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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60455
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

Summary

Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d'expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l'aide d'un système d'imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.

Abstract

La signalisation d'entaille régule le maintien des cellules neurales de tige/progénitrice par des interactions cellules-cellules. Les composants de la signalisation Notch présentent une expression dynamique. L'effecteur de signalisation d'entaille Hes1 et le Notch ligand Delta-like1 (Dll1) sont exprimés d'une manière oscillatoire dans les cellules neurales de tige/progénitrice. Parce que la période de l'expression oscillatoire de ces gènes est très courte (2 h), il est difficile de surveiller leur expression cyclique. Pour examiner ces changements rapides dans l'expression des gènes ou la dynamique des protéines, des journalistes d'intervention rapide sont nécessaires. En raison de sa cinétique de maturation rapide et de sa sensibilité élevée, la luciférase de journaliste de bioluminescence est appropriée pour surveiller les changements rapides d'expression de gène dans les cellules vivantes. Nous avons employé un journaliste déstabilisé de luciferase pour surveiller l'activité de promoteur et un journaliste luciferase-fused pour visualiser la dynamique de protéine à la résolution simple de cellules. Ces reporters de bioluminescence montrent un chiffre d'affaires rapide et génèrent des signaux très faibles; par conséquent, nous avons développé un système d'imagerie de bioluminescence très sensible pour détecter de tels signaux faibles. Ces méthodes nous permettent de surveiller diverses dynamiques d'expression génique dans les cellules et les tissus vivants, qui sont des informations importantes pour aider à comprendre les états cellulaires réels.

Introduction

Le cerveau des mammifères est composé d'un grand nombre de différents types de neurones et de cellules gliales. Toutes les cellules sont générées à partir de cellules neurales souches/progénitrices (PNJ), qui prolifèrent d'abord pour augmenter leur nombre, puis commencent à se différencier en neurones, et finalement donner naissance à des cellules gliales1,2,3,4,5. Une fois que les cellules se sont différenciées en neurones, elles ne peuvent pas proliférer ou augmenter leur nombre, et, par conséquent, le maintien des PNJ jusqu'à des stades ultérieurs est important. La signalisation d'entaille par l'intermédiaire des interactions cellule-cellule joue un rôle important en maintenant des PNJ6,7. Les ligands d'entaille interagissent avec la protéine membranaire, Notch, à la surface des cellules voisines et activent la protéine Notch. Après l'activation, la protéolyse de la protéine Notch se produit, libérant ainsi le domaine intracellulaire de Notch (NICD) de la membrane cellulaire dans le noyau8,9,10. Dans le noyau, NICD se lie aux régions promotrices de Hes1 et Hes5 (Hes1/5) et active l'expression de ces gènes. Hes1/5 réprimer l'expression des gènes proneural Ascl1 et Neurogenin1 /2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Puisque les gènes proneural induisent la différenciation neuronale, Hes1/5 jouent des rôles essentiels en maintenant des PNJ. En outre, comme les gènes proneural peuvent activer l'expression de la Notch ligand Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 également réprimer l'expression de Dll1. Par conséquent, l'expression de Dll1 conduit à des cellules voisines étant négative pour Dll1 via Notch signalisation. De cette façon, les cellules inhibent les cellules adjacentes de suivre leur même sort, un phénomène connu sous le nom d'inhibition latérale8. Dans le cerveau en développement, l'inhibition latérale joue un rôle dans la génération de différents types de cellules.

L'imagerie en temps réel au niveau des cellules individuelles révèle des expressions dynamiques des composants de la signalisation Notch dans les PNJ15,16,17. La signalisation d'encoche active l'expression de Hes1, mais la protéine Hes1 se lie à son propre promoteur et réprime sa propre expression. En outre, Hes1 est une protéine extrêmement instable, qui est dégradée par la voie ubiquitine-protéasome ; par conséquent, la répression de son propre promoteur n'est que de courte durée et la transcription recommence. De cette façon, l'expression de Hes1 oscille à la fois au niveau de la transcription et de la traduction dans un cycle de 2 h18. L'expression oscillatoire de Hes1, à son tour, induit l'expression oscillatoire des gènes cibles en aval, tels que Ascl1, Neurog2, et Dll1, par la répression périodique15,16,17,19. Tandis que les gènes proneural peuvent induire la différenciation neuronale, leur expression oscillatoire n'est pas suffisante pour la différenciation neuronale ; leur expression soutenue est plutôt essentielle à la différenciation neuronale. L'expression oscillatoire des gènes proneural est importante pour maintenir des PNJ plutôt que pour induire la différenciation neuronale14,15,16. L'expression de Dll1 oscille à la fois aux niveaux de transcription et de traduction au cours de diverses morphogenèses, telles que la neurogenèse et la somitogénèse. L'expression dynamique de Dll1 est importante pour la morphogénèse normale et l'expression régulière de Dll1 induit des défauts dans la neurogenèse et la somitogenèse17. Ces résultats démontrent la fonction importante que la dynamique de l'expression génique et de la cinétique protéique ont sur la régulation de divers événements développementaux (c.-à-d., différentes dynamiques d'expression produisent des sorties différentes dans les comportements cellulaires).

