Summary
פרוטוקול זה מיועד לגילוי משוחדת של חיידקים הקשורים לרקמות ביופסיות החולה על ידי היברידינה של 16 s rrna באתרו הכלאה ו קונפוקלית מיקרוסקופ.
Abstract
ויזואליזציה של האינטראקציה של חיידקים עם משטחים רירית מארח ורקמות יכול לספק תובנה רבת ערך למנגנונים של פתוגנזה. בעוד ויזואליזציה של פתוגנים חיידקיים במודלים של בעלי חיים של זיהום יכול להסתמך על זנים חיידקיים הנדסה לבטא חלבונים פלורסנט כגון GFP, ויזואליזציה של חיידקים בתוך רירית של ביופסיות או רקמות שהתקבלו מחולים אנושיים דורש שיטה לא משוחדת. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה לגילוי של חיידקים הקשורים לרקמות בסעיפים של ביופסיה אנושית. שיטה זו משתמשת פלורסנט באתרו היברידיזציה (דג) עם התווית האוניברסלית בעלת תוויות אוניברסלי olig, בדיקה עבור 16S rRNA לתייג חיידקים הקשורים ברקמות בתוך שלפוחית השתן סעיפים שנרכשו מחולים הסובלים חוזרים ונשנים דלקת בדרכי השתן. באמצעות שימוש של החללית האוניברסלית 16S rRNA, חיידקים ניתן להבחין ללא ידע מראש של מינים, genera, או מאפיינים ביוכימיים, כגון ליפופוליסכד (LPS), כי יהיה צורך בזיהוי על ידי ניסויים מimmunofluorescence. אנו מתארים פרוטוקול מלא עבור הדגים rrna 16s מתוך קיבעון ביופסיה להדמיה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש כמעט כל סוג של רקמה מייצגת כלי רב עוצמה עבור ויזואליזציה משוחדת של אינטראקציות קליניות מארח הרלוונטיות בקטריאלי ברקמת החולה. יתר על כן, שימוש במינים או genera ספציפיים הבדיקות, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לאיתור פתוגנים חיידקיים ספציפיים בתוך רקמת החולה.
Introduction
בדרכי השתן, המורכב של השופכה, שלפוחית השתן, ureters והכליות נחשפים כל הזמן חיידקים המהווים את microbiome השתן, כמו גם פולשים אורופתוגנים, כמו החיידק הפתוגני (upec), ממערכת העיכול 1,2. שכבה של ריר רטוב המורכב של גליקוזנוגליקנים ורובד בלתי מורגש של חלבונים אורוסילנטיים המתבטאת על פני השטח של תאים שטחיים טופס מכשול כי באופן שגרתי מגן על אפיתל שלפוחית השתן מפני פלישה על ידי חסיד חיידקים3,4. במהלך הדלקת בדרכי השתן (בתוך), חסמים אלה הם מופרע או נהרס, הקלה מצורף ופלישה של אפיתל שלפוחית השתן על ידי חיידקים אורוגניים5,6. העבודה במודלים murine חשפה כי חיידקים אורוגניים רבים כולל upec, הדלקת ריאות klebsiella, ו faecalis בידור יכול ליצור קהילות תאיים (ibcs) בתוך הציטופלסמה של תאים שטחיים ו השקטמאגריםתאיים (qirs) בתוך תאים אפיתלהמעבר 7,8,9. למרות UPEC כבר זוהה בתוך לשפוך תאים אפיתל מחולי המין האנושי, האינטראקציה של אורופתוגנים עם רירית שלפוחית השתן בבני אדם לא היה דמיינו בעבר10.
