить испарение раствора.
- Лечение реагентами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс децеллюляризации должен осуществляться при 4 градусах По Цельсию на цифровом орбитальном шейкере при 150 об/мин. Во всех этапах децеллюляризации, физическое отслоение с помощью щипцы требуется, чтобы предотвратить ломтики поджелудочной железы от слипания. Мытье контейнера дистиллированной водой необходимо для полного удаления остаточных реагентов в контейнер.- Перед любой реагентной обработкой промойте 50 г нарезанной поджелудочной железы 300 мл дистиллированной воды с помощью шейкера.
- Непрерывно перемешайте ткань при 150 об/мин до тех пор, пока мутная вода не исчезнет (примерно после 12 ч). Замените дистиллированную воду каждые 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение дистиллированной воды каждый час рекомендуется для эффективности, чтобы удалить мутную воду быстрее. - Откажитесь от воды и обработайте 50 г тканей 400 мл 1% Triton-X 100 в растворе 1x PBS за 84 ч. Оспособьте раствор каждые 12 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, количество ткани будет уменьшаться, потому что клеточные компоненты начинают удаляться. - Лечить с 400 мл изопропанола (IPA) в течение 2 ч, чтобы удалить оставшийся жир из поджелудочной железы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально для ткани, чтобы стать жестким из-за удаления жира в этом процессе. - После 2 ч, удалить IPA и мыть ткани с 400 мл 1x PBS для 24 ч. Освежить 1x PBS каждые 12 ч.
- Для стерилизации децеллюлярной ткани отбросьте предыдущее раствор и обработайте 400 мл перацетической кислоты в 4% этанола на 2 ч.
- Чтобы удалить остаточное моющее средство, промойте ткань 400 мл 1x PBS на 6 ч. Освежите раствор каждые 2 ч.
- Соберите децеллюляризованные ткани в конической трубке 50 мл с помощью щипц.
- Заморозить образец при -80 градусов по Цельсию на 1 ч. Обложка конической трубки с без ворса протрите вместо крышки и исправить с резинкой для эффективной лиофилизации.
- Лиофилизацию децеллюлярной ткани при -50 градусов по Цельсию в течение 4 г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шага 1.3, 1 г неклеточной ткани также должны быть лиофилизированы в тех же условиях.
2. Оценка децеллюляризованных тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки остаточного количества dsDNA, гликозаминогликанов (GAGs) и коллагена в децеллюляризованной ткани по сравнению с родной тканью, по крайней мере 1 г каждой из неклеточных тканей (родной ткани) и децеллюляризованной ткани необходимы для одного пакет оценки. Количество dsDNA, GAGs, и коллагена можно вычислить на основе сухого веса ткани.
- Подготовьте решения для биохимических анализов.
- Приготовьте пасаинраствор для пищеварения образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество буфера, которое должно быть сделано, может быть скорректировано в зависимости от количества образцов.- Растворите 119 мг 0,1 м фосфата натрия (монобастичный), 18,6 мг 0,5 мм Na2-EDTA и 8,8 мг 5 мм цистеина-HCl в 10 мл автоклавированной воды.
- Отрегулируйте рН раствора до 6.5, добавив 10 M NaOH раствор.
- Добавьте 125 л из 10 мг/мл папинского бульона раствором к вышеупомянутому раствору и вихрю, что позволяет каждому элементу равномерно перемешать.
- Подготовьте решения для диметил-метиленовой синего (DMMB) асссе.
- Чтобы сделать краситель DMMB, растворить 8 мг 1,9-диметил-метилена голубого цинка хлорида двойной соли, 1,52 г глицина, и 1,185 г NaCl в 500 мл автоклавной воды. Отрегулируйте рН до 3, добавив 0,5 М HCl решение при измерении изменения рН с помощью скамейки верхней рН метр. Затем процедите это через вакуумный фильтр для бутылок 500 мл.
- Сделать 15 л из 10 мг/мл хондроитин сульфат раствор для стандартного.
- Подготовьте решения для гидроксипролина.
