Summary
Bu çalışma, primer okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların homojen hücre kültürlerini ortaya çıkarmak için bir protokol sunmaktadır. Bu kültürler, oküler ve spinal motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerinin karşılaştırmalı analizleri için kullanılabilir.
Abstract
Okülomotor nöronlar (CN3s) ve troklear nöronlar (CN4s) spinal motor nöronlar (SMNs) ile karşılaştırıldığında amiyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi dejeneratif motor nöron hastalıklarına karşı dikkate değer direnç gösterirler. Birincil fare CN3'leri, CN4'leri ve Kobİ'leri yalıtma ve kültür eve verme yeteneği, bu seçici güvenlik açığının altında yatan mekanizmaları incelemek için bir yaklaşım sağlayacaktır. Bugüne kadar, çoğu protokol deneysel sonuçların yorumlanması şaşırtmak heterojen hücre kültürleri kullanın. Karma hücre popülasyonları ile ilgili sorunları en aza indirmek için saf kültürler vazgeçilmezdir. Burada ilk protokol, embriyonik gün 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenik fare embriyolarını kullanarak aynı embriyolardan SMN'lerin karşıtlarıyla birlikte CN3s/CN4'leri verimli bir şekilde nasıl arındırıp yetiştireceklerini ayrıntılı olarak açıklar. Protokol, doku diseksiyonu ve ayrışması, FACS tabanlı hücre izolasyonu ve CN3/CN4 ve SMN çekirdeklerinden gelen hücrelerin in vitro ekimi hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Bu protokol, mevcut protokollere yeni bir in vitro CN3/CN4 kültür sistemi ekler ve aynı zamanda karşılaştırma için saf bir tür ve yaşla eşleşen SMN kültürü sağlar. Motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerine odaklanan analizler bu kültür sisteminde uygulanabilir. Bu protokol motor nöron gelişimi, selektif güvenlik açığı ve hastalığı tanımlayan mekanizmaların araştırılmasını sağlayacaktır.
Introduction
Birincil motor nöronların kültürü nöronal gelişim, fonksiyon ve eksojen strese yatkınlık çalışmasını sağlayan güçlü bir araçtır. Motor nöron kültürleri amiyotrofik lateral skleroz gibi nörodejeneratif hastalıkların çalışması için özellikle yararlıdır (ALS)1,2, olan hastalık mekanizmaları tamamen anlaşılamamıştır. İlginçtir, spinal motor nöronların önemli hücre ölümü rağmen (SMNs) hem ALS hastaları ve ALS model fareler, okülomotor nöronlarda hücre ölümü (CN3s) ve troklear nöronlar (CN4s) nispeten kıt1,3,4,5,6,7,8,9. Bu nedenle, CN3s/CN4'lerin ve Kobİ'lerin saf kültürlerinin karşılaştırmalı analizleri, göreceli kırılganlık altında yatan mekanizmalar hakkında önemli ipuçları sağlayabilir. Ne yazık ki, bu tür analizler için önemli bir engel bu motor nöronların saflaştırılmış kültürlerbüyümek için yetersizlik olmuştur.
Kobİ'lerin hayvan modellerinden arındırılması için birçok protokol tanımlanmıştır. Bu protokollerin çoğu yoğunluk gradyan santrifüj10,11,12 ve/ veya p75NTR-antikor tabanlı hücre sıralama kaydırma teknikleri13,14,15,16kullanın. Yoğunluk gradyan santrifüj ükemi diğer omurilik hücrelerine göre Daha büyük smn'lerden yararlanırken, p75NTR omurilikteki Kobİ'ler tarafından özel olarak ifade edilen ekstrasellüler bir proteindir. Yaklaşık% 100 saf SMN kültürleri biri veya her ikisi bu protokoller11,12,14tarafından oluşturulmuştur. Ancak, CN3s/CN4s p75NTRifade etmez, çünkü bu protokoller CN3/CN4 kültürleri üreten başarılı olmamıştır , ve diğer özel CN3/CN4 işaretleri tespit edilmemiştir. Ayrıca Kobİ'lerden daha küçüktürler ve bu nedenle boyuta göre izole etmek daha zordur. Bunun yerine, CN3s veya CN4s in vitro çalışmalar ayrışmış17dayanıyordu,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, ve dilim 27,28kültürler, heterojen hücre tipleri oluşan ve hiçbir protokoller için var olan birincil CN3'lerin veya CN4'lerin izolasyonu ve kültürü.
Burada, aynı embriyonik gün 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenik fareler29 (Şekil 1, Şekil 2A)cn3'lerin, CN4'lerin ve Kobİ'lerin görselleştirilmesi, izolasyonu, arınması ve yetiştirilmesi için bir protokol açıklanmıştır. IslMN:GFP özellikle motor nöronları hücre zarına lokalize olan farnesile edilmiş gfp ile etiketler. Bu protokol, motor nöron hastalığında patolojik mekanizmaları açıklamak için birden fazla motor nöron türünün ve yaşla uyumlu karşılaştırmasının yapılmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Laboratuvar hayvanlarının kullanıldığı tüm deneyler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine uygun olarak ve Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Diseksiyon dan Önce Zamanlanmış Miyesliklerin Ayarlanması
- Motor nöron hasadı için prenatal embriyonik fareler üretmek için, her dişi fareyi tartın ve yetişkin IslMN:GFP transgenik fareler arasında nöron izolasyonu gününden 11,5 gün önce zamanlanmış kense oluşturma ayarlayın. Bu protokolün geliştirilmesi amacıyla, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP fareler, 2−9 aylık, kullanılmış ve akşam saatlerinde zamanlanmış miyon kurulmuştur.
- Ertesi sabah vajinal fişler için kadın fareler inceleyin. Fişin embriyonik gün (E) 0,5 olarak tanımlandığı tarihi göz önünde bulundurun.
- Dişi fareleri tartın ve E8.5−11 arasında ultrason kullanarak yavruları inceleyin (Bkz. Malzeme Tablosu). Başarılı miating belirtileri kontrol edin.
- Dişi farelerde kilo alımını tespit ederek başarılı bir miyetingi onaylayın (5−6'dan fazla embriyo varsa Genellikle E9.5'te >1.5 g).
- Ultrason altında embriyoları görsel olarak doğrulayın. Embriyolar E9.5'ten sonra ultrason ile kolayca tespit edilebilir. Ultrasonlar sadece kilo almış kadınlarda yapılır çünkü daha sık hamile olanlar olmayanlara göre.
NOT: Kadın fareler gebelik dışında nedenlerle kilo alabilirsiniz, bu nedenle kilo tek başına gebelik güvenilir bir göstergesi değildir. Ultrason onayı hamile olmayan ancak mevcut değilse çok önemli değildir kadınların gereksiz kurban önler.
2. Diseksiyon Koşulları ve Aletlerin Hazırlanması
- Tüm kaplama (kapakların asit temizliği hariç), ortam hazırlama, doku dissosiasyonu (santrifüj ve kuluçka hariç) ve ortam ve embriyonik motor nöronların sterilitesini sağlamak için laminar akış kaputunda kültür çalışmaları yapın.
- Steril tekniğe dikkat edin, en az kontaminasyon riski ile laminar akış başlığı dışında doku diseksiyonu gerçekleştirin.
- Bir diseksiyon plakasını, bir çift mikrodiseksiyon makasını, bir çift başparmak giydirme forsepsini, iki çift Dumont #5 cımbızını, bir mikrodissecting bıçağını ve bir Moria mini delikli kaşığı kullanmadan önce %70 etanol batırarak sterilize edin.