התאמתי טכניקה נפוצה, זריחה היברידיזציה באתרו (דג), כדי לזהות חיידקים בתוך רירית של ביופסיות שלפוחית השתן המתקבל מחולים בגיל המעבר שעברו cystoscopy עם אלקטרופולציה של הטריאוניטיס (CEFT) עבור מתקדם ניהול של הטיפול האנטיביוטי-עמיד בפני אנטיביוטיקה11. באמצעות החללית אוניברסלי עבור 16S rRNA, היינו מסוגלים באופן אובייקטיבי לזהות מינים חיידקיים הקשורים רירית שלפוחית השתן של חולי ארוטי חוזרים ולקבוע את עמדתם בתוך קיר שלפוחית השתן12. החללית האוניברסלית של ה-16S rRNA הבדיקה תוכננה בעבר כדי למקד את האזור שנשמר של rRNA 16 של החיידק, אשר מתאיםלמיקומים 388-355 של E. coli 16S rrna. 16s rrna ו לטרוף רצפי בדיקה אומתו בעבר ופורסם לשימוש במערכת העיכול העכבר14,15. הרצפים והמאפיינים של הגששים מתוארים בטבלה 1. חיוני להשתמש בשני מקטעים רציפים בפרוטוקול זה, אחד עבור בדיקה rRNA 16S ואחד עבור החללית לטרוף, כדי להיות מסוגל להבדיל בין אמת לבין אות הרקע כמו אפיתל שלפוחית השתן, קולגן ואלסטין התערוכה התצוגה autoפלואורסצנטית16 . בפרוטוקול זה, שנות ה -16 והבדיקות האלה עוצבו בעזרת מדבקות הפלורסנט של אלקסה פלואו 488 תוויות הן על 3 ' והן על 5 ' termini באמצעות N-הידרוקסימיד (כיום) להגדיל את אות פלורסנט.
למרות פרוטוקול זה פותחה לשימוש על מקטעים ביופסיה האדם שלפוחית השתן, זה יכול בקלות להיות מותאם לשימוש על פרפין מוטבע סעיפים מכל רקמה שבה חיידקים הם האמינו לשכון. שלא כמו ניסויים אימונוהיסטוכימיה כי היעד אנטיגנים ספציפיים (למשל, ליפופוליסכד) על פני השטח חיידקי, שיטה זו אינה מחייבת כל ידע קודם של אנטיגנים המבוטא על ידי חיידקים הקשורים לרקמות10,17 . השימוש של החללית האוניברסלית 16S rRNA מאפשר זיהוי משוחדת של כל המינים חיידקי בתוך המדגם, אך אינו מאפשר קביעת הזהות שלהם. כדי לקבוע את הזהות של חיידקים שזוהו, מינים או סוג-מסוימים 16 או 23S בדיקה rRNA יש להשתמש. פרוטוקול זה גם לא יזהה פתוגנים פטרייתיים, כגון קנדידה אלביקנס, הקשורים רקמת מארח. לאיתור פתוגנים פטרייתיים, בדיקות rRNA של 28 או 18S חייב להיות בשימוש18.
Protocol
פרוטוקול המחקר אושר על ידי ובעקבות ההנחיות של Biosafety טיחות מוסדית וועדות בטיחות כימית של המרכז הרפואי ut דאלאס ו UT דרום מערב. השימוש בביופסיה מנושאים אנושיים בפרוטוקול זה אושר על-ידי ובעקבות ההנחיות של לוחות הסקירה המוסדית של ה-UT דאלאס והמרכז הרפואי UT דרום-מערב. כל האנשים המעורבים באיסוף ועיבוד ביופסיה יש הגנה על הנושא האנושי הנוכחי (HSP) ואימון היפא.
1. הכנת רקמה לקיבוע ולהטבעת פרפין
הערה: ביופסיות נלקחו מתוך הסכמה של נשים שעברו cystoscopy עם אלקטרו-פולגיציה של טריגוניים לניהול מתקדם של דלקת בדרכי השתן חוזרות ונשנות (רותי). רותי מגדיר כ-3 מוטיס בתקופה של 12 חודשים. ביופסיה באוסף בוצעה בחדר הניתוח בעוד החולה היה תחת הרדמה לאחר קבלת הסכמה המטופל הודיע לכל UTSW IRB פרוטוקול סטו 082010-016. כל הדגימות היו מוצפנות. ומזוהות לפני ניסויים
- להשיג תה קר (~ 1 מ"מ3) ביופסיה מן שלפוחית השתן trigone מלקחיים אורולוגית באמצעות cystoscope גמיש ומקום מיד לתוך סטרילי 2 מ"ל קריובקבוקון המכיל 1.5 ml של 4% v/v פאראפורמלדהיד (בתחתית) הכין ב 1x מלוחים סטרילי מאגור פוספט ...
הערה: ניתן לעשות זאת מראש ולאחסן ב-20 ° c בכיוון החיוג הראשון של הערוץ. - תקן ביופסיה עבור 6 h בטמפרטורת החדר או עבור 16-24 h ב 4 ° c.
הערה: יש לחשב את משך הקיבוע בהתבסס על גודל דגימת הרקמה והקיבעון האוטומטי. זה לא מומלץ להשתמש glutarאלדהיד כקיבעון כפי שהוא מציג פלואורסצנטית אוטומטי. - בתוך מכסה מעוקר או הקבינט אבטחה טיחות, להסיר את התיקונים על ידי ליטוף ולהחליף עם 1.5 mL של הערוץ הסטרילי 1x. לשמור את הדגימות ב 4 ° צ' לילה או מיד לבצע עיבוד רקמות ו פרפין הטבעה19.