- Для работоспособного раствора хлорамина растворите 2,4 г ацетата натрия, 1 г лимонной кислоты и 0,68 г гидроксида натрия в 24 мл дистиллированной воды и добавьте 240 л ледниковой уксусной кислоты, 10 л толуэна и 6 мл iPA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворите все порошки в растворе с помощью вихревого миксера. Рабочий раствор хлорамин может храниться при 4 градусах Цельсия в течение трех месяцев. - Для раствора хлорамина T растворите 0,35 г хлорамина T в 20 мл рабочего раствора хлорамина и добавьте 2,5 мл МПА. Вихрь смешать все компоненты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте непосредственно перед использованием. - Для раствора P-DAB положите 3,75 г P-DAB в 6,5 мл перхлорной кислоты и 15 мл МПА; заверните его в алюминиевую фольгу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте непосредственно перед использованием.
- Для работоспособного раствора хлорамина растворите 2,4 г ацетата натрия, 1 г лимонной кислоты и 0,68 г гидроксида натрия в 24 мл дистиллированной воды и добавьте 240 л ледниковой уксусной кислоты, 10 л толуэна и 6 мл iPA.
- Приготовьте пасаинраствор для пищеварения образца.
- Добавьте 1 мл папинского раствора в 10 мг лиофилизированной ткани в микроцентрифуге мощностью 1,5 мл и вихрь трубки, чтобы лучше переварить образец.
- Поместите микроцентрифуговую трубку 1,5 мл в резиновую стойку и переварить образцы в стакане 500 мл, который содержит 300 мл воды при 60 градусах по Цельсию на 16 ч.
- Центрифуга при 9500 х г в течение 20 минут, соберите супернатант и перенесите его в новую трубку.
- Количественная оценка остаточной ДНК и основных белков в децеллюляризованной ткани.
- Загрузите 1 зл переваренных образцов в спектрометр и измерьте количество dsDNA в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментатор должен связать их волосы назад и носить маску, чтобы избежать загрязнения образца.
- Загрузите 1 зл переваренных образцов в спектрометр и измерьте количество dsDNA в соответствии с инструкциями производителя.
- Выполните анализ DMMB для количественной оценки количества GAGs, который остается в децеллюляризованной ткани.
- Смешайте 1 зл хондроитина сульфата раствора и 499 Л Л 1x PBS, чтобы сделать стандарты. Разбавить хондроитин сульфат Раствор с дистиллированной водой в концентрациях 0, 4, 8, 12, 16 и 20 мкг/мл.
- Загрузите триплетаты по 50 л каждой концентрации стандартных и переваренных образцов в 96-хорошую пластину.
- Добавьте 200 л красителя DMMB к каждому колодцу с помощью многоканального пипетки.
- Сразу же прочитайте абсорбцию при 525 нм на микроплите считывателя.
- Выполните гидроксипролиновый ассидля для количественной оценки количества коллагена.
- Для проведения гидроксипролиновой асссеи, инкубировать 250 л переваренного образца с равными объемами HCl при 120 градусах По кв 16 ч.
- Высушите остатки при комнатной температуре в течение 3 ч, чтобы охладить образцы, а затем повторно растворить образцы в 1 мл 1x PBS.
- Центрифуга при 2400 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Приготовьте 100 мкг/мл гидроксипролина раствор в стандартной.
- Разбавить раствор гидроксипролина дистиллированной водой в концентрации 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 мкг/мл для стандартного раствора.
- Загрузите триплики 50 л образцов и стандартный раствор в 96-хорошую пластину.
- Добавьте 50 л раствора хлорамин T, затем инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 50 qL раствора p-DAB и инкубировать в течение 30 минут при 60 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликот в темной комнате. После добавления оберните тарелку алюминиевой фольгой. - Инкубировать при комнатной температуре 30 мин.
- После охлаждения измерьте абсорбцию на уровне 540 нм на микроплите.