Pour analyser la dynamique de la signalisation Notch, l'analyse statique des tissus et des cellules est insuffisante parce qu'ils sont en constante évolution. L'imagerie en temps réel des cellules individuelles est un outil puissant pour révéler la dynamique de l'expression des gènes. L'expression dynamique des molécules de signalisation Notch subissent des réponses cycliques rapides dans la période de 2-3 h. Cette expression périodique rapide présente deux problèmes difficiles pour la surveillance en temps réel : (1) l'expression des molécules est supprimée à de faibles niveaux, et (2) le roulement rapide exige des journalistes de réponse rapide. Pour surmonter ces problèmes, nous avons déjà développé une méthode d'imagerie en temps réel de bioluminescence20. Parce que le journaliste de bioluminescence a une sensibilité plus élevée et un temps de maturation plus court que les journalistes fluorescents, cette stratégie nous permet de surveiller la dynamique rapide dans les cellules vivantes. En utilisant la visualisation en temps réel, nous avons constaté que plus de gènes présentaient une expression dynamique que nous ne le pensions auparavant. En outre, le nombre de rapports montrant l'expression et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes et l'importance de ces dynamiques dans divers événements biologiques a augmenté, suggérant un rôle fondamental de la dynamique dans les expressions génétiques21,22.

Dans ce rapport, nous décrivons une manière de visualiser l'expression du Ligand de Notch Dll1 dans les PNJ dans les cultures dissociées et dans les cultures corticales de tranche. Pour surveiller la dynamique de la transcription de Dll1 aux niveaux de cellules simples, nous avons produit des cultures dissociées des PNJ dérivées du telencephalon embryonnaire des souris transgéniques portant le journaliste de pDll1-Ub-Fluc, un journaliste de luciferase déstabilisé d'Un promoteur Dll1. Pour surveiller la dynamique des protéines Dll1 in vivo, nous avons introduit le journaliste de fusion Dll1-Fluc dans les PNJ dans le cortex et visualisé l'expression du journaliste dans les PNJ dans les cultures de tranches corticales. L'imagerie en temps réel nous a permis de saisir les diverses caractéristiques de l'expression génique et de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle.

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Protocol

Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Institut des sciences médicales et de la vie de la frontière de l'Université de Kyoto.

1. Journalistes bioluminescence

REMARQUE : Le journaliste de luciferase est approprié pour mesurer la dynamique rapide de l'activité de promoteur en fusionnant le signal de dégradation. De plus, le reporter de fusion de luciferase permet de surveiller la dynamique des protéines dans la cellule unique. Les deux types de journalistes sont disponibles pour la culture monocouche (culture de dissociation) et la culture tissulaire (culture de tranche) expérience.

  1. Reporter pour la surveillance de l'activité du promoteur Dll117
    REMARQUE : Pour surveiller les changements rapides dans l'expression de gène, le journaliste rapide-réponse et instable est essentiel. La luciferase Firefly (Fluc) montre une maturation rapide par rapport aux reporters de fluorescéine. Parce que l'ubiquitine fusionnée luciferase journaliste (Ub-Fluc) montre une dégradation rapide et un roulement rapide, il est très utile de surveiller l'expression dynamique des gènes dans les cellules vivantes20.
    1. Utilisez d'utiliser le journaliste de luciferase déstabilisé par le promoteur Dll1, la luciferase ubiquitinated (pDll1-Ub-Fluc, Figure 1A panneau supérieur), pour surveiller les changements rapides dans l'expression d'Edl1 à un niveau transcriptionnel17.
    2. Générer une ligne de souris transgénique portant pDll1-Ub-Fluc pour l'expression stable de ce journaliste.
  2. Reporter pour la surveillance de la dynamique des protéines Dll117.
    1. Pour la génération de souris knock-in, insérez l'ADNc luciferase dans les 3 termini de la région de codage Dll1 afin que la protéine de fusion Dll1-luciferase soit exprimée (dll1-Fluc reporter, Figure 1A, panneau inférieur)17.
    2. Surveillez la dynamique d'expression de Dll1 à des niveaux de protéines en mesurant l'activité de la luciferase.
    3. Pour surveiller la dynamique des protéines Dll1 au niveau des tissus, présentez le journaliste Dll1-Fluc dans les PNJ dans le télencéphale embryonnaire par électroporation in utero.

2. Système d'imagerie de bioluminescence

  1. Construire un système d'imagerie en direct de bioluminescence à l'aide d'un microscope inversé installé avec une caméra CCD très sensible et refroidie à l'eau. Afin de réduire le bruit et d'obtenir une sensibilité élevée, refroidir la caméra avec de l'eau réfrigérée fournie par le circulateur d'eau à une température optimisée de -90 oC.
  2. Pour l'imagerie cellulaire/tissu l'image vivante, installez le système d'incubation, en contrôlant la température et le gaz mélangé, au stade du microscope.
  3. Pour l'imagerie de l'expression de journaliste de luciferase déstabilisé, utilisez l'angle numérique élevé (NA : 1.30) objectif d'huile-immersion 40x. La distance de travail de cette lentille est de 0,2 mm, il est disponible non seulement pour la culture cellulaire mono-couche, mais aussi la culture des tranches.
  4. Pour une double surveillance de la luciférase et de l'expression du journaliste à la fluorescéine, installez le dispositif d'éclairage LED sur le chemin lumineux du microscope.
  5. Contrôler l'imagerie en accéléré à l'aide d'un logiciel associé au microscope (p. ex., programme d'acquisition multidimensionnelle du logiciel MetaMorph).
  6. Préparer l'ensemble du système dans une pièce sombre, parce que le signal du journaliste de luciferase déstabilisé est très faible, et d'éviter la lumière extraterrestre empêcher l'acquisition.