- השתמש מיקרוטומה מעוקר כדי בלוקים רקמת מקטע בעובי של 5 יקרומטר ולדבוק במקטעים של רקמת פרפין כדי לטעון שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. מינימום של שתי שקופיות לכל ביופסיה יידרש עבור פרוטוקול הדגים rRNA 16S.
הערה: את רקמת הביופסיה יש לעבור באופן מסודר ביחס למישור החיתוך, כדי להבטיח הדמיה של שכבות urothelial בכל הסעיפים. יש לציין גם כי עובי סעיף צריך להיות אופטימיזציה עבור גילוי הקהילה חיידקים. קטעי דק יותר או דגימה של מקטעים סידוריים מרובים עשויים להידרש במקרה של זיהומים שבהם חיידקים תושב הרקמות נדירים מאוד (למשל, < 1 החיידק תושב לתאים 1,000 היונקים).
2. קרינה פלואורסצנטית באתרו היברידיזציה אוניברסלי 16S rRNA
הערה: יש צורך בשתי שקופיות לכל ביופסיה. שקופית אחת נדרשת עבור הבדיקה rRNA של ה -16 האוניברסלי ושקופית אחת עבור לווין הבקרה עם רצף מעורבל. זה חשוב להבדיל אות אמיתי מאות הרקע במהלך מיקרוסקופ מאז אפיתל שלפוחית השתן היא אוטומטית פלורסנט בערוצים מרובים. בנוסף בדיקה לערבל, חסימת עם 0.1% סודן שחור B לפני ההרכבה עשויה להפחית את הרקע הפנימי הגלום ברקמה20.
- הכנת החומרים הראקטיבים ומנדפים
- נקה מוהל ריק (או ארון בטיחות מצויד כראוי) עם 70% אתנול.
- הכינו את מאגר היברידיזציה המורכבת של 0.9 M נתרן כלוריד (הנאל), 20 מ"מ-HCl (pH 7.2), 0.1% נתרן dodecyl סולפט (SDS) ב 10 מ ל של מים סטרילית-מסוננים.
הערה: ניתן להכין מים נקיים מסוננים על ידי העברת מים מזוקקים אוטוקלבים באמצעות מסנן μM 0.22. מאגר הכלאה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר, אבל SDS עשוי לזרז מהפתרון. אם SDS מזרז, לחמם את הפתרון באמבט מים 50 ° c לפני השימוש. - הכינו לפחות 100 mL כל אחד 95% ו 90% אתנול במים סטרילי-מסוננים שטוף, בקבוקים אוטוקלבים.
- התמוססות באמצעות בדיקה בלתי מסודרת ב-10 מילימטר טריס-HCl (pH 8.0) ו-1 מ"מ מאגר החומצה (למטה) במאגר (TE) הוכן מסנן-עיקור נוקלאז במים חינם לריכוז הסופי של 100 μm. הכן דילול של 1 μM במאגר TE לשימוש בפרוטוקול זה. חנות הן 100 μM מלאי מרוכז ו 1 μM מלאי מחדש בדיקה ב-20 ° c מוגן מפני אור.
הערה: אין לפזר בדים המסומנים באמצעות פלואורוסקופים במים. האגירה נדרשת על מנת למנוע הידרוליזה של איגרת החוב של הח מעלה את הפלואורוופפור לבדיקה של נוקלאוטיד. - נקיון חמש צנצנות Coplin עם 70% אתנול, לאפשר יבש, תווית כדלקמן: קסילן אני, השני, 95% אטוח, 90% אטוח, ddH2O, ולמלא עם 100 mL של הפתרון המתאים. פעולה זו תסייע להימנע מבלבול בשלבים מאוחרים יותר.
- רקמת מבנה והתחדשות
- במכסה המנוע, הצב שתי שקופיות לכל ביופסיה למדף שקופיות אנכי.
- הצב מתלה שקופית אנכית לצנצנת הקוקלין I (המכילה 100 mL של קסילן) במשך 10 דקות.
- הסר את מתלה השקופיות מ-xylenes וכבה את החלק התחתון על מגבת נייר כדי להסיר את העודף. המקום לתוך צנצנת הקופלין השנייה במשך 10 דקות.