3. Препарат биоинк
ПРИМЕЧАНИЕ: порошок pdECM может храниться при -80 градусов по Цельсию в течение по крайней мере одного года. Перед регулировкой рН, переваренный раствор pdECM может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение одного месяца. Перед использованием, оттаивать образец замороженных раствор pdECM на 4 градуса Цельсия в одночасье. Скорректированное pH решение pdECM может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одной недели. Переваренный раствор pdECM может храниться при 4 градусах Цельсия, по крайней мере, несколько дней, но не должен превышать 1 неделю.
- Дайджест лиофилизированного PDECM с пепсином.
- Для эффективного переваривания биоинков распыляется лиофилизированный PDECM жидким азотом с помощью раствора и пестика.
- Соберите 200 мг порошка PDECM в конической трубке 50 мл и добавьте 20 мг пепсина и 8,4 мл уксусной кислоты 0,5 М (окончательная концентрация составляет 2 м/в%).
- Поместите магнитную панель перемешивания в коническую трубку 50 мл и перемешайте при 300 об/мин при 96 л.с.
- Отрегулируйте рН переваренных растворов pdECM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы избежать гелирования до корректировки рН, этот процесс должен быть проведен на льду.- Отфильтруйте непереваренные частицы в растворе pdECM с помощью 40 мкм-сеттера с помощью положительного воссоединения пипетки на льду, чтобы получить оптимальное переваривание деталей.
- Добавьте 1 мл 10x PBS и вихрь перед использованием NaOH.
- Отрегулируйте рН до 7 с 10 M NaOH проверки рН с полосами индикатора pH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь каждый раз, когда NaOH добавляется так, что биочерник тщательно смешивается с другими реагентами.
4. Реологический анализ
- Экспериментальная установка
- Подготовьте 1,5% (w/v) биоинки pdECM для оценки реологических свойств.
- Установите геометрию конусной пластины 20 мм (диаметр конуса 20 мм с углом 2 градуса) в режиме реометра, контролируемом скоростью.
- Создание экспериментальных последовательностей в установленном программном обеспечении (TRIOS) для измерения вязкости, кинетики геля и динамического модуля биоинки pdECM.
- Вискозить: Поместите биоинк pdECM на тарелку. Измеряйте сложную вязкость (паз) биоинки pdECM при возрастающей скорости сдвига от 1 до 1000 с-1 при постоянной температуре 15 градусов по Цельсию.
- Кинетика гелирования: Поместите биоинк pdECM на тарелку. Рассчитайте сложный модуль (ГЗ) путем измерения модуля хранения и потери биоинки PDECM при 4-37 градусах Цельсия с постепенным увеличением в 5 градусов по Цельсию/мин (режим времени).
- Динамический модуль: Поместите биоинк PDECM на пластину при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут до измерения. Измерьте частотно-зависимый модуля хранения (G') и модуля потери (G'') биоинки pdECM в диапазоне 0,1-100 рад/с при 2% деформации.
5. 3D-клеточная печать тканей поджелудочной железы построенс с помощью простога
- Подготовка изолированных островков
- Изолировать первичные островки от крысы в соответствии с протоколами, описанными в предыдущей работе5.
- Чтобы отделить мусор и мертвые клетки от изолированного наиболее изолированного путека, пройдите суспензию клетки через 70 мкм-ситеч. Островки диаметром менее 70 мкм считаются мертвыми или ненормальными.
- Приостановить изолированные островки в RPMI-1640 среды и поместить их на чашку Петри. Удалите островки размером более 300 мкм в диаметре с помощью пипетки объемом P200 под микроскопом (объектив 4x объективной линзы) в шкафу биобезопасности.
- Инкапсуляция на ислете в биоинк pdECM
- Подготовка pH скорректированный биочерник PDECM и изолированный изодев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать гелирования до корректировки рН, этот процесс должен быть выполнен на льду. - Аккуратно перемешайте биоинк pdECM и средства массовой информации, приостановимые с островками (коэффициент 3:1), используя положительный пипетку смещения до равномерного смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация биоинки PDECM составляет 1,5%, а плотность клеток в биоинке PDECM составляет 3000 МТЗ/мл.
- Подготовка pH скорректированный биочерник PDECM и изолированный изодев.
- 3D-клеточная печать тканей поджелудочной железы построен
- Приготовьте стерилизованный шприц и сопло 22 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот датчик был выбран для печати островков диаметром 100-250 мкм. - Нагрузка на аграрный нагруженный pdECM биоинки в шприц.
- Печать биочернила с оптимизированным состоянием печати (скорость подачи: 150 мм/мин; пневматическое давление: 15 кПа) при 18 градусах По Цельсию в форме решетки.
- Чтобы перекрестно сиалить биоинк, поместите печатную конструкцию в инкубатор на 30 мин.
- Погрузите печатную конструкцию в средства массовой информации культуры на клетчатке, которая является медиа RPMI-1640, дополненной 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS), 100 u/mL пенициллином и 100 u/mL стрептомицин.
- Приготовьте стерилизованный шприц и сопло 22 G.
6. 3D-клеточная печать конструкции поджелудочной железы с узорчатой структурой
- Подготовка двух типов биочернила
- Для проверки универсальности печати с помощью нескольких биоинков, подготовить два набора pdECM биоинки и пятно их, добавив 0,4% Trypan Blue и Роуз Бенгалия раствор в каждом биочернила PDECM в соотношении 1:20, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать гелирования до корректировки рН, этот процесс должен быть проведен на льду. - Аккуратно перемешайте биоинк pdECM и средства массовой информации, приостановимые с островками (коэффициент 3:1), используя положительный пипетку смещения до равномерного смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация биоинки PDECM составляет 1,5%, а плотность клеток в биоинке PDECM составляет 3000 МТЗ/мл.
- Для проверки универсальности печати с помощью нескольких биоинков, подготовить два набора pdECM биоинки и пятно их, добавив 0,4% Trypan Blue и Роуз Бенгалия раствор в каждом биочернила PDECM в соотношении 1:20, соответственно.
- 3D-клеточная печать многоматериальных конструкций ткани поджелудочной железы
- Приготовить стерилизованные шприцы и сопло 25 G.
- Загрузите каждый биоинк (синий и красный) на два разных шприца, соответственно.
- Печать биоинки с оптимизированным состоянием печати (скорость подачи: 150 мм/мин; пневматическое давление: 15 кП) при 18 градусах Цельсия в форме решетки с чередующимися линиями синего и красного.
- Чтобы перекрестно сиалить биоинк, поместите печатную конструкцию в инкубатор на 30 мин.
- Погрузите печатную конструкцию в средства массовой информации культуры на клетчатке, которая является медиа RPMI-1640, дополненная 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), 100 u/mL пенициллина и 100 U/mL стрептомицин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Децеллюляризация тканей поджелудочной железы
Мы разработали процесс подготовки PDECM биочернила для обеспечения поджелудочной ткани конкретных микросред для повышения функциональности островков в 3D биопечатных тканей построить(Рисунок 2A). После процесса децеллюляризации, 97,3% dsDNA был удален и репрезентативные компоненты ECM, такие как коллаген и ГАЗ остались на 1278,1% и 96,9% по сравнению с родной ткани поджелудочной железы, соответственно(рисунок 2B).
Препарат биоинк
Для нанесения PDECM в процессе печати, порошок pdECM растворяется в слабой кислоте с пепсином и нейтрализован с помощью раствора 10 M NaOH. Переваренный раствор pdECM может быть разбавлен путем смешивания со средой клеточной культуры или 1x PBS. В этом исследовании мы подготовили биоинк PDECM при конечной концентрации 1,5% для дальнейшего изучения. Биоинк pdECM поддерживал фазу раствора, когда он был помещен при комнатной температуре и мгновенно преобразуется в фазу геля после инкубации при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Для исследования влияния биоинки PDECM на островки, изолированные островки были инкапсулированы в PDECM, альгинат и коллагенбионовые биоинки в концентрации 1,5%. Результат глюкозно-стимулируемого теста на секрецию инсулина показал, что островки в биоинке pdECM представляют собой самый высокий показатель (приблизительно 3.174) среди экспериментальных групп, что указывает на более высокую функциональность по сравнению с широко применяемыми гидрогелями для островковой инкапсуляции5.
Реологический анализ
Вискозность является одной из важнейших характеристик при рассмотрении печати биоматериала. Мы измерили вязкость биоинки pdECM на частоте от 1 до 1000 Гц при 15 градусах По кв. м для печати различных биоинков dECM6,7,8. Биочернила pdECM показала поведение сдвига-разжижая и значение было приблизительно 10 Pas на тарифе сдвига 1/s, показывая биоинкpd pdECM имело соотвествующие rheological характеристики для extrusion через сопло (Рисунок 3A). Кинетика геляции при температуре от 4 до 37 градусов Цельсия указывает на гелеационное поведение биоинки pdECM при физиологически значимых температурах. Сложный модуль начал увеличиваться, когда температура достигла 15 градусов по Цельсию, и он быстро увеличивался при сохранении температуры на уровне 37 градусов по Цельсию, что указывает на переход соль-геля биоинки pdECM(рисунок 3B). Динамические G' и G" биочернила pdECM были исследованы при физиологически значимых температурах, чтобы обеспечить его стабильность после процесса печати, что привело к стабильному модулю при состоянии частоты развертки(рисунок 3C).
3D-печать ячеек
3D-клеточные ткани поджелудочной железы конструкции были изготовлены с помощью микроэкструзии на основе процесса печати. Чтобы построить конструкцию, содержащую по крайней мере 3000 эквивалентов островка (ИЭЗ), что соответствует объему ткани совершенно сферический островок диаметром 150 мкм9, мы разработали конструкцию с размером 10 мм х 10 мм х 3 мм(рисунок 4А). Параметры процесса и условия для печати островков поджелудочной железы были выбраны для инкапсулирования островков, которые представляют собой большие клеточные кластеры размеров в диапазоне 100-250 мкм в диаметре(рисунок 4В). Используя многоголовную систему печати, различные типы 3D-конструкций, таких как форма решетки с альтернативными линиями синего и красного цвета, были изготовлены с помощью разработанного pdECM(Рисунок 4C),что указывает на универсальность PDECM для целей 3D-биопечати для гармонизации двух или более типов живых клеток в ткани, как расположение.
Рисунок 1: Схема развития децеллюлярной ткани поджелудочной железы, оценка биоинки PDECM и изготовление 3D конструкций поджелудочной ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения процесса децеллюляризации и биохимической характеристики pdECM. (A) Обзор децеллюляризации свиной ткани поджелудочной железы. (B) Результаты биохимических анализов родной ткани и PDECM. Ошибки бары показывают стандартное отклонение. Авторское право (2019) Королевское общество химии5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Реологический анализ биоинки PDECM. (A) Viscosity PDECM и коллагеновых биоинков, которые выставлены сдвига истончение поведения. (B) Геляционная кинетика PDECM и коллагеновых биоинков во время изменения температуры. (C) Сложный модуль перекрестных PDECM и коллагеновых биоинков. Авторское право (2019) Королевского общества химии5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: 3D-клеточная печать клеточной биоинки PDECM для построений 3D-тканей поджелудочной железы. (A) Размеры 3D ткани поджелудочной железы конструкций. (B) поджелудочная железа нагруженные и (C) многоматериальной основе 3D поджелудочной ткани конструкций. Авторское право (2019) Королевского общества химии5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описано развитие биоинков PDECM и изготовление 3D-конструкций ткани поджелудочной железы с помощью методов 3D-печати клеток. Для повторения микроокружения ткани-мишени в конструкции 3D-инженерии, выбор биочернила имеет решающее значение. В предыдущем исследовании, мы подтвердили, что ткани конкретных dECM биоинки полезны для содействия дифференциации стволовых клеток и пролиферации10. По сравнению с синтетическими полимерами, dECM может служить в качестве клеточной благоприятной среды из-за ткани-специфический состав и архитектура11. Поэтому процесс децеллюляризации следует серьезно рассмотреть для высокого удержания основных компонентов в dECM.