3. PDL/Laminin Bulaşıkkaplama/Kapak
NOT: Kültür uygulama için gerekli hücre sayısına bağlı olarak, 96 iyi veya 24 kuyu plakaları birincil motor nöronlar ayrıştırılmış. Kuyular optik olarak saydam ve kalınlıkları görüntüleme ile uyumlu ise hücreler kapak lar kullanılmadan doğrudan doku kültür plakası içinde görüntülenebilir.
- Kapak gerektiren uygulamalar için, asitle temizlenmiş, sterilize edilmiş ve havayla kurutulmuş kapaklar daha önce30olarak açıklandığı gibi nöron izolasyonundan en az 2 gün önce hazırlayın. Coverlips toplu deneyler öncesinde de bu şekilde hazırlanabilir ve deneysel kalite üzerinde etkisi olmadan 6 aya kadar saklanabilir.
- Nöron izolasyonundan 2 gün önce fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 20 g/mL poli D-lizin (PDL) çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Aliquot PDL (1 mg/mL) önceden ve stok çözeltisi olarak -20 °C'de saklayabilirsiniz.
- Her kapak kaymasının veya doku kültür plakasının yüzeyini yeterli PDL solüsyonu ile kaplayın (örn. 96 kuyu plakası üzerinde kuyu başına 100 μL veya kapaklı veya kapaksız 24 kuyu plakası üzerinde kuyu başına 500 μL). Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün steril su ile 3x yıkayın.
- Plakaları parafin filmli olarak kapatın ve yıkanmış PDL kaplı plakaları son yıkamadan sonra tamamen kurutulursa 1 aya kadar 4 °C'de saklayın.
- PBS'nin 1,2 mL'sinde 10 μL laminin (1.1−1.2 mg/mL) içeren bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Aliquot laminin stokları (1.1−1.2 mg/mL) önceden ve -80 °C'de saklayabilirsiniz.
- Her kapak kaymasıyüzeyini veya yüzeyi eşit olarak kaplamak için yeterli laminin çözeltisi ile iyice kapatın. Kullanmadan önce 37 °C'de en az 2 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: PDL/laminin kaplı tabak lar ve kapaklar 37 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir, ancak taze kaplanmış laminin tercih edilir. Kaplama 30önce doğrudan laminin çıkarın. Laminin inmesine izin verilmemelidir. Plakalar birkaç saatten fazla saklanacaksa, parafin filmine sarılmalıdır.
4. Diseksiyon, Motor Nöron Kültürü Ortamı ve Dissosilasyon Çözümlerinin Hazırlanması
NOT: Parantez deki konsantrasyonlar her reaktifin son konsantrasyonlarını gösterir.
- Diseksiyon ortamını hazırlayın.
- Isı yalıtımlı at serumunu bir gecede 4 °C'de eritin, 1 mL aliquot hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Kullanmadan önce RT'de aliquots'u doğrudan eritin.
- -20 °C'de 1 mL aliquots B27-supplement (50x) saklayın. Kullanmadan hemen önce RT'de aliquots'u eritin. Donma/eritme döngülerinden kaçının.
- Glutamin takviyesi (100x) 4 °C veya -20 °C'de saklayın. -20 °C'de depolanırsa 0,5 mL'lik dereceye bölün.
- Penisilin-streptomisini (10.000 U/mL) -20 °C'de 1 mL aliquots'ta saklayın. Kullanmadan hemen önce RT'de aliquots'u eritin.
- Diseksiyonu ortama getirmek için, 9.4 mL Hibernate E at serumu (%2), 200 μL 50x B27 takviyesi (1x), 100 μL 100x glutamin takviyesi (1x) (örneğin, GlutaMAX) ve 100 μL 10.000 U/mL penisilin-streptomisin (100/UL) ile karıştırın. Parçalanmış dokuları toplamak ve parçalanmış hücrelerin son süspansiyon yapmak için bu ortamı kullanın.
- Nöron izolasyonundan bir gün önce doku toplama için diseksiyon ortamının 500 μL'sini tek tek 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Toplanacak her doku tipi için bir tüp hazırlayın (örn. pozitif kontrol, negatif kontrol, CN3/CN4, SMN) ve kullanımdan önce 4 °C'de saklayın.
- 49 mL'lik Hazırda Bekletme E düşük floresan ortamı nı 1 mL B27 takviyesi (1x) ile birleştirin ve nöron izolasyonundan bir gün önce 24 kuyuplakasını bu ortamla (2 mL/kuyu) doldurun. Fare embriyoları toplamak için bu çanak kullanın. Kullanmadan önce 4 °C'de saklayabilirsiniz.
- Motor nöron kültür ortamını hazırlayın.
- Leibovitz'in L15 ortamında 25 mM 2-mercaptoetanol 250 μL aliquots hazırlayın. -20 °C'de saklayın.
- Steril suda seyreltilmiş BDNF, CNTF ve GDNF'nin 100 g/mL çözeltisi 5 μL aliquots üretin. -80 °C'de saklayın ve kullanmadan hemen önce RT'de aliquots'u eritin.
- Forskolin ve girdap 5 mg 'a (1,0670 μM) 64 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek 10 mM forskolin çözeltisini hazırlayın. Daha sonra DMSO çözeltisine sterilize edilmiş su (1.003 mL) ekleyin ve girdap kuyusu ekleyin. 12 μL forskolin'i -20 °C'de saklayın ve kullanımdan hemen önce RT'de eritin.
- DMSO'da seyreltilmiş 100 mM izobüylmethylxanthine (IBMX) 12 μL aliquots hazırlayın. -20 °C'de saklayın ve kullanmadan hemen önce RT'de aliquots'u eritin.
- Motor nöron kültürünü orta yapmak için 9.4 mL nörobazal ortamı 200 μL at serumu (%2) ile karıştırın, 200 μL 50x B27 takviyesi (1x), 100 μL 100x glutamin takviyesi (1x), 100 μL 10.000 U/m: penisilin-streptomisin (100 U/mL) ve 20 μL 25 mM 2-mercaptoethanol (50 μM), tercihen doğrudan kullanımdan önce. Bu adım nöron izolasyonundan 1 gün öncesine kadar yapılabilir.
- Kullanımdan hemen önce, motornöro kültürüne 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) ve GDNF (10 ng/mL) ve 10 μL 10 mM forskolin (10 μM) forskolin (10 μM) ve 10 00 00mL ekleyin. Orta yı 37 °C'ye kadar ısıtın.
- Dissociation çözümlerini hazırlayın.
- Üreticinin talimatlarına göre papain solüsyonu (20 U/mL papain ve %0.005 DNase) ve albumin-ovomucoid inhibitör solüsyonu (1 mg/mL ovomucoid inhibitör, 1mg/mL albumin ve %0.005 DNase) hazırlayın.
- Ovomucoid inhibitörü ve papain çözeltilerinin her birinin 500 μL aliquot'larını hazırlayın ve -80 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce 37 °C'de eritin.
5. Ventral orta beyin ve Omurilik Diseksiyonu
NOT: 5.1.1−5.1.3 ve 5.1.5−5.1.6 adımları dışında aşağıdaki adımların tümünü floresan diseksiyonu stereomikroskop altında gerçekleştirin. Deney başına toplam diseksiyon süresi, diseksiyon tekniğindeki yeterliliğe ve her deney için gerekli motor nöron sayısına bağlı olarak tipik olarak 3−5 saattir.
- Ventral orta beyin diseksiyonu
- Karbondioksit gazı ve servikal çıkış ile yaklaşık 11,5 gün postfertilizasyon gebe bir fare ötenazi.
- Sprey iyice etanol ile karın ve steril mikrodissecting makas ve başparmak pansuman forceps kullanarak rahim kaldırmak. Steril PBS kısa bir süre rahim yıkayın, sonra önceden soğutulmuş steril PBS ile dolu diseksiyonu plaka aktarın.
- Mikroskopun parlak ışığı altında steril mikrodissecting makas, başparmak giydirme kasları ve Dumont #5 cımbızkullanarak rahimden islMN:GFP-pozitif embriyoları dikkatlice çıkarın. Steril Bir Moria mini delikli kaşık kullanarak, 1x B27 ile desteklenen önceden soğutulmuş Hibernate-E düşük floresan orta ile dolu 24 kuyu plaka ayrı bir kuyuya her embriyo transfer. 24 plakayı buzda tut.
- Bir embriyonun steril bir diseksiyon plakasına aktarın ve tamamen buz gibi steril Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile kaplayın.
- Diseksiyonu adımlarının mikroskopun floresan iyotiyoyanat (FITC) aydınlatması altında yapıldığından emin olun. Cımbız kullanarak, orta beyne zarar vermeden embriyonun kuyruğunu ve yüzünü çıkarın(Şekil 2Ba). Embriyoyu alta ve kuyruğun mikroskobun önüne doğru, dissector'a doğru gösteren uzuvları olan eğilimli yerleştirin (yıldız işaretiyle gösterilir, Şekil 2Bb).
- Cımbız kullanarak, küçük bir açıklık oluşturmak için dördüncü ventrikül çatı açık yarık. Dördüncü ventrikül ve çatı arasında oluşturulan alana cımbız kanca için bu açıklığı kullanın. Embriyo rostralinin dorsal yüzeyi boyunca kortekse ve lateral zemin plakasına ve motor kolona diseksiyon(Şekil 2Ca,b). GFP-pozitif CN3 ve CN4 çekirdeklerini ortaya çıkarmak için parçalanmış dokuyu açık kitap lı bir şekilde açın.
NOT: Mesenchyme, CN3 ve CN4 içeren ventral orta beyin doku küçük bir parça şimdi maruz kalacak. - Ventral orta beyni embriyodan dikkatlice ayırın ve cımbız ve mikrodissecting bıçağı kullanarak meningeal dokuyu çıkarın. İki taraflı GFP-pozitif CN3 ve CN4 çekirdeklerini zemin plakasından ve diğer GFP-negatif çevre dokularından cımbız ve mikro diseksiyon bıçağı kullanarak inceleyin (Şekil 2D). Eksire dokudaki GFP pozitif motor nöronların sayısını en üst düzeye çıkarın, ancak dokunmaktan veya zarar vermekten kaçının.
- Ayrı CN3 ve CN4 çekirdeklerinden oluşan bir koleksiyon isteniyorsa, bu iki çekirdeğin orta çizgisi boyunca kesilir (Şekil 2D'dekisarı noktalı çizgi). P1000 pipet kullanarak, en az HBSS ile diseksiyon ventral orta beyin dokusu toplamak ve diseksiyon ortamı ile dolu etiketli 1.7 mL mikrosantrifüj tüp yerleştirin (adım 4.1.5 bakınız). Dağılına kadar buzüzerinde saklayın.
- Toplam sayı deneysel gereksinimi karşılayana kadar aynı tüpteki ek embriyolardan ventral orta beyinleri bir araya getirin (ideal hücre numaraları için adım 8'e bakın).
NOT: Dokuların dissosyon ve sıralama sırasında strese maruz kaldığı için yaklaşık 1 x 104 CN3/CN4 motor nöronlar veren en az 10 ventral orta beyinden oluşan bir havuzlu koleksiyon önerilir.
- Ventral spinal kord diseksiyonu
- Embriyoyu mikroskobun ön yüzüne bakacak şekilde yatkın tutun. Bir çift cımbızla embriyoyu tutun ve diğer cımbız çiftinin ucunu dördüncü ventrikülün açılmamış kaudal kısmına takın.
- Embriyonun tüm rostrokaudal ölçüde arka beyin ve omurilik dorsally geri kalanını açın. Dorsal dokuyu keserek, dördüncü ventrikülden başlayarak ve makas olarak forsepsleri kullanarak kaudal omuriliğin merkezi kanalına doğru çalışarak açın(Şekil 2Ca,b). Bu işlem sırasında ventral omurilik dokunmaktan veya zarar vermemeye özen.
- Embriyoyu bir çift cımbızla tutun ve diğer cımbız çifti ile her iki taraftaki sırt dokusunun kapağını çimdikle kapatın(Şekil 2Ea,b).
NOT: Excised dorsal dokular dorsal deri içerir, mezenkimme, dorsal kök gangliyonu (DRGs), dorsal arka beyin, ve omurilik. Yapışkan oldukları ndan ve filtreleme sırasında Kobİ'leri kapana bildiği veya FACS sıralama sırasında tıkanmalarına neden olabileceklerinden, Bu dokuların mümkün olduğunca çoğunu SMN çekirdeklerine zarar vermeden çıkarın. - GFP pozitif SMN'nin hemen altına delmek için mikrodiseksiyon bıçağını kullanarak ventral omuriliği çıkarın. Ventral omuriliği her iki tarafta testere benzeri hareketlerle kaldırın(Şekil 2Fa,b). Yüzen ventral omuriliği c1'in hemen üzerinde enine kes, ilk GFP-pozitif ön boynuz projeleri(Şekil 2G). Ayrıca, alt ekstremitenin üst sınırında enine kesilmiş (Şekil 2G). Bu işlemden sonra ventral omuriliğin servikal (C1)-lomber (L2-L3) kısmını çıkarın.
- Ventral omurilik dorsal tarafını yukarı yerleştirin ve GFP-pozitif SMN sütunları arasına bir çift cımbızla GFP-negatif dokuyu basarak tutun. GFP pozitif SMN sütununun her iki tarafını mikrodiseskes bıçağıyla keserek kalan ekli mezenkim, DRG'leri ve dorsal omuriliği çıkarın (Şekil 2H). Onlara zarar vermeden GFP pozitif motor nöronlar maksimize etmek için özen.
- P1000 pipet kullanarak, en az HBSS ile diseksiyon ventral omurilik dokusu toplamak ve Diseksiyon ortamı ile dolu SMN etiketli 1.7 mL mikrosantrifüj tüp yer. Dağılına kadar buzüzerinde saklayın. Toplam sayı deneysel gereksinimleri karşılayana kadar aynı tüpteki ek embriyolardan ventral omurilikleri biraraya getirmeye devam edin.
NOT: Dokular dissosyasyon ve sıralama sırasında strese maruz kaldığı için yaklaşık 2.1 x 104 SMN verim en az üç ventral omurilik toplanması tavsiye edilir. - Sırasıyla, IslMN:GFP fare embriyolarının yüz motor nöronlarını ve ekstremitelerini festans-aktive hücre sıralaması (FACS) için GFP-pozitif ve GFP-negatif kontroller olarak toplayın. SMN'lerin GFP-pozitif aksonlar henüz bu embriyonik yaşta ekstremitelere kadar uzatılmadığından ekstremiteler GFP-negatiftir.
6. Doku Dissociation
NOT: Toplam ayrışma süresi genellikle deney başına 1,5 saattir.
- Sıcak papain ve albumin-ovomucoid inhibitör çözeltisi, dissosiyatasyondan önce 37 °C 30 dk.a kadar aliquots.
- Kısaca mikrodiskoplu dokuları düşük hızda aşağı çevirin.
- P100 pipetkullanarak, dokuları aspire etmeden mümkün olduğunca çok Hibernate E'yi dikkatlice çıkarın.
NOT: Bir sonraki adımda papain ayrışması etkinliğini azaltmaktan kaçınmak için bu adımdan sonra tüm artık Hazırda Bekletme E kaldırmak için emin olun. - Mikrodissected doku örneklerini içeren 1,7 mL mikrosantrifüj tüplerinin her birine uygun miktarda papain çözeltisi(Tablo 1)ekleyin.
NOT: Hücreler üzerindeki stresi en aza indirirken etkin dissosilasyonen en üst düzeye çıkarmak için papainin uygun hacmi belirlendi. - P200 pipetiyle 8 x'i hafifçe ölçün. Motor nöron canlılığını korumak için tüm triturasyon adımlarını nazikçe gerçekleştirin.
- 37 °C'de 30 dakika boyunca dokuları içeren tüpleri kuluçkaya yatırın, parmak 10'da bir 10'a 10 x hareket ettirerek çalkalayın. Hücreleri 300 x g'de 5 dk boyunca aşağı çevirin.
- Bir sonraki adımda ovomucoid inhibisyonunun etkinliğini sağlamak için, dokuları aspire etmeden mümkün olduğunca çok supernatant çıkarmak ve atmak için bir P1000 pipet kullanın.
- Albumin-ovomucoid inhibitör çözeltisinin uygun hacminde(Tablo 1)p200 pipetle 8 x hafifçe triturating peletleri yeniden askıya alın.
- Tüpün dibine yerleşmek için undissociated doku kalan parçaları izin vermek için 2 dakika bekleyin.
- P200 pipetkullanarak dissociated dokuları aspire etmeden mümkün olduğunca çok supernatant toplayın. Supernatant'ı taze 1,7 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
- 6.10. adımdan sonra bazı doku parçaları ayrık kalırsa, hücreler üzerindeki stresi en aza indirirken, ayrıştırılmış hücrelerin nihai verimini en üst düzeye çıkarmak için orijinal 1,7 mL mikrosantrifüj tüplerinde kalan ayrık dokular için 6.8−6.10 adımlarını tekrarlayın daha önce, adım 6.10 supernatant bulunan ayrıştırılmış.
- Hücreleri 300 x g'de 5 dk. Dikkatle çıkarın ve P1000 pipet kullanarak supernatant atın.
- P1000 pipeti kullanarak 8x boru ile diseksiyon ortamının uygun hacminde(Tablo 1)peleti yeniden askıya alın. Son süspansiyonun uygun hacmi, hücre yoğunluğunun 107 hücre/mL'yi geçmeyecek şekilde belirlendi, bu da akış sitometri makinesinin akışını engelleyebilir, aynı zamanda hücrelerin aşırı seyreltilmemiş olması ve bunun da yavaş bir sıralama hızına yol açar.
- Büyük kümeleri veya sindirilmemiş dokuyu ortadan kaldırmak için süspansiyonları 70 m hücresüzden geçirin. Süspansiyonları 5 mL yuvarlak alt polistiren test tüplerine aktarın ve gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın.
7. Floresan aktive Hücre Sıralama (FACS)
NOT: Bu protokol 15 mw 405 nm mor lazer, 100 mw 488 nm mavi lazer, 75 mw 594 nm turuncu lazer ve 40 mw 640 nm kırmızı lazer ile donatılmış bir FACS ayırıcı kullanılarak optimize edildi. Hücreler 100 μm nozul ile aseptik koşullar altında steril PBS kılıf sıvısı olarak sıralandı. Hücre stresini en aza indirmek için akış hızı 1−3'e ayarlandı, saniyede maksimum 1.000−4.000 olay elde edildi. Toplam FACS süresi genellikle deney başına 1−2 saattir.
- Hücre popülasyonunun düzgün bir şekilde görüntülenebilmeleri için ileri ve yan dağılım için gerilimler ayarlayın. Hücre sıralama için uygun voltajların ayarlanması karmaşıktır ve deneyimli bir FACS işleci gerektirir.
- Farklı hücre popülasyonlarını ayırt etmek için, Hücreleri İleri Dağılım Alanı (FSC-A) tarafından belirlenen boyuta göre, Yan Dağılım Alanı (SSC-A) tarafından belirlenen iç karmaşıklığa göre çizin. Enkaz ve ölü hücreleri dışlamak için Şekil 3Aa ve Şekil Ba'da belirtildiği gibi canlı hücrelerin etrafına bir geçit çizin. Geçitli bölgedeki hücreleri popülasyon 1 (P1) olarak gruplandırın.
- Hücre kümelerini ve doublet'leri dışlamak için, P1 hücrelerini sonraki yan dağılım genişliğine (SSC-W) göre SSC-A'ya göre çizin. Tek hücre popülasyonu popülasyon 2 (P2)(Şekil 3Ab ve Şekil Bb)olarak geçit.
- FSC-A'ya karşı İleri Dağılım Genişliğine (FSC-W) dayalı P2 hücrelerini çizin ve tek hücrelerin popülasyon3 (P3) olarak popülasyonuna kapı açın (Şekil 3Ac ve Şekil Bc).
NOT: 7.3 ve 7.4'te ardışık iki kapının kullanılması hücre kümelerini ve doublet'leri (yüksek FSC-W ve yüksek FSC-A) dışlar. - GFP karşı allophycocyanin (APC) dayalı Kapı P3 hücreleri. APC kanalı otofloresans algılar. Bu kanalda gating otofloresan hücreleri yakalamak önler. FITC/GFP floresan kanalların voltajını ayarlamak için GFP negatif hücreleri kullanın. İdeal olarak, 102civarında bu hücre popülasyonları için pozisyon kapıları . GFP pozitif popülasyon 4 (P4) için her motor nöron tipi için ayrı ayrı geçit eşiklerini seçin(Şekil 3Ad ve Şekil Bd).
NOT: Saf bir kültür elde etmek için GFP kapısını SMN'ler için CN3s/CN4'lerden çok daha yükseğe ayarlayın(Şekil 3Reklam ve Şekil Bd). SMN kültürleri için daha düşük bir GFP kapısı glia ve non-motor nöronlar tarafından kültürlerin kirlenmesine yol açar. Bazı glia ve non-motor nöronlar bir sızıntılı organizatörü nedeniyle düşük seviyeli GFP ekspresyonu olması muhtemeldir. GFP pozitif hücrelerin intotal hücrelere göre yüzdesi genellikle CN3s/CN4'ler için %0,5−1,5 ve Kobİ'ler için %1,5−2,5'tir. Diseksiyon başarılı olduysa, bu sayılar GFP pozitif kapı için uygun konumu belirlemek için bir ölçüt olarak kullanılabilir(Şekil 3Ae ve Şekil Be). - Üreticinin protokolüne göre FACS gerçekleştirin. 500 μL motor nöron kültür ortamı ile dolu taze 1.7 mL mikrosantrifüj tüpler içine P4 hücreleri toplamak. Kaplama kadar buz üzerinde saklayın.