הערה: לעולם אל תעבדי עם קסילן. מחוץ למכסה המנוע המורשה - מייבשים חלקים רקמות הרקמה בשטף אתנול רצופים (95% ו 90%) במשך 10 דקות כל אחד בצנצנות קופלין המסומנות בהתאמה.
הערה: במהלך השלב הזה, חם מאגר הכלאה ל50-56 ° c באמבט מים - הסר את מתלה השקופיות משטיפת האתנול של 90%, מחק את החלק התחתון על מגבות נייר כדי להסיר את האתנול העודף, והמקום ב-ddH2o coplin צנצנת המכילה 100 mL של מסנן-העיקור ddh2o עבור 10 דקות.
- בזמן ההמתנה ddH2O לשטוף, לדלל את הבדיקות ל 10 ננומטר במאגר הכלאה כדי ליצור את הפתרון מכתים. הכינו 150 μL של פתרון כתמים לכל שקופית.
הערה: הגנה על פתרון הצביעת מאור על ידי גלישת צינורות ברדיד אלומיניום ואחסון במגירה. כאשר עובדים עם בדיקה פלואורוסקופים על שחקן הספסל, לשקול כיבוי אורות תקורה כאשר מסוגלים. אין להשתמש מחדש בבדיקות מדולולות במאגר הכלאה.
- היברידיזציה וצביעת נגד
- הכינו חדר מחולל לחות עבור כל בדיקה על ידי הצבת שספוגה, מקומטת Kimwipe מים סטרילי למאגר של תיבת P1000 tip. הצב את מחסנית מחזיק הקצה על-גבי-זה המקום שבו השקופיות יהיו מיושבות.
הערה: חשוב להשתמש בחדר מחולל לחות כדי למנוע מקטעי ביופסיה מייבוש במהלך הכלאה. יש לציין כי תאי האדים הזמינים באופן מסחרי מיועדים לשמור על אווירה יציבה ולחה. עם זאת, את הטכניקה המפורטת כאן מספיק שולטת לחות בעלות פחות משמעותית. - הסר את השקופיות מארון התקשורת של השקופיות ומקם על מגבת נייר טרייה (בצד הרקמה כלפי מעלה). השתמש ב-Kimwipe כדי לייבש את השקופית. היזהרו רק לטפוח בעדינות ליד (לא על) בסעיף ביופסיה כדי הפתיל המים משם. שימוש בעט הידרופובי, לצייר גבול סביב סעיף ביופסיה ולמקם את החלק רקמת השקופית למעלה בחדר מחולל לחות.
הערה: עבוד במהירות כדי שרקמות לא יתייבש לפני הכלאה. - מניחים את החדר מחולל לחות לתוך חממה שנקבעה 50 ° c. פיפטה 50-150 μL של הפתרון מכתים ישירות על גבי הרקמה כך המלבן שנעשו על ידי הגבול הידרופובי סביב הרקמה הוא מלא. היזהרו לא להוסיף פתרון יותר מדי כדי לגלוש על גבול הידרופובי. סגור את התיבה בעדינות.
- דגירה לילה (~ 16 h) ב 50 ° c בחושך. אם החממה יש חלון, לכסות אותו עם רדיד אלומיניום כדי ליצור סביבה כהה.
הערה: טמפרטורת הכלאה מתחת לטמפרטורת ההיתוך של בדיקה הדג נדרש עבור אות אמין. 50 ° c היא הטמפרטורה האופטימלית עבור החללית האוניברסלית של 16S rRNA אבל לא יכול להיות אופטימלי לבדיקות אחרות. - למחרת בבוקר, להכין לפחות 500 mL של מאגר לשטוף מורכב 0.9 M הנאל, 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.2) ב ddH2O ו-מסנן-לחטא לתוך בקבוק סטרילי עם מסנן בקבוק ואקום-top. חם עד 50-56 ° c באמבט מים.
- הסירו את השקופיות מתאי החות והפתיל היטב הוציאו את כל הפתרונות ההיברידיזציה שנותרו באמצעות קימנגב. הצב את השקופיות במדף מכתים אנכי.
- מניחים את המתלה לצביעת לצנצנת Coplin אטומה המכילה 100 mL של מאגר מראש מחומם לשטוף עבור 10 דקות. אם הצנצנות קופלין אינן אטומות (כגון זכוכית), מניחים אותן בחשכה במהלך צעדי דגירה-אולי מתחת לקופסא או במגירה.
- חזור על שלב השטיפה פעמיים עם מאגר כביסה טרי בצנצנות Coplin החדשה.