Выбор различных моющих средств для децеллюляризации ткани поджелудочной железы варьируется в остаточном eCM составной12. В процессе децеллюляризации, мы заметили, что использование сульфата натрия додецила (SDS) может повлиять на потерю белков ECM13. Таким образом, мы изменили наш предыдущий протокол, исключив шаг для лечения раствора SDS, который является ионным сурфактантом, используемым во многих процессах очистки и децеллюляризации с относительно тяжелыми характеристиками по сравнению с другими, такими как Trion-X 100, или 3-холамидопропил) диметил-ламмононио-1-пропансульфонат (CHAPS). В этом протоколе мы использовали 1% Triton-X 100 раствор для 84 ч вместо sDS-раствора, который смог эффективно удалить клеточные компоненты, сохраняя при этом ГАЗ и коллагеновые белки. Кроме того, мы отметили, что удаление остаточных липидов путем лечения с АПИ также является очень важным процессом для индуцирования перекрестных pdECM биочернила и это может быть понято в том же контексте, как ранее опубликованная статья4. Для стерилизации децеллюлярной ткани применялось также лечение раствором перацетической кислоты. Кроме того, удаление оставшихся моющих средств и химических веществ в децеллюляризованной ткани является важным шагом для предотвращения воспалительной реакции хозяина. Однако мы не обсуждали этот вопрос в этом протоколе. Протоколы, которые включают процесс дезинфекции в конце децеллюляризации улучшит биосовместимость децеллюлярного материала. Кроме того, следует рассмотреть стандарты критериев оценки для обеспечения полного удаления моющих средств и химических веществ.
Переваривание биоинки pdECM с пепсином было выполнено для достижения однородного смешивания порошка pdECM в кислой растворе путем расщепления области телопептида в коллагеновом белке. В процессе регулировки рН, сохраняя биочернила PDECM на льду имеет решающее значение для сохранения гелирования. После этого мы можем производить физически перекрестные биоинки pdECM предварительного геля, которые могут войти в состояние геля путем инкубации при 37 градусах Цельсия, что является одним из основных преимуществ биоинков на основе dECM. Выбор надлежащей концентрации биочернила PDECM также имеет важное значение10. Идеальный биочернил должен защищать клетки от внешних повреждений, которые происходят во время процесса печати, такие как пневматическое давление и изменение температуры. Известно, что примененная сила сдвига может привести к повреждению клеток и снижению жизнеспособности клеток в печатных конструкциях10. Кроме того, повышение концентрации биочернила может вызвать гибель клеток5. В отличие от этого, низкие концентрации биочернила вызывает низкую вязкость, что означает плохую печатность и точность формы во время печати. Необходимо проверить вязкость биочернила и оптимизировать его концентрацию.
В настоящее время исследователи активно изучают разработку различных типов тканевых биоинков для печати 3D-ткани конструкций14,15,16. Результаты этих исследований показывают, что биоинк может обеспечить ткани конкретных микросреддляов для клеток. Эти уникальные условия могут способствовать дифференциации или созреванию стволовых клеток и пролиферации клеток. Кроме того, использование многоголовой оборудованной системы 3D-печати позволяет печатать несколько типов биоинков с высокой точностью одновременно. Используя этот метод, структура с определенным узором может быть произведена, таким образом, показывая универсальность дизайна. Кроме того, возможно инкапсулировать различные типы клеток в каждый биочерник, чтобы имитировать расположение местных клеток17. Эти узорчатые структуры могут быть использованы в индукции васкуляризации или со-культуры эффект путем улучшения клеток к клетке взаимодействия, которые могут быть ключевыми факторами в долгосрочной выживаемости конкретных клеток18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано программой развития био и медицинских технологий Национального исследовательского фонда (NRF), финансируемой корейским правительством (MSIT) (2017M3A9C6032067) и "Творческая программа icT Consilience" (IITP-2019-2011-1-00783) контролируется IITP (Институт планирования и оценки информационных и коммуникационных технологий).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