NOT: Hücreler doğrudan kuyulara sıralanabilir, ancak bu kuyu başına eşit olmayan sayıda hücre ile sonuçlanır. Daha iyi bir kaplama dağılımı elde etmek için hücreleri 1,75 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve daha sonra elle plakalayın.
8. Saflaştırılmış Primer Motor Nöronlar Kültürü
- Seyreltik FACS-izole CN3/CN4 ve Motor nöron kültürü ortamı ile SMN süspansiyonlar 37 °C için 5 x 103 ve 1 x 104 hücreleri / mL yoğunlukları için önceden ısıtılır.
NOT: Bir E11.5 embriyosu yaklaşık 1 x 103 CN3/CN4 ve 7 x 103 SMN verir. Ancak, bu verimler büyük ölçüde parçalanmış dokuların saflığına, hücre bölünmesinin tamlığına ve FACS sırasında GFP kapılarının uygun eşiklerine dayanır. - 37 °C doku kültürü kuluçka makinesinden PDL ve laminin ile önceden kaplanmış 96 kuyu plakasını her kuyudan laminar akış kaputuna ve aspire laminine aktarın. Plakaları ve kapakları hemen yıkamadan kullanın.
- PDL/laminin kaplı 96 kuyu plakasının her kuyunun içine 200 μL seyreltilmiş CN3/CN4 ve SMN süspansiyonlar ekleyin. CN3/CN4 ve SMN için son hücre yoğunlukları sırasıyla 1 x 103 ve 2 x 103 hücre/iyi olmalıdır.
NOT: 96 kuyu plakasındaki Kobİ'lerin ilk kaplama yoğunluğu cn3s/CN4s'in (1 x 103 hücre/kuyu) iki katıdır ve benzer son motor nöron sayılarını ve yoğunluklarını 2 ve 9 gün in vitro (DIV) (4−6 x 102 ve 2−4 x 102 hücre, sırasıyla iyi). - Kültür nöronlar 37 °C, 5% CO2 kuluçka.
- Eski ortamın yarısını (100 μL) çıkararak ve aynı hacimde taze motor nöron kültür ortamını değiştirerek her 5 günde bir nöronları besleyin. Nöronal süreçlerin 1 DIV'de görünür hale geldiğinden ve 14 DIV ile daha kalın ve daha uzun olmasını sağlayın (Şekil 4). Nöronal hücre organları genişler ve özellikle Kobİ'ler için uzun süreli kültürlerde biraraya gelir (Şekil 4).
NOT: Kültürlü hücrelerin ayrılmasını önlemek için orijinal orta hacmin yarısını bırakarak tüm orta ve çözüm değişikliklerini gerçekleştirin. Bu fiksasyon ve immünositokimya (ICC) adımları içerir. Tüm ortamlar kaldırılırsa, ne kadar nazikçe olursa olsun, hücrelerin çoğu ayrıştırılır ve yıkanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün amacı, motor nöron bozukluklarının altında yatan mekanizmaların karşılaştırmalı analizini sağlamak için hem birincil CN3/CN4'leri hem de Kobİ'leri yüksek oranda arındırmak ve kültürü geliştirmektir (genel bakış için Şekil 1 ve Şekil 2'ye bakınız).
Nöronlar başarıyla izole edildikten ve kültürde büyüdükten sonra, neredeyse saf primer CN3/CN4 ve SMN kültürleri elde edildi(Şekil 5A,B) ve en az 14 DIV(Şekil 4 ve Şekil 6)için muhafaza edildi. 2 DIV'deki CN3/CN4 ve SMN kültürlerinin saflıkları sırasıyla %93.5 ± 2.2 ve %86.7 ± %4.7 idi, ICC tarafından motor nöron marker Islet1 ve nöronal marker TUJ1 kullanılarak değerlendirildiklerinde(Şekil 5B). Ancak, bu yüksek saflıklar ağır embriyoların yaş ve FACS sırasında GFP kapıları için uygun eşikleri ayarı dayanıyordu(Şekil 3). E10.5'teki embriyoların diseksiyonu, dokuların yumuşaklığı ve yapışkanlığının artması nedeniyle E11.5'teki diseksiyondan daha zordur ve bu da motor nöron veriminin azalmasına neden olur. Ancak, E10.5 CN3s/CN4s ve Kobİ'lerin saflıkları E11.5 embriyoları için karşılaştırılabilir (92.8% ve 82.2% 2 DIV, sırasıyla; veriler tek bir deney elde). CN3s/CN4'lerin ve Kobİ'lerin saflıkları, e13.5 embriyoları kullanıldığında, sadece en yüksek GFP pozitif popülasyonu toplanmış olsa bile (sırasıyla 2 DIV'de %20.7 ve %7.4; tek bir deneyden elde edilen veriler), muhtemelen motor olmayan nöronlarda GFP'nin ekspresyonuna bağlı olarak önemli ölçüde azalmıştır(Şekil 7). Aynı eğilim E12.5 kültürleri için de geçerliydi, ancak çok daha az dramatikti. Bu nedenle, E12.5 veya daha büyük embriyolar bu protokolü kullanarak motor nöronların saflaştırılmasında kullanım için uygun değildir.
Saf motor nöron kültürleri izole büyüme kalıpları anlamak için değerlidir, davranışlar, ve motor nöronların güvenlik açıkları. Bu örnek, bu kültürlerin kimyasal tedaviye motor nöron tepkilerini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Primer CN3s/CN4'lerin ve Kobİ'lerin endoplazmik retikulum (ER) stresine farklı yanıt gösterip gösteremediğini belirlemek için, bu protokol kullanılarak CN3s/CN4s ve SMN'lerin primer monokültürleri elde edildi ve değişen konsantrasyonlarda ER stresi, siklopiazonik asit (CPA) ile tedavi edildi. Nöronlar 2 DIV'de EBM (5, 10, 15, 20, 25 veya 30 μM) veya araç kontrolü (DMSO) ile tedavi edildi ve 3 gün sonra ICC'nin sağkalım oranlarını değerlendirmesi için sabitlendi (Şekil 8A). Her örnekteki canlı nöronların sayısı sayıldı ve dmso ile tedavi edilen kuyularda canlı hücre sayısına bölünen ilaç tedavi kuyularında canlı hücre sayısı olarak sağkalım oranları hesaplandı. CN3/CN4 monokültürleri SMN monokültürlerine göre EBM tedavisine (10−25 μM) anlamlı olarak daha dirençliydi(Şekil 9 ve Şekil 8B)31.
Sonuç olarak, bu protokol nöronal davranışın araştırılması için güçlü ve güvenilir bir sistem sağlayan yüksek saflaştırılmış birincil fare embriyonik CN3/CN4 ve SMN kültürlerin üretimine olanak sağlar.
Şekil 1: Fare embriyonik motor nöronların hazırlanması için şema. Şematik, fare embriyonik motor nöronların izolasyonve kültüründe yer alan adımları ve her adım için saat veya gün içinde yaklaşık zamanı göstermektedir. CN3/CN4 ve SMN için diseksiyon prosedürünün sırası 1'den 4'e kadar sırayla etiketlenir. Kısaltmalar: CN3/CN4 = okülomotor nöron/troklear nöron; SMN = spinal motor nöron; FACS = floresan aktif hücre sıralama; h = saat; d = gün. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ventral orta beynin ve ventral omuriliğin servikal (C1)-lomber (L2-L3) kısmının diseksiyonu. (A) Lateral (a) ve dorsal (b) E11.5 Isl MN GFP-pozitif motor nöronların görünümleri :Flüserin izotiyoyanat altında GFP transgenik fare embriyosu (FITC) aydınlatma. Embriyoyu saydam kılmak için daha önce32'de açıklandığı gibi bir E11.5 dağı embriyosu hazırlandı. Daha sonra, embriyo anti-GFP boyama (yeşil) ile immünoresans etiketleme ile analiz edildi. Görüntüler konfokal mikroskop altında çekildi. Ölçek çubukları = 200 μm (yanal görünüm) ve 400 μm (dorsal görünüm). Kısaltmalar: S = üstün; I = alt; V = ventral; D = dorsal. (B-H) E11.5 ventral orta beyin ve ventral omurilik dokularının parlak ışık (Bb) veya FITC aydınlatması altında flüoresans diseksiyonu stereomikromikroskop kullanılarak donatılmış bir kamera ile çekilen görüntüleri üzerinde vurgulanan diseksiyon adımları. Ölçek çubukları = 200 μm (D) ve 1 mm (A−C, E−H). (B) (a) Kırmızı çizgiler boyunca keserek embriyonun yüz ve kuyruğunun çıkarılması. (b) Embriyo diseksiyon için konumlandırılmış. Mikroskobun ön pozisyonu yıldız işareti ile gösterilir. (C) Dördüncü ventrikülün çatısını yarık için düz kırmızı çizgi boyunca kesme (a) yanal görünüm ve (b) dorsal görünüm. Bu açıklık beyne embriyo dorsal yüzeyi boyunca kesmek için kullanın (kesikli kırmızı ok ile gösterilen yörünge). Bu mezenchyme içeren doku ortaya çıkarır, CN3, ve CN4, hangi kafatası kaldırılabilir. SMN diseksiyonu için, forsepslerin dördüncü ventrikül ile çatısı arasında aynı açıklığa yerleştirilmesi, ardından embriyonun kaudal tarafına doğru kesilmesi (kesik sarı okla gösterilen yörünge). (D) Bilateral GFP-pozitif CN3 ve CN4 çekirdekleri içeren ventral orta beynin son görünümü. Doku kenarları kırmızı bir dikdörtgen ile vurgulanır. CN3 ve CN4 çekirdeklerini ayrı ayrı toplamak için sarı noktalı çizgi boyunca kesme, istenirse. (E) Arka beynin ve omuriliğin geri kalanını açtıktan sonra, sırt dokuları çırparak her iki tarafta ki kırmızı çizgilerin üzerinde cımbız(a)ve sonra (b) ile sıkıştırılır. (F) Kırmızı çizgi boyunca omurilik fazla doku ventral bilateral çıkarılması (a) önce, ve sonra (b) . (G) Kırmızı çizgilerle gösterilen iki yerde ventral omuriliğin kesilmesi. Rostral tarafında, c1 üzerinde enine yüzen ventral omurilik kesim nerede ilk GFP-pozitif ön boynuz projeleri. Alt ekstremitenin üst sınırında omuriliğin kaudal ucunun kesilmesi. Bu kesikler yapıldıktan sonra, ventral omuriliğin lomber (L2-L3) kısmı ile servikal (C1) kesilebilir. (H) GFP-pozitif SMN kolonları içeren ventral omuriliğin son görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ventral orta beyin (A) ve ventral omurilik (B) temsili sıralama çizimleri. (Aa ve Ba) İleri Dağılım Alanı (FSC-A) ve Yan Dağılım Alanı (SSC-A) enkaz ve ölü hücrelerin hariç tutulmadan önce sıralanmış çizimi. (Ab, Bb, Ac, Bc) Hücre kümelerinin hariç tutulması için sıralanmış çizimler (b) ve doublets (c) genişliğine göre (SSC-W) ssc-A ve İleri Dağılım Genişliği (FSC-W) ile FSC-A arasında sırasıyla. (Reklam ve Bd) IslMN:GFP -pozitif motor nöronlar izole etmek için sıralanmış çizimler. Saf bir kültür elde etmek için GFP kapısı Kobİ'ler için(Bd)CN3s/CN4s(Ad)için daha yüksek ayarlanmalıdır. (Ae ve Be) FACS sıralama tarafından toplanmak üzere kaplanmış hücrelerin yüzdeleri. %Üst, geçerli geçitli popülasyondaki hücrelerin önceki geçitli hücre popülasyonundaki hücre sayısına göre yüzdesini gösterirken, %Toplam, toplam hücrelere göre geçitli hücrelerin yüzdesini temsil eder. Toplam hücrelere göre GFP pozitif hücrelerin beklenen yüzdeleri (kırmızı kutulu) CN3/CN4 için %0,5−1,5 ve SMN için %1,5−2,5'tir. Diseksiyon başarılı bir şekilde gerçekleştirildiyse, bu yüzdeler GFP pozitif(Ad ve Bd)içerisinde bir ölçüt olarak kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Primer CN3/CN4 ve SMN monokültürlerinin faz kontrastlı görüntüleri 2, 7 ve 14 DIV'de. Birincil CN3/CN4 ve SMN kültürlerin temsili diferansiyel girişim kontrast görüntüleri, ilgili görüntü edinme ve işleme yazılımı ve 40x hedefleri kullanılarak ters floresan mikroskopile 2, 7 ve 14 DIV'de ele geçirildi. Nöronal süreçler 14 DIV ile daha kalın ve daha uzun hale geldi. Nöronal hücre vücut boyutları genişledi ve özellikle Kobİ'lerde uzun süreli kültürlerde biraraya geldi. Her iki kültür de en az 14 DIV. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yalıtılmış E11.5 fare CN3/CN4 ve SMN kültürlerin karakterizasyonları. (A) E11.5 fare CN3s/CN4s (üst) ve Kobİ'ler (alt) 2 DIV için kültürlü temsili immünositokimya görüntüleri. Hemen hemen tüm kültürlü hücreler motor nöronlardı (TUJ1+, Adacık1+ ). Görüntüler, ilgili görüntü edinme ve işleme yazılımı ve 20x hedefleri kullanılarak ters floresan mikroskopla çekildi. Örnekler, doymuş pikseller olmadan maksimum sinyal yoğunluğuna ulaşmak için görüntülendi ve işlendi. Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki şekillerdeki mikroskobik çalışma ve görüntü işleme işlemleri bu koşullarda gerçekleştirilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) 2 DIV'de E11.5 fare CN3/CN4 ve SMN kültürlerin saflıkları. CN3/CN4 ve SMN kültürlerinin saflıkları sırasıyla %93.5 ± 2.2 ve %86.7 ± 4.7 idi. Ölü nöronal hücre organları pyknotic nükleer morfolojisi ve membran şişmesi taraması ile değerlendirildi. Boncuk lama ve şişme belirtileri gözlendiğinde nöronal süreçler dejeneratif süreçler olarak sınıflandırıldı. Ne hücre vücut ölümü ne de dejeneratif süreçleri olan hücreler canlı non-motor nöronlar (TUJ1+, Adacık1-) veya canlı motor nöronlar (TUJ1+, Adacık1+)33olarak kabul edildi. Motor nöran kültürlerin saflıkları, canlı motor nöronların toplam sayısıartı uygun motor nöronsayısına ve uygun motor nöronların sayısına bölünerek uygulanabilir motor nöronların sayısı olarak hesaplanmıştır. Değerler, üç ayrı deneyin ortalama ± SEM'ini temsil ediyor. Öğrenci t sınavına göre anlamlı değildir (p > 0.05). Hücre sayma 20x büyütme altında elle yapıldı. Kısaltmalar: SEM = ortalamastandart hata. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Primer CN3/CN4 ve SMN monokültürlerinin 2, 7 ve 14 DIV'de temsili immünositokimyası. Primer CN3/CN4 ve SMN kültürleri 2, 7, 14 DIV'de TUJ1 (yeşil) ile immünororesans etiketleme ile analiz edildi ve çekirdekler DAPI (mavi) ile karşılatıldı. Nöronal süreçler daha kalın ve daha uzun 14 DIV. Nöronal hücre vücut boyutları genişledi ve uzun vadeli kültürlerde toplam eğilimindedir, Özellikle Kobİ'ler için. Hem CN3/CN4 hem de SMN kültürleri en az 14 DIV tutulabilir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: E13.5 fare CN3/CN4 ve SMN izole kültürlerin karakterizasyonu. E13.5 CN3/CN4 ve SMN bu protokol kullanılarak izole edilmiş ve kültürlenmiş ve TUJ1 (yeşil) ve Islet1 (kırmızı) ile immünorfloresan etiketleme ile 2 DIV'de analiz edilmiş ve çekirdekler DAPI (mavi) ile karşılatıldı. Birçok motorsuz nöronal hücre (TUJ1+, Islet1-) mevcuttu (oklar) hem CN3/CN4 hem de SMN saflığında ciddi bir azalmaya neden oldu, smn kültürlerde azalma daha belirgindi. Görüntüler 20x büyütme altında yakalandı. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: CN3s/CN4s'in EBM tarafından indüklenen ER stresine seçici olarak dirençli olduğunu gösteren primer motor nöron kültürünün temsili uygulaması. (A) Deneysel anahat: primer CN3/CN4 ve SMN monokültürleri 2 DIV'de EBM veya araç kontrolü (DMSO) ile tedavi edildi ve 3 günlük tedaviden sonra hücre viabilitiesi immünositokimya analizi ile değerlendirildi. Bu anahat yayımlanmış çalışma31değiştirilmiştir. (B) 2 DIV'den itibaren 3 gün boyunca 5−30 μM EBM ile tedavi edilen CN3s/CN4'lerin ve Kobİ'lerin sağkalım oranlarının ölçülmesi. Hayatta kalma oranları, tek başına araç içeren kuyularda (DMSO) canlı hücre sayısına bölünen ilaç la tedavi kuyularında canlı hücre sayısı olarak hesaplanmıştır (Bkz. Şekil 5B efsanesi). Hücre sayma 20x büyütme altında elle yapıldı. Değerler, dört ayrı deneyin ortalama ± SEM'ini temsil ediyor. *p < 0.05; p < 0.005 Öğrencinin t testi ile. Bu rakam daha önce yayınlanmış çalışma31değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Primer CN3/CN4 ve SMN monokültürlerinin temsili immünositokimyası, 2 DIV'den başlayarak artan EBM konsantrasyonlarına 3 günlük maruziyetten sonra. Nöronlar TUJ1 (yeşil) ve çekirdekleri ILE hücrelerin immünüfüoresan etiketleme ile analiz edildi DAPI (mavi) ile karşıt edildi. Primer CN3s/CN4'ler eBM tedavisine primer Kobİ'lere göre daha dirençliydi. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Orta beyin sayısı (X) | Papain | Albumin-ovomucoid | Hazırda Yama | |||||||||
| 10 ≤ X ≤20 | 200 μL | 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ≤30 | 300 μL | 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ≤40 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| Omurilik sayısı (Y) | Papain | Albumin-ovomucoid | Hazırda Yama | |||||||||
| 3 ≤ Y ≤5 | 200 μL | 100 μL | 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ≤10 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ≤15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL | |||||||||
Tablo 1: Uygun hacimlerde papain, albumin-ovomucoid ve son süspansiyon dissosilasyon adımlarında kullanılır. Çeşitli sayıda ventral orta beyin ve ventral omurilik dokularında kullanılacak uygun sayıda papain ve albumin-ovomucoid, birkaç tur optimizasyondan sonra üreticinin talimatlarından değiştirilmiştir. Dokular dissosilasyon ve sıralama sırasında strese maruz kaldığı için, 10'dan fazla ventral orta beyin ve üçten fazla ventral omurilikten oluşan bir havuzlu toplama önerilir. Papain hacmi etkili dissosyasyon ve bu prosedürün stres arasındaki denge göz önünde bulundurularak belirlendi. Albumin-ovomucoid inhibitör çözeltisinin hacmi papainin yarısıdır. Uygun hacimde Hazırda Bekletme E son süspansiyonhücre yoğunluğu107 hücre/mL'yi geçmeyecek, ancak hücreler aşırı seyreltilmiş hale gelmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarihsel olarak, CN3 ve/veya CN4 motor nöronlarının in vitro çalışmaları, ayrıştırılmış17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26gibi heterojen kültürlere güvenmiş ve dilim 27,28kültürler, çünkü bu hücreler ayırt edilemez boyutuna göre çevreleyen hücreler ve bu hücreler için özel belirteçleri bildirilmemiştir. Bu protokol, birincil E11.5 murine CN3s/CN4s'in ve aynı embriyolardan gelen Kobİ'lerin izolasyonu ve kültürü için kapsamlı bir yöntemdir ve kültürlerin yüksek saflığını onaylar. Protokol, aynı fare embriyolarından saf SMN ve CN3/CN4 kültürleri oluşturarak, cn3s/CN4'lerin in vitro davranışlarının, vahşi tipten izole edilmiş Kobİ'lerle ve mutant embriyolardan kontrollü karşılaştırmalar yapılmasını sağlar.
Bu protokol tarafından üretilen CN3s/CN4'lerin ve Kobİ'lerin saf kültürleri, bu motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerinin karşılaştırmalı olarak incelenmesine olanak sağlar. Teoride, diğer kranial motor nöron popülasyonları görüntülenebilir ve bu IslMN:GFP transgenik fare hattı (abducens dahil, motor trigeminal, yüz, ve hipoglossal dahil) diseksiyon edilebilir çünkü, bu protokol onların izolasyon ve kültür için de genişletilebilir, FACS GFP kapıları uygun şekilde ayarlanır sayılsa. Son olarak, bu protokolden elde edilen FACS-sıralanmış motor nöronlar genomik (örneğin, Transposaz erişilebilir Kromatin için sıralama kullanarak Assay veya ATAC-seq) ve/ veya transkripsiyonomik (örneğin, RNA dizisi31)normal gelişimi ve nörojeneratif bozukluklarda belirli motorn alt tiplerinin seçici kırılganlığını incelemek için analizlere tabi tutulabilir31.