3. Cultures de dissociation de cellules neurales de tige/progénitrice (NPC)

  1. Préparation des médias culturels, de la vaisselle et des réactifs pour la culture de dissociation des PNJ
    1. Préparer le média N2/B27 pour la culture des cellules neurales de tige/progénitrice avec une concentration finale de 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteine, 10 ng/mL bFGF et 50 U/mL Penicillin/Streptomycin dans les médias DMEM/F12.
    2. Préparer la solution de papain pour la dissociation contenant 7 U/mL papain, 0.006% DNase et 1 mM N-acetylcysteine dans les médias EBSS.
    3. Préparer 100 mM de solution de sodium de luciferin pour l'imagerie par luminescence. Diluer la solution de luciferin de 100 mM dans les médias N2/B27 jusqu'à une concentration finale de 1 mM.
      REMARQUE: Luciferin montre l'autofluorescéine elle-même. Dans le cas de la double imagerie de luciferase-fluorescence, particulièrement EGFP, abaissant la concentration de luciferin à 0.5 mM est meilleur.
    4. Enrober un fond en verre de 35 mm (diamètre de verre de 27 mm) d'une solution de 40 g/mL de poly-l-lysine (PLL) pour 1 h à température ambiante. Après l'incubation, laver les plaques 3x avec du PBS et laisser sécher.
  2. Dissection des embryons et dissociation des PNJ
    1. Après avoir euthanasié une souris transgénique pDll1-Ub-luc enceinte (jour embryonnaire 12,5 (E12.5)) par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale, coupez l'abdomen et enlevez l'utérus.
      REMARQUE : Les chercheurs doivent suivre les règlements et les lignes directrices du comité de recherche sur les animaux de leur établissement. Si des médicaments d'anesthésie ou de soulagement de la douleur sont utilisés, utilisez-les correctement.
    2. Transférer l'utérus dans un plat Petri de 10 cm contenant 25 ml de PBS glacé. Sortir les embryons de l'utérus dans le PBS glacé, à l'aide de micro-ciseaux et de forceps fins.
    3. Couper la tête de chaque embryon à l'aide de ciseaux et la transférer dans des plats Petri de 10 cm contenant du DMEM/F12 glacé. Enlever l'épiderme et le cartilage entourant le cerveau et transférer le cerveau dans un plat Petri de 35 mm contenant 3 ml de glace de n.m2/B27.
    4. Couper le téncephalon droit et gauche du diencéphalon (Figure 1Ba-f, C,D). Enlever les méninges qui recouvrent la surface du téencéphale à l'aide de forceps fins (Figure 1Bi). En utilisant à nouveau des forceps fins, retirez la partie dorso-latérale du cortex du téiencéphale(figure 1Bg,h,j-l E).
    5. Transférer les tissus dans de nouveaux tubes de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P1000 et retirer tout support supplémentaire avec une pipette P200. Ajouter 0,1 ml de solution de papaïne par tissu cérébral (une paire du cortex). Après 15 min d'incubation à 24 oC, pipette doucement les échantillons 10 fois avec la pipette P1000. Incuber à nouveau les échantillons pendant 15 min à 24 oC.
    6. Doucement pipette les échantillons 10 fois avec pipette P1000. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 400 x g et température ambiante (RT). Jetez le supernatant.
    7. Ajouter 1 ml de support DMEM/F12 à la pastille. Pipette délicate10 fois avec pipette P1000. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 400 x g et RT. Jeter le supernatant. Répétez cette opération au moins 2 fois de plus.
    8. À la pastille, ajouter 0,5 mL de support N2/B27 contenant 1 mM de luciférine et bien mélanger. Ensemencez les cellules (1 x 106 cellules) dans un plat en verre enduit de PLL. Culture des cellules de l'incubateur CO2 pendant 1 h. Une fois que les cellules adhèrent au plat, ajouter 2 ml de support N2/B27, contenant 1 mM de luciferin.
  3. Visualisation de l'expression du journaliste luciferase dans la culture de dissociation du PNJ
    1. Démarrez le système d'imagerie en direct de luminescence avant d'effectuer la dissection. Pour la culture PNJ, régler la température de l'incubateur de scène à 37 oC et régler le réglage du mélange de gaz 20% O2, 5% CO2.
    2. Mettez l'huile d'immersion à l'objectif objectif. Placer le plat d'échantillon sur la scène du microscope. Afficher le champ manuellement et choisir la meilleure position et le foyer des cellules d'intérêt. Cliquez en direct pour acquérir l'image de test.
    3. Exécuter l'acquisition en time-lapse par des acquisitions en 2 dimensions (luminescence et champ lumineux) pour 24 h avec le programme d'acquisition multidimensionnelle. Choisissez le programme d'acquisition multidimensionnelle et définiz le paramètre d'acquisition comme suit (étape 3.3.6).
    4. Pour l'acquisition d'images de luminescence, utilisez les paramètres de l'appareil photo suivants : faible taux de transfert (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min de temps d'exposition. Pour l'acquisition d'images en champ lumineux, utilisez les paramètres suivants : taux de transfert intermédiaire (1 MHz), 1 x 1 binning et 100 ms de temps d'exposition.

4. Électroporation in utero

REMARQUE: Ceci est effectué pour l'introduction de Dll1-Fluc journaliste dans les cellules progénitrices neurales.

  1. Préparation d'outils et de réactifs pour l'électroporation
    1. Préparer des micro capillaires pour l'injection d'ADN dans le ventricule du ténencéphale embryonnaire. Étirez un capillaire d'herbe avec la chaleur et coupez et polissez le bout de celui-ci avec la machine de polissage.
    2. Préparer un mélange d'ADN avec de la teinture (p. ex., bleu Trypan). La concentration de chaque ADN est de 1 g/L en PBS et d'ajouter le colorant à une concentration finale de 10%.
      REMARQUE : Utilisez le mélange d'ADN pour la visualisation de la dynamique des protéines Dll1 comme suit : Dll1-Fluc (dll1 protein reporter, Figure 2E upper) et pEF-EGFP (EF promoter driven EGFP expression vector, Figure 2E lower), monitoring the location and morphology of transfected cells.
    3. Préparer deux types d'anesthésiques : 3,88 mg/mL de pentobarbital et 0,12 % de xylazine, en 1x PBS stérile.
    4. Utilisez les instruments stériles et les gants chirurgicaux pendant l'opération.
  2. Électroporation in utero
    1. Anesthésiez une souris ICR enceinte (E12.5) par administration intrapéritonéale d'anesthésiques avec 500 l de pentobarbital de 3,88 mg/mL et 500 l de 0,12% de xylazine.
      REMARQUE : Les chercheurs doivent suivre la réglementation des expériences sur les animaux. Si l'on a besoin d'utiliser des médicaments d'anesthésie ou de soulagement de la douleur, utilisez-les correctement.
    2. Clip les cheveux et désinfecter la peau avec un gommage chirurgical.
    3. Vérifiez le manque de réponse de pincement d'orteil. Une fois que le réflexe de pédale n'est pas observé, faire une coupe de 2-3 cm à travers l'abdomen le long de la ligne médiane. Mettez les gazes autour de la partie disséquée et mouillez les gazes avec le PBS chaud pour ne pas sécher l'incision. Sortez doucement la corne utérine droite avec des forceps en forme d'anneau et comptez le nombre d'embryons.
    4. Injecter 1-2 L de l'ADN mélangé dans le ventricule du ténadcéphale des embryons délicatement avec micro capillaire.
      REMARQUE: Lorsque l'injection est réussie, on peut voir la couleur bleue du colorant sur la surface de l'utérus.
    5. Mouillez l'utérus et l'électrode avant de fournir les impulsions de tension, puis maintenez la tête d'un embryon doucement. Définir l'électrode chargée positivement sur le côté de l'hémisphère, dans lequel l'ADN a été injecté. S'assurer que l'état du pouls de l'électroporation est de 30-50 V pour 50 ms, l'intervalle des impulsions est de 1 s (50 ms de charge et 950 ms de non-charge). Fournir 5 impulsions à un embryon et vérifier que les bulles sont générées à partir de l'électrode chargée négativement.
      REMARQUE : Assurez-vous que la direction de l'électrode : l'ADN est incorporé dans les cellules du côté de l'électrode positive. Pendant cette procédure, ne déplacez pas la position de l'électrode.
    6. Répétez les étapes 4.2.3-4.2.4 pour les autres embryons et retournez la corne utérine à la cavité abdominale. Effectuer la même procédure aux embryons dans la corne utérine gauche.
    7. Après avoir remis le côté gauche, suturer l'incision par une suture de soie (4-0) avec une aiguille (17 mm). Avant de fermer complètement l'incision, mettre le PBS chaud dans la cavité abdominale
      REMARQUE : L'intervalle entre les sutures est d'environ 2 mm.
    8. Après avoir terminé la chirurgie, placez la souris sur un coussin chauffant pour la récupération post-anesthésie. Maison de la souris individuellement.
      REMARQUE : Les chercheurs doivent suivre leur réglementation locale des expériences animales. Si l'on a besoin d'utiliser des médicaments antidouleur, utilisez-les correctement.

5. Préparation des cultures de tranches du cortex en développement et visualisation de l'expression du journaliste de la luciferase dans les tranches corticales

  1. Préparation des médias culturels et des réactifs pour les cultures de tranches du cortex
    1. Préparer des supports enrichis pour la culture de tranches corticales contenant 5 % de sérum bovin fœtal et 5 % de sérum de cheval dans les médias N2/B27.
    2. Bulle 100% O2 gaz à travers les médias DMEM/F12 pour la dissection et la fabrication de tranches corticales.
      REMARQUE : Pour utiliser le gaz d'oxygène en toute sécurité, entreposez le cylindre O2 dans l'armoire à cylindres et surveillez la concentration d'oxygène dans l'air par un compteur de concentration d'oxygène.
    3. Diluer 100 mM de solution de sodium de luciferin dans un support enrichi jusqu'à une concentration finale de 1 mM.
      REMARQUE: Luciferin montre l'autofluorescéine elle-même. Dans le cas de la double imagerie par la luciférase-fluorescence, en particulier l'EGFP, une plus faible concentration de luciferine (0,5 mM) est meilleure.
    4. Définir l'incubateur multigaz à 37 oC par 40 % O2 et 5 % de CO2.
  2. Dissection des embryons et examen de l'expression du journaliste fluorescent
    1. Après avoir euthanasié la souris enceinte à laquelle les journalistes (E13.5) sont introduits par électroporation in utero (étape 4.2), couper à travers l'abdomen et sortir l'utérus.
      REMARQUE : Les chercheurs doivent suivre la réglementation des expériences sur les animaux. Si vous utilisez des analgésiques ou des analgésiques, utilisez-les correctement.
    2. Transférer l'utérus dans un plat Petri de 10 cm contenant du PBS. Sortir les embryons de l'utérus dans PBS, en utilisant des micro-ciseaux et des forceps fins. Couper la tête de chaque embryon et transférer dans un plat Petri de 10 cm contenant du support DMEM/F12 à bulles avec 100% de gaz O2. Enlever l'épiderme et le cartilage entourant le cerveau dans les médias DMEM/F12.
    3. Placez le cerveau sur le couvercle du plat Petri avec des forceps en forme d'anneau et placez le couvercle sur le stade stéréoscopique du microscope à fluorescence. Vérifier la région du cortex exprimant des protéines fluorescentes sous la lumière d'excitation (Figure 2A,B).
    4. Transférer le cerveau sur une planche à découper en caoutchouc de silicone remplie de 30 ml de d'amplitude SMEM/F12 avec 100% de gaz O2. Enlever les méninges qui recouvrent la surface du téencéphale par de fines forceps.
    5. Couper la frontière entre la partie médiale et latérale du ténencéphale dorsal et séparer en deux hémisphères à l'aide d'un couteau micro chirurgical ou de forceps fins. À l'aide d'un micro couteau chirurgical, couper le cortex comme des rayures et faire des tranches corticales(figure 2C,D). Tranches de pipette avec le milieu utilisant la pipette et les transfèrez aux milieuaux enrichis dans un plat de 35 mm.
    6. Mettre les tranches sur les inserts de culture dans les plats en verre avec des supports enrichis. Corriger la direction des tranches à l'aide de forceps fins. Configurez la surface coupée des tranches à la surface de l'insert de culture. Retirez le support supplémentaire par une pipette. Incuber les tranches dans un incubateur multigaz réglé par 40 % O2 et 5 % de CO2 à 37 oC pendant 30 min.
    7. Ajouter 300 l de support enrichi contenant 1 mM de luciférine à l'extérieur de l'insert de culture dans le plat en verre.
  3. Visualisation de l'expression du journaliste de luciferase dans les cultures de tranche
    1. Démarrer le système d'imagerie en direct de luminescence avant de commencer la dissection. Utilisez l'état suivant des cultures de tranches corticales : 40 % O2, 5 % CO2 et 37 oC.
    2. Mettez l'huile d'immersion à l'objectif 40x. Mettre le plat d'échantillon au stade du microscope. Acquérir l'image d'essai de fluorescent et définir la position et le plan de mise au point à la région d'intérêt sous l'éclairage de la lumière d'excitation.
    3. Exécuter l'acquisition en time-lapse par des acquisitions de 3-dimentional (luminescence, fluorescence et champ lumineux) pour 24 h (Figure 2F-H). Pour l'acquisition d'images de luminescence, utilisez les paramètres de l'appareil photo suivants : faible taux de transfert (50 kHz), binning 2x2/4x4, temps d'exposition de 10 min/5 min. Pour l'acquisition de la fluorescence et de l'image de champ lumineux, utilisez les paramètres suivants : taux de transfert intermédiaire (1 MHz), binning 1x1 et temps d'exposition de 100 ms.

6. Traitement et analyse d'images

  1. Connectez chaque image et faites les images de pile. Cliquez sur La séquence d'image d'importation du menu du fichier (Fichier Importation (Importation) Séquenced'image ) et choisissez le dossier, où les images acquises sont enregistrées. Mettez quelques mots contenus dans le nom de fichier à la colonne de file nom contient.
  2. Pour supprimer le bruit des rayons cosmiques sur les images de bioluminescence, appliquez le plug-in SpikeNoise Filter de ImageJ/Fiji. Ouvrez les images de pile et cliquez sur SpikeNoise Filter.
  3. Appliquer Savitzky Golay Temporal Filter plug-in pour obtenir une dynamique claire de l'expression du journaliste. Ouvrez les images de pile et cliquez sur Savitzky Golay Temporal Filter.
  4. Pour mesurer l'intensité de l'expression du journaliste, appliquez le plug-in Z Axis Profile Plus à chaque cellule. Sélectionnez les cellules et définiz les ROI, la région d'intérêt et cliquez sur Z Axis Profile Plus.

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Representative Results

Expressions des gènes Hes1/7 présentent 2 h cycle d'oscillation dans diverses lignées cellulaires et pendant la somitogénèse. En outre, la période d'oscillation est très courte et leurs ARNm et les protéines sont extrêmement instables avec des demi-vies d'environ 20 min. Si l'utilisation d'un journaliste de réponse lente, nous ne pouvons pas tracer une telle dynamique rapide, et si l'utilisation d'un journaliste stable, il s'accumule progressivement tandis que l'expression du gène oscille. Ainsi, le journaliste doit être rapidement dégradé pour surveiller le roulement rapide de ces gènes exprimés cycliquement. Pour surmonter ces problèmes, nous avons utilisé le journaliste de luciferase pour surveiller l'expression dynamique des oscillateurs. Parce que le journaliste de bioluminescence a un temps de maturation court et une grande sensibilité, il nous permet de suivre la dynamique rapide des oscillateurs ultradiens. Comme un journaliste fluorescent, le journaliste de la luciferase peut surveiller la dynamique d'expression d'une protéine en étant fusionné à la séquence de codage génétique(Figure 1A, Figure 2E et Figure 3D). Les produits géniques fusionnés par Luciferase présentent la même expression, le même chiffre d'affaires et la même cinétique de translocation dans les cellules que les protéines endogènes. En outre, pour surveiller l'activité du promoteur du gène oscillant Dll1, nous avons utilisé la luciferase ubiquitinated, un journaliste de luciferase déstabilisé (Figure 1A et Figure 3A)23, dont la demi-vie est d'environ 10 min20. En utilisant divers types de journalistes de luciferase, nous avons produit des souris transgéniques ou des souris knocked-in pour obtenir l'expression stable du journaliste dans les PNJ pendant la neurogenèse17. Pour visualiser l'expression de journaliste aux niveaux de cellules simples dans la culture de tissu, l'introduction dispersée du journaliste est préférable. Ainsi, nous avons utilisé la transfection transitoire du gène reporter en PNJ par électroporation in utero(figure 2F-H). Le système de journaliste de luciferase a été employé dans le domaine des rythmes circadiens pour surveiller les expressions dynamiques des gènes d'horloge pendant une longue période (par exemple, 1 semaine), suggérant que la luciférine (D-luciferin), le substrat de l'enzyme de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase, soit très stable et n'a aucune toxicité pour les cellules vivantes24,25. Nous utilisons habituellement la luciférine dans des concentrations de 1 mM dans les médias, ce qui est suffisant pour la formation image de cellule vivante de nuit. De plus, le système d'imagerie au microscope nous permet d'acquérir des images multidimensionnelles, des images de champ lumineux, des images de fluorescence et des images de chemiluminescence(figure 2F-H et Figure 3E).

En utilisant ces conditions, nous avons visualisé les expressions de divers gènes de l'horloge ultradienne, y compris Hes1, Ascl1, Neurog2 et Dll1 (Figures 2 et Figure 3). Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 3. Le journaliste de l'activité de promoteur de Dll1 a exhibé l'expression oscillatoire dans les PNJ dérivés du telencephalon des souris de journaliste de Dll1-Ub-Fluc. Le journaliste de la luciferase déstabilisé (figure 3A) a indiqué une réglementation forte de haut en bas de l'expression de l'activité du promoteur ( Figure3B,C). Dans ce cas, les cellules progénitrices neurales simples ont montré un cycle d'oscillation d'environ 2.5 h avec diverses amplitudes au cours de 13 h (figure 3C). Le journaliste luciferase réponse rapide nous permet de capturer la dynamique de transmission de la signalisation Notch entre deux cellules vivantes (Figure 3D-F et Film supplémentaire S1). Nous avons préparé deux types de mélanges d'ADN : (1) journaliste promoteur Hes1 (pHes1-Ub-luc) et vecteur d'expression EGFP, et (2) d'un journaliste protéique Dll1 (Dll1-Luc) et d'un vecteur d'expression mCherry et les a transfectés en PNJ séparément. Ensuite, nous avons recueilli les deux types de cellules et co-cultivés pour mesurer l'expression des journalistes dans les cellules vivantes. Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 3E,F. Cellules positives EGFP adjacentes portant le journaliste de Hes1 et les cellules positives de mCherry exprimant le journaliste de protéine dll1 contactés les uns avec les autres pendant l'observation. L'expression du journaliste de Hes1 dans une cellule verte semblait commencer environ 60 min après le contact de deux cellules (Figure 3E,F). Ceci a suggéré que le délai de transmission de la signalisation de Notch entre les cellules adjacentes était d'environ 1 h. De plus, pendant la transmission du signal, l'expression des protéines Dll1 a montré une translocation dynamique dans une cellule rouge (figure 3E).

Figure 1
Figure 1 : Dissection du cerveau embryonnaire de souris. (A) La structure des journalistes de luciferase, journaliste de promoteur de Dll1 et journaliste de protéine de Dll1. (B) Procédure de dissection. (a) La vue latérale d'un embryon de souris. (b) Couper la tête avec la ligne pointillée. (c) Enlever l'épiderme et le cartilage de l'espace entre le téencéphale et le cerveau moyen. d) Couper le tissu environnant le long de la ligne médiane entre les hémisphères droit et gauche. (e) Retirez le tissu de la rupture centrale des deux côtés. (f) Le téencéphale et le cerveau moyen après l'ablation du tissu environnant. (g) Séparer le télencéphalon (tel), le cerveau moyen (milieu) et l'ampoule olfactive (OB). h) Section transversale du telencephalon, montrée en ligne pointillée dans (g). (i) Enlevez les méninges entourant la surface du telencephalon. (j) Séparer le téencéphale en deux parties : partie médiale et latérale. (k) Couper la bordure du cortex et l'éminence ganglionique (GE). (l) La partie dorso-latérale du cortex est utilisée pour la culture de dissociation. (C) Le cerveau au jour embryonnaire 14 (E14), composé de la gauche (a) et à droite (b) hémisphères du téiencéphale et du cerveau moyen (c). (D) Les hémisphères télencéphaliques se sont séparés du cerveau moyen. (E) Un hémisphère disséqué du telencephalon : la partie ventrolatérale du telencephalon comprenant les éminences ganglioniques (d), la partie dorsolatérale du telencephalon utilisée pour les cultures dissociées et les cultures de tranche (e), la partie médiane du telencephalon (f) et les méninges couvrant la surface du cerveau (g). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Faire les tranches corticales du télencéphale embryonnaire et visualiser la dynamique des protéines Dll1 dans les cultures de tranches corticales. (A) Vérification de l'expression de l'EGFP à l'aide d'un microscope stéréoscopique à fluorescence. La flèche rouge montre la région du cortex exprimant l'EGFP. L'hémisphère gauche (a), l'hémisphère droit (b) et le cerveau moyen (c). (B) Les lignes pointillées indiquent les contours des régions cérébrales indiquées dans (A). (C) Cortex disséqué du ténencéphale dorsolatéral. Les pointes de flèche blanches indiquent les bords coupés. (D) Tranches corticales du ténencéphale dorso-latérale. (E) Structures génétiques des journalistes pour visualiser la dynamique des protéines Dll1 dans les PNJ. Le rapporteur de protéine de Dll1, Dll1-Fluc (supérieur) ont été introduits dans les PNJ avec un vecteur d'expression d'EGFP (inférieur) pour surveiller la morphologie et la migration des cellules dans les tranches corticales. (F-H) Images tridimensionnelles de champ lumineux (F), expression GFP (G), et bioluminescence (H) dans la tranche corticale. Le système d'imagerie de bioluminescence a permis de retracer simultanément les expressions du journaliste de la luciférase et de la fluorescence. Barres d'échelle : 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Données représentatives pour la visualisation et l'analyse de l'expression dynamique du gène Dll1 dans la culture des PNJ. (A) Le journaliste construit pour visualiser l'expression Dll1 au niveau transcriptionnel, à l'aide d'un journaliste de luciferase déstabilisé (Ub-luciferase, luciferase ubiquitinated). (B) Visualisation de l'expression de Dll1 dans un seul PNJ avec un journaliste de bioluminescence. Les nombres du panneau montrent les points de pointe de l'expression oscillatoire de Dll1 correspondant aux nombres du panneau C. (C) Une parcelle de parcours temporel de la bioluminescence du PNJ dissocié montré dans (B), présentant l'expression dynamique de Dll1. (D-F) Visualisation de l'expression du journaliste promoteur Hes1 et journaliste de protéine Dell1 exprimée dans les cellules voisines. (D) La structure du journaliste d'activité promoteur Hes1 (pHes1-Ub-luc) et d'un journaliste protéique Dll1 (Dll1-Luc). (E et F) La cellule positive de l'EGFP transportant le journaliste Hes1 (Cell1) et la cellule positive mCherry transportant le journaliste de protéine Dll1 (Cell2) ont été co-cultivées et la luminescence des deux types de journalistes a été mesurée. L'expression du journaliste de Hes1 dans la cellule verte (cellule1) a semblé commencer environ 60 min après que les deux cellules aient contacté. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Film supplémentaire S1: Visualisation de l'expression du journaliste promoteur Hes1 et journaliste de protéines Dll1 exprimée dans les cellules voisines, liée à la figure 3D-3F. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Les composants de la signalisation Notch montrent des expressions oscillatoires en synchronie pendant la somitogénèse mais hors de synchronie pendant la neurogenèse, conduisant aux difficultés dans la capture de la dynamique d'expression par l'analyse statique dans ce dernier cas. Ainsi, une surveillance en temps réel est nécessaire pour révéler la dynamique d'expression des composants de signalisation Notch, tels que Hes1 et Dll1. Parce que les périodes des expressions des oscillations Hes1 et Dll1 sont extrêmement courtes, environ 2-3 h, une réponse rapide et des journalistes instables sont nécessaires pour surveiller leur dynamique d'expression. À cette fin, nous avons mis au point le système de bioluminescence et d'imagerie. La luciferase du journaliste de bioluminescence montre une cinétique de maturation rapide et une sensibilité élevée pour retracer le roulement rapide de ces expressions de gènes cycliques. Le roulement rapide des journalistes conduit à des signaux très faibles générés. Pour détecter ces signaux faibles produits par les reporters de bioluminescence, nous utilisons un système d'imagerie de bioluminescence optimisé, y compris une haute sensibilité, caméra CCD refroidie à l'eau avec une vitesse de lecture ultra-faible (50 kHz), ce qui réduit le bruit à un minimum. En outre, une lentille objective à ouverture numérique élevée (N.A.) nous permet de recueillir au maximum la lumière libérée par le journaliste de la luciferase déstabilisée. Pour obtenir une sensibilité plus élevée, nous utilisons habituellement un binning plus élevé (p. ex. 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) et nous gardons l'obturateur pour qu'il s'ouvre pendant une longue période (p. ex., 5-20 min). Parce que le signal des journalistes luciferase est extrêmement faible, l'interférence de la lumière de l'environnement présente également un problème dans la détection du signal faible: ainsi, la salle de microscope doit être complètement sombre. Ce système nous permet de mesurer les expressions dynamiques des gènes Hes1 et Dll1 dans les PNJ à la fois dans les niveaux transcriptionnels et protéiques (Figure 3). En outre, nous pouvons visualiser la dynamique protéique de la translocation intracellulaire avec des reporters de protéines fusionnés à la luciférase. En outre, à l'aide du journaliste luciferase réponse rapide, nous pouvons capturer la dynamique de transmission de la signalisation Notch et mesurer le délai de transmission du signal entre deux cellules vivantes (Figure 3D-F et Film supplémentaire S1). De plus, la combinaison du journaliste promoteur (reporter de l'Ub-luciferase) et du reporter protéique (fusion de la luciférase) d'un seul gène nous permet de mesurer le délai entre la transcription et la traduction du gène. De cette façon, l'imagerie multiple de divers types de reporters de luminescence et de journaliste de fluorescence est disponible pour mesurer le délai/taux pour les réactions biochimiques.

La surveillance en temps réel des expressions génétiques à la résolution d'une seule cellule a révélé qu'il existe des variations dans la dynamique d'expression d'un même gène. Certaines cellules expriment Dll1/Neurog2 de manière oscillatoire, mais d'autres montrent des modèles soutenus. En outre, la dynamique d'expression différente (oscillatoire contre stable) induit des sorties différentes dans l'état des cellules. Ce qui semble être clair, c'est que différentes dynamiques d'expression influencent les comportements cellulaires de différentes manières, suggérant que la dynamique d'expression code plus d'informations21,22,26,27,28,29,30,31,32. Les analyses statiques ne peuvent pas capturer la dynamique dans l'expression des gènes, et des analyses en temps réel sont nécessaires pour comprendre les phénomènes biologiques pour révéler la dynamique d'expression dans les événements cellulaires. L'approche que nous introduisons ici peut surveiller la dynamique des oscillateurs ultradiens pendant le développement neuronal à haute résolution temporelle. En utilisant cette méthode, nous avons constaté que beaucoup plus de gènes sont exprimés dynamiquement que nous avions précédemment pensé, et nous pouvons tracer non seulement la dynamique de l'expression des protéines, mais aussi la dynamique de la localisation des protéines dans la cellule à haute résolution temporelle. De tels modèles dynamiques d'expression pourraient avoir des significations biologiques qui doivent encore être élucidées.

Les journalistes de bioluminescence ont un grand avantage dans la résolution temporelle et la faible toxicité aux cellules vivantes comparées aux journalistes de fluorescence33. Cependant, contrairement aux variations de couleur chez les journalistes fluorescents, il n'y a que quelques couleurs chez les journalistes de bioluminescence, imposant une limitation sur le nombre de gènes qui peuvent être surveillés simultanément. Néanmoins, un nombre croissant de luciferase variable sont isolés et clonés à partir de diverses créatures34,35, et en utilisant une telle variété de luciferases, nous serons en mesure de tracer simultanément la dynamique d'expression des gènes multiples dans une seule cellule à haute résolution temporelle. La taille moléculaire de la luciferase luciferase luciferase luciferase luciferase est plus grande que les journalistes de fluorescence, ce qui présente quelques difficultés dans la construction de protéines reporter-fused pour surveiller la dynamique des protéines, mais récemment, une nouvelle luciferase plus petite et plus brillante a été clonée36, ce qui nous permettrait de visualiser la dynamique des protéines plus facile que jamais. Un nombre croissant de rapports ont récemment montré différents types de dynamique dans l'expression des gènes et la translocation des protéines dans divers événements biologiques21,22,26,27,28,29,30,31,32. L'analyse d'une telle dynamique dans la régulation spatiotemporale utilisant un système de surveillance en temps réel serait de plus en plus importante pour capturer les états réels des cellules et révéler la régulation des systèmes cellulaires.

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Disclosures

Les auteurs n'ont pas d'intérêt financier contradictoire.

Acknowledgments

Nous remercions Yumiko Iwamoto d'avoir soutenu la production de la vidéo. Nous sommes également reconnaissants à Akihiro Isomura pour la discussion et le soutien de l'analyse d'image, Hitoshi Miyachi pour les soutiens techniques pour la génération d'animaux transgéniques, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) et Ouin Kunitaki (Andor Japon) pour le soutien technique et les discussions du système d'imagerie de bioluminescence. Ce travail a été soutenu par Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. et MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. et H.S.), et Platform for Dynamic Approaches to Living System du Ministère de l'éducation, de la culture, des sports, des sciences et de la technologie, Japon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house

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References

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Biologie du développement Numéro 154 Imagerie en temps réel Bioluminescence Luciferase Oscillation Signalisation Notch Neurogenèse
Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine
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Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).

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