- במהלך השלבים לשטוף, להכין את הכתם על ידי לדלל a 100 μg/mL פתרון מניות של הואכסט 33342 1:1000 במאגר לשטוף. לאותה צינורית, הוסף את אלקסה-555 נבט החיטה (WGA) לריכוז הסופי של 5μg/mL ו אלקסה-555 Phalloidin לריכוז הסופי של 33 nM. אחסן בחשכה עד שהוא מוכן לשימוש.
הערה: Hoechst, אלקסה-555 WGA, ו אלקסה-555 Phalloidin תווית DNA, mucin/אורופלקינס, ו actin, בהתאמה יכול להיות מאוחסן לטווח ארוך בחושך להוראות של היצרן. תוויות פלורסנט המשמשות לבדיקות וכתמי נגד יכולות להיות מותאמות אישית עבור ערכות הסינון הזמינות לשימוש במיקרוסקופ. - הסר את השקופיות מהשטיפה האחרונה והפתיל העדין הרחק את מאגר הכביסה העודף באמצעות קיניניגוב. מניחים את רקמת השקופיות בצד על מגבת נייר ולהוסיף 50-150 μL של כתם הנגד ישירות על גבי הרקמה כך הגבול הידרופובי מתמלא, אבל לא מוצפת. לכסות עד ארבע שקופיות עם קריובוקס-העליון ו דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הצדדים בחזרה לתוך המתלה להכתים ולשטוף פעמיים יותר בצנצנות Coplin עם מאגר לשטוף טרי, עבור 10 דקות כל אחד.
- יבש ביסודיות את השקופיות לאחר השטיפה האחרונה ומניחים את הרקמה בצד על מגבת נייר מתחת לחלק העליון של הקריובוקס. לסחוט טיפה אחת של המדיה הרכבה ישירות על גבי הרקמה. בעדינות למקם coverslip בגודל כראוי (יהיה תלוי בגודל ביופסיה) על גבי. בעדינות ללחוץ על כל בועות כפי שהם יפריעו הדמיה ולאפשר את המכסה מחליק שקופיות לרפא לילה בחושך.
- למחרת, לאטום את קצות שמיכות לשקופית עם מעיל קל של לק ברור מסמר. אפשר להתייבש 10 דקות בחשיכה ולאחר מכן לאחסן בחשכה ב -4 ° c לצורך המיקרוסקופיה.
- הכינו חדר מחולל לחות עבור כל בדיקה על ידי הצבת שספוגה, מקומטת Kimwipe מים סטרילי למאגר של תיבת P1000 tip. הצב את מחסנית מחזיק הקצה על-גבי-זה המקום שבו השקופיות יהיו מיושבות.
3. הדמיה של דגי הרנינה 16S על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית
הערה: עבור פרוטוקול זה, התוצאות הטובות ביותר מושגת עם מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד לייזר עם מטרות 63 x ו 100x. מערכות סינון נאות עבור ויזואליזציה של הואכסט, אלקסה-488, ו אלקסה-555 זריחה נדרשים. עם זאת, ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלורסנט סטנדרטי במידה ומיקרוסקופ קונמוקד אינו זמין. הפרוטוקול הזה מיועד לסריקת. לייזר במיקרוסקופ מוקד
- הפעל את מיקרוסקופ הקונמוקד ואת תוכנת המחשב המשויכת למיקרוסקופ לכל הוראות היצרן.
- טען את השקופית והמחש במטרה 10x בערוץ הכחול (DAPI/Hoechst). התמקד בזהירות עד שגרעיני הגרעין יהיו גלויים.
- לאחר ההתמקדות, לשנות את המטרה להגדלה גבוהה (63 x או 100x). הוסף שמן על גבי שובר הכיסוי. מיקוד עם המטרה החדשה, וודא כי העדשה האובייקטיבית מגיע במגע עם הנפט תוך כדי התמקדות.
הערה: השתמש רק מיקוד בהגדלה גבוהה (63 x או 100x). שמן צריך לשמש רק למטרת נפט. - העריכו במהירות כל שקופית באמצעות קטע העין בערוץ הירוק (eGFP/אלקסה-488) כדי לקבוע אילו שקופיות הם הדגים חיוביים ושהם דגים שליליים.
הערה: מומלץ אם הערכה הראשונית/הניקוד הראשוני מתבצע עיוור על ידי אדם נפרד כדי להפחית את ההטיה הניסיונית. - כדי לדמות את הביופסיה המוכתמת, התחל בשקופית חיובית של הדג ועבור למצב הדמיה של המחשב. בחר את 405 (Hoