Bu çalışma, primer okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların homojen hücre kültürlerini ortaya çıkarmak için bir protokol sunmaktadır. Bu kültürler, oküler ve spinal motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerinin karşılaştırmalı analizleri için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler
Bu makalede
Özet
Özet
Okülomotor nöronlar (CN3s) ve troklear nöronlar (CN4s) spinal motor nöronlar (SMNs) ile karşılaştırıldığında amiyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi dejeneratif motor nöron hastalıklarına karşı dikkate değer direnç gösterirler. Birincil fare CN3'leri, CN4'leri ve Kobİ'leri yalıtma ve kültür eve verme yeteneği, bu seçici güvenlik açığının altında yatan mekanizmaları incelemek için bir yaklaşım sağlayacaktır. Bugüne kadar, çoğu protokol deneysel sonuçların yorumlanması şaşırtmak heterojen hücre kültürleri kullanın. Karma hücre popülasyonları ile ilgili sorunları en aza indirmek için saf kültürler vazgeçilmezdir. Burada ilk protokol, embriyonik gün 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenik fare embriyolarını kullanarak aynı embriyolardan SMN'lerin karşıtlarıyla birlikte CN3s/CN4'leri verimli bir şekilde nasıl arındırıp yetiştireceklerini ayrıntılı olarak açıklar. Protokol, doku diseksiyonu ve ayrışması, FACS tabanlı hücre izolasyonu ve CN3/CN4 ve SMN çekirdeklerinden gelen hücrelerin in vitro ekimi hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Bu protokol, mevcut protokollere yeni bir in vitro CN3/CN4 kültür sistemi ekler ve aynı zamanda karşılaştırma için saf bir tür ve yaşla eşleşen SMN kültürü sağlar. Motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerine odaklanan analizler bu kültür sisteminde uygulanabilir. Bu protokol motor nöron gelişimi, selektif güvenlik açığı ve hastalığı tanımlayan mekanizmaların araştırılmasını sağlayacaktır.
Giriş
Birincil motor nöronların kültürü nöronal gelişim, fonksiyon ve eksojen strese yatkınlık çalışmasını sağlayan güçlü bir araçtır. Motor nöron kültürleri amiyotrofik lateral skleroz gibi nörodejeneratif hastalıkların çalışması için özellikle yararlıdır (ALS)1,2, olan hastalık mekanizmaları tamamen anlaşılamamıştır. İlginçtir, spinal motor nöronların önemli hücre ölümü rağmen (SMNs) hem ALS hastaları ve ALS model fareler, okülomotor nöronlarda hücre ölümü (CN3s) ve troklear nöronlar (CN4s) nispeten kıt1,3,4,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Laboratuvar hayvanlarının kullanıldığı tüm deneyler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine uygun olarak ve Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Diseksiyon dan Önce Zamanlanmış Miyesliklerin Ayarlanması
- Motor nöron hasadı için prenatal embriyonik fareler üretmek için, her dişi fareyi tartın ve yetişkin IslMN:GFP transgenik fareler arasında nöron izolasyonu gününden 11,5 gün önce zamanlanmış kense oluşturma ayarlayın. Bu protokolün geliştirilmesi amacıyla, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP fareler, 2−9 aylık, kull....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün amacı, motor nöron bozukluklarının altında yatan mekanizmaların karşılaştırmalı analizini sağlamak için hem birincil CN3/CN4'leri hem de Kobİ'leri yüksek oranda arındırmak ve kültürü geliştirmektir (genel bakış için Şekil 1 ve Şekil 2'ye bakınız).
Nöronlar başarıyla izole edildikten ve kültürde büyüdükten sonra, neredeyse saf primer CN3/CN4 ve SMN kültürle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tarihsel olarak, CN3 ve/veya CN4 motor nöronlarının in vitro çalışmaları, ayrıştırılmış17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26gibi heterojen kültürlere güvenmiş v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Teşekkürler
Biz SMN diseksiyon teknikleri öğretim için Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, ABD) teşekkür ederiz; Dana Farber Kanser Enstitüsü Akış Sitometri Tesisi, Harvard Tıp Fakültesi İmmünoloji Bölümü Akış Sitometri Tesisi, Joslin Diyabet Merkezi Akış Sitometri Çekirdek, Brigham ve Kadın Hastanesi Akış Sitometri Çekirdek, ve Boston Çocuk Hastanesi Akış Sitometri Araştırma Tesisi facs ilköğretim motor nöronların izolasyonu için; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, ek Engle laboratuvar üyeleri ve teknik yardım ve düşünceli tartışma için Als Projesi konsorsiyumu üyeleri. Bu çalışma ALS Projesi tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, R.F. Japan H....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-konjuge F (ab ') 2 keçi anti-tavşan IgG (H + L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Takviyesi (50x), serum içermeyen | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Akış Sitometresi | BD Bioscience | - | Bu, 405, 488, 594 ve 640 nm lazerlerle donatılmış 4 lazer sistemine sahiptir. |
| BD Şahin 70 ve mu; m Naylon Hücre Süzgeçleri | CORNING | 352350 | FACS'tan önce ayrışan hücreleri filtrelemek için. |
| BD Falcon Geçmeli Kapaklı Yuvarlak Alt Test Tüpleri | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Hücre Kültürü mikroplakası, 96 kuyulu, PS, F-dip (Baca Kuyusu) | Greiner Bio-One International | 655090 | Birden fazla 96 oyuklu yemek denedik ve bu, ICC sonrası kültür ve analizler için en iyisiydi |
| Mikroskopi için Dairesel Kapaklı Camlar | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | Alan geniş olduğu için (çap: 14 mm) bu lamel kullandık. |
| CNTF İnsan | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | . ER stres faktörlerinden biri. |
| 4 & prime;, 6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont # 5 Forseps Inox Uç Boyutu 0,05 mm x 0,01 mm Biologie İpuçları | Roboz Cerrahi Alet | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF İnsan | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX takviyesi | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E düşük floresan | BrainBits | HELF | Embriyonun GFP ekspresyonlarının gözlemlenmesini engelleyen floresan düşük olmalıdır. |
| At serumu, ısı inaktive edilmiş, Yeni Zelanda menşeli | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | İzobutilksantin |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz' s L15 orta Thermo | Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mikro Diseksiyon Makası | Roboz Cerrahi Alet | RS-5913 | |
| Mikro Bıçak 4.75" 1.7 mm x 27 mm bıçak | Roboz Cerrahi Alet | RS-6272 | |
| Moria Mini Delikli | Kaşık Güzel Bilim Araçları | 10370-19 | |
| Nöronal sınıf III ve beta;-tubuline karşı fare monoklonal antikoru (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti canlı hücre floresan mikroskobu ve Elements yazılımı | girişim kontrast görüntüleri ve hücre kültürlerinin immünositokimya görüntüleri bu ekipmanlarla yakalandı | ||
| Nitrik Asit %90, Dumanlama (Sertifikalı ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | Lamelleri durulamak için |
| Olympus 1.7 mL Mikrotüpler, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | Bunlar, bağlamda "1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri" olarak tanımladığımız tüplerdir. |
| Papain Dissosiyasyon Sistemi | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solüsyonu ve alubumin-ovomukoid inhibitör solüsyonu bu kitten hazırlanır. |
| Penisilin-streptomisin (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poli D-lizin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Adacık1'e karşı tavşan monoklonal antikoru | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 ve DS-Ri1 ile SMZ1500 zoom stereomikroskoplar Kamerayla | Nikon-Diseksiyon | yapıldı ve bu floresan mikroskoplar altında diseke edilen embriyo ve dokuların görüntüleri alındı. | |
| Sylgard 170 Siyah Silikon Kapsülleyici - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | Bu kiti kullanarak diseksiyon yemekleri yapıyoruz. |
| TC ile işlenmiş Tabaklar, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | Bu tabağı kullanarak diseksiyon tabakları yapıyoruz. |
| Tampon Pansuman Forseps 4.5" Tırtıklı 2.2 mm Uç Genişliği | Roboz Cerrahi Alet | RS-8100 | |
| LOGOQ e VET için Dönüştürücü | GE Healthcare | L8-18i-RS | Dişi farelerde ultrason için |
| Veteriner ultrason makinesi | GE Healthcare | LOGOQ e VET | Dişi farelerde ultrason için |
| Zeiss LSM 700 serisi lazer taramalı konfokal mikroskop ve Zen Yazılımı | Carl Zeiss | - | Bu ekipmanlar ile embriyonun konfokal görüntüsü alındı |
Kaynaklar
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
