Dieser Artikel stellt ein Protokoll der Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation vor, um Mitochondrien von menschlichen Eierstockkrebsgeweben zu trennen und Eierstockgewebe für die quantitative Proteomik-Analyse zu kontrollieren, eine hochwertige mitochondriale Probe und eine quantitative Proteomikanalyse mit hohem Durchsatz und hoher Reproduzierbarkeit eines humanen Ovarialkarzinoms mitochondrialem Proteom.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen menschlicher Eierstockkrebserkrankungen, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, der Zellsignalisierung und des oxidativen Stresses. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Eine effektive mitochondriale Präparationsmethode in Verbindung mit einem isobarischen Tag für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) quantitative Proteomik werden hier vorgestellt, um menschlichen Eierstockkrebs zu analysieren und mitochondriale Proteome zu kontrollieren, einschließlich Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, starke Kationenaustauschfraktionierung (SCX), Flüssigkeitschromatographie (LC), Tandem-Massenspektrometrie (MS/ MS), Datenbankanalyse und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Viele Proteine wurden erfolgreich identifiziert, um die Abdeckung des humanen Ovarialkarzinoms zu maximieren und das differenziell exprimierte mitochondriale Proteinprofil bei menschlichen Eierstockkrebs zu erreichen.
Einleitung
Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus1,2. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von menschlichen Eierstockkrebs, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, Zellsignalisierung, und oxidativen Stress3,4,5,6,7. Tiefe E....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Für dieses Protokoll wurden Eierstockgewebe einschließlich Eierstockkrebsgewebe (n = 7) und normales Kontroll-Ovarialgewebe (n = 11) verwendet. Das vorliegende Protokoll3,4,5 ist von der Xiangya Hospital Medical Ethics Committee of Central South University, China, genehmigt.
1. Präparation von Mitochondrien aus menschlichem Eierstockkrebsgewebe
- Vorbereiten 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers durch Mischen von 210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM Diaminetetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Es gab einen Unterschied in der Herstellung der Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und der Kontrolle von Eierstockgeweben. Diese Studie ergab, dass es viel einfacher war, Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben vorzubereiten als aus der Kontrolle von Eierstockgeweben3,4. Das Protokoll zur Herstellung von Mitochondrien aus kontrollischen Eierstockgeweben musste verbessert werden. Zunächst war es vor der Gewebehomogenisierung n.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von Eierstockkrebs. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus menschlichem Eierstockkrebs und Kontrollgewebe nützen dem tiefen Verständnis der mitochondrialen Funktion bei Eierstockkrebspathogenese und mitochondrialen molekularen Netzwerkveränderungen und helfen dabei, den molekularen Mechanismus für die spätere Entdeckung der Zieltherapie und wirksamer Biomarker auf Basis von Mitochondrien4,5,<.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Hunan Provincial Hundred Talent Plan (zu X.Z.), die Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 und 81272798 to XZ), die Stipendien aus China "863" Plan Projekt (Grant-Nr. 2014AA020610-1 bis XZ) und die Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. konzipierte das Konzept für das vorliegende Manuskript, erhielt die iTRAQ quantitativen Proteomik-Daten von Mitochondrienproben, schrieb und überarbeitete das Manuskript, koordinierte die entsprechende Arbeit und war für die finanzielle Unterstützung und die entspr....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BCA-Protein-Assay-Kit | Vazyme | E112 | Das BCA-Protein-Assay-Kit ist eine spezielle 3-Komponenten-Version unserer beliebten BCA-Reagenzien, die für die Messung (A562 nm) der Gesamtproteinkonzentration von verdünnten Proteinlösungen (0,5 bis 20 Mikrogramm/ml) optimiert ist. |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Hitzeschockfraktion, australischen Ursprungs, proteasefrei, fettsäurearm, niedriger IgG-Wert, pH 7, ≥ 98% |
| Zentrifuge | XiangYi | TDZ4 - WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagenz, geeignet für Elektrophorese, ≥ 98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Wasserfrei, rieselfähig, Redi-Dri, ≥ 98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (jetzt Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylenglykol bis(2-aminoethylether)tetraessigsäure (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥ 97 .0 |
| Homogenisator | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ Reagenzienkit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagenzien– Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Niedertemperatur-Supergeschwindigkeitszentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol ist ein Polyol (mehrwertiger Alkohol), das durch Hydrierung aus Fruktose hergestellt wird und als Süßstoff, Feuchthaltemittel und Füllstoff fungiert. Es hat eine geringe Hygroskopizität und eine schlechte Öllöslichkeit. |
| MASCOT Suchmaschine | Matrix Science, London, UK; Version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-Hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥ 97,0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Proteaseinhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF ist ein Proteaseinhibitor, der mit Serinresten reagiert, um Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin und Papain zu hemmen. |
| Kaliumchlorid | Macklin | P816354-25G | Kaliumchlorid, KCI, auch bekannt als Kaliummuriat und Sylvit, ist ein farbloser kristalliner Feststoff mit einem salzigen Geschmack, der bei 776 °C schmilzt; C (1420 VON). Es ist wasserlöslich, aber unlöslich in Alkohol. Kaliumchlorid wird in Düngemitteln, Pharmazeutika, in der Fotografie und als Salzersatz verwendet. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF-Membran | Millipore | 05317 | Es ist 1 Rolle, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 &; Mikro; m Porengröße, hydrophobe PVDF-Transfermembran mit geringer Hintergrundfluoreszenz für Western Blotting. Es ist kompatibel mit sichtbaren und infraroten Fluoreszenzsonden. |
| Q Exaktives Massenspektrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX Säule | Sigma | 58997 | Es ist 5-μ M Partikelgröße, Länge 5cm & Zeiten; Innendurchmesser 4,6 mm (Supelco). |
| Natriumorthovanadat (V) | Macklin | S817660-25G | Natriumorthovanadat (Vanadat) ist ein allgemeiner kompetitiver Inhibitor für Proteinphosphotyrosylphosphatasen. Die Hemmung durch Natriumorthovanadat ist unter Zugabe von EDTA oder durch Verdünnung reversibel. |
| Saccharose | Macklin | S824459-500G | Vetec Reagenzqualität, 99 % |
| Thioharnstoff | Sigma | 62-56-6 | ACS-Reagenz, &ge 99,0% |
| Tris-Base | Sigma | 10708976001 | TRIS-Base ist im pH-Bereich von 7,0-9,0 nützlich. Er hat einen pKa von 8,1 bei 25°C. |
| Trypsin (Verwendung in Zellkulturen) | Gibco | 25200-056 | Diese flüssige Formulierung von Trypsin enthält EDTA und Phenolrot. Gibco Trypsin-EDTA wird aus Trypsinpulver hergestellt, einer bestrahlten Mischung von Proteasen, die aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins gewonnen werden. Aufgrund seiner verdauungsfördernden Kraft wird Trypsin häufig für die Zelldissoziation, die routinemäßige Zellkulturpassage und die Dissoziation des primären Gewebes verwendet. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | Pulver, BioReagenz, für die Molekularbiologie, geeignet für Zellkultur |
Referenzen
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).
- Gadducci, A., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