Bu protokolde izole kültür sisteminde saf, sağlıklı motor nöronların sayısını en üst düzeye çıkarmak için kritik olan birden fazla adım vardır. Diseksiyon sırasında, GFP-negatif dokular (örneğin, mezenchyme ve DRGs) motor nöronlara zarar vermeden maksimum olarak çıkarılmalıdır, çünkü bu dokular yapıştırıcıdır ve filtreleme sırasında SMN'leri tuzağa düşürebilir veya FACS sıralaması sırasında tıkanma lara neden olabilir. Doku ayrışması sırasında, papain minimal temel hacmi kullanılmalıdır, ve hücreler minimal ama yeterli triturasyon ile hafifçe tedavi edilmelidir. Papain bu protokolde doku ayrışma adımı için kullanılmıştır, çünkü ön veriler hem CN3/CN4 hem de SMN için tripsinden daha az yıkıcı olduğunu göstermiştir. 2 DIV'deki CN3s/CN4 ve Kobİ'lerin plakalı sayılarına göre sağkalım oranları tripsin yerine papain kullanıldığında sırasıyla %39,5'ten %52,7'ye ve %52,3'ten %58,4'e yükselmiştir (0,25%, 4 milyon kuluçka). Bu sayılar tam optimizasyon dan önce gerçekleştirilen tek bir deneytüretilen rağmen, ek raporlar da tripsin sinir sistemi dokularından hücre çıkarma için suboptimal olduğunu düşündürmektedir12,34,35,36. FACS sırasında floresan vital boyalar (propidium iyodür ve kalsein mavisi) ve küçük sıralama memeleri (örn. 70 μm) kullanılmamalıdır, çünkü motor nöron sağkalımiçin zararlıdırlar. 70 μm'lik bir nozul kullanıldığında SMN hücre ölümü önemli ölçüde arttığı için büyük sıralama memelerinin (100 μm veya daha büyük) kullanılması şiddetle tavsiye edilir. FACS'da GFP pozitif hücreler için uygun gating eşiklerinin ayarlanması, saf kültürler elde etmek için kritik bir adımdır. Motor nöron kültürleri forskolin ile desteklenmektedir, IBMX, ve büyüme faktörleri (BDNF, CNTF, ve GDNF). Forskolin ve IBMX katkı SMN hayatta kalma teşvik bildirilmiştir37,38. Mevcut çalışmalardan elde edilen ön veriler forskolin ve IBMX'in de CN3/CN4 sağkalımını önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. IBMX, forskolin ve IBMX+forskolin eklendiğinde 2 DIV'deki CN3s/CN4s'ün kaplama lı sayılarına göre sağkalım oranı sırasıyla %17,5'ten %26,9'a, %31,9'a ve %37,0'e yükselmiştir (sayılar hücre kültürü koşullarının tam optimizasyonundan önce gerçekleştirilen tek bir deneye dayanmaktadır). Kültür hücrelerinin ayrılmasını önlemek için orijinal hacmin yarısını bırakarak tüm orta değişiklikleri ve kültürlü hücrelerin yıkıntılarını gerçekleştirmek en iyisidir. Son olarak, diseksiyon ve motor nöronların kaplaması arasında harcanan zamanı azaltmak da idealdir (örneğin, birden fazla dissectors kullanarak diseksiyon süresini kısaltarak) kültürlerin canlılığını artırmak için.
Bu protokolü izleyerek ortaya çıkabilecek dört büyük potansiyel sorun vardır. Birincisi FACS sonrası motor nöronların düşük verimidir. Düşük verim için potansiyel nedenler genç embriyoların kullanılmasıdır (örn. E10.5), daha az motor nöronları olan, diseksiyon sırasında yapışkan GFP-negatif dokuların yetersiz çıkarılması (örneğin, mezenkim ve DRGs), hangi motor nöronlar tuzak ve filtrasyon sırasında bunların kaldırılmasına yol açabilir, dissosiasyon sırasında yetersiz papainizasyon / triturasyon, ve / veya FACS sırasında gfp-pozitif kapı çok yüksek ayarı. İkinci potansiyel sorun motor nöron kültürlerin düşük saflık, hangi büyük olasılıkla büyük olasılıkla eski embriyoların kullanımı ndan kaynaklanır (örneğin, E12.5) ve / veya FACS sırasında GFP-pozitif kapı çok düşük ayarı. Üçüncü olarak, uygun olmayan FACS sıralaması ve/veya plakaların/kapakların yetersiz PDL/laminin kaplaması nedeniyle kültürde az sayıda bağlı motor nöron görülebilir. Dördüncü olarak, motor nöronlar kültürde düşük canlılık gösterebilir. Düşük canlılığın olası nedenleri arasında kaba ve/veya uzun süreli diseksiyon, dissosyon sırasında aşırı papainizasyon/triturasyon, protokol boyunca hücrelerin uygunsuz şekilde kullanılması (örn. hücrelerin kaba borulanması, hücrelerin buza yerleştirilememesi, PBS ve HBSS'nin önceden soğutulmaması) ve/veya gebenin ötanatizasyonu ile hücrelerin son kaplaması arasında aşırı zaman bulunmaktadır. Taze ve/veya uygun olmayan reaktiflerin kullanımı deneysel sonuçları da bozabilir.
Bu protokolün üç önemli sınırlaması vardır. IslMN:GFP transgenik fareler ve FACS sıralama her ikisi de oldukça pahalıdır. Ancak, şu anda daha ekonomik bir şekilde son derece saflaştırılmış CN3s/ CN4s üretme yeteneğine sahip alternatif bir yöntem olduğu gibi, bu protokol için çok önemlidir. Embriyonik fareler için küçük bir E10.5-E12.5 yaş penceresi vardır ve uygun yaşlı embriyoların mevcut olduğunu doğrulamak zordur, özellikle bir ultrason makinesi mevcut değilse. Sadece saf Kobİ'ler gerekli ise, onlar e12.5-15.0 fare embriyoları gradyan santrifüj10,11,12 ve/ veya p75NTR-antikor tabanlı hücre sıralama kaydırma teknikleri13,14,15,16gibi yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Son olarak, motor nöronların (özellikle CN3s/CN4s) küçük verimi nedeniyle bu kültürlerden büyük miktarda başlangıç materyali gerektiren protein bazlı tahliller mümkün değildir. Kök hücre kaynaklı motor nöronlar31,39, sınırsız olarak oluşturulabilir, teoride bu amaç için ikame edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Biz SMN diseksiyon teknikleri öğretim için Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, ABD) teşekkür ederiz; Dana Farber Kanser Enstitüsü Akış Sitometri Tesisi, Harvard Tıp Fakültesi İmmünoloji Bölümü Akış Sitometri Tesisi, Joslin Diyabet Merkezi Akış Sitometri Çekirdek, Brigham ve Kadın Hastanesi Akış Sitometri Çekirdek, ve Boston Çocuk Hastanesi Akış Sitometri Araştırma Tesisi facs ilköğretim motor nöronların izolasyonu için; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, ek Engle laboratuvar üyeleri ve teknik yardım ve düşünceli tartışma için Als Projesi konsorsiyumu üyeleri. Bu çalışma ALS Projesi tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, R.F. Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad ve NIH Training grant in Genetics T32 GM007748 tarafından finanse edilmiştir; J.J., Schepens Göz Araştırma Enstitüsü aracılığıyla Göz Hastalıklarının Moleküler Üsleri'nde (5T32EY007145-16) NIH/NEI eğitim programı ve Boston Çocuk Hastanesi aracılığıyla Gelişimsel Nöroloji Eğitim Programı Doktora Sonrası Bursu (5T32NS007473-19) tarafından desteklendi; M.C.W, NEI (5K08EY027850) ve Çocuk Hastanesi Oftalmoloji Vakfı (Fakülte Keşif Ödülü) tarafından desteklendi; Ve E.C.E. howard Hughes Tıp Enstitüsü araştırmacısı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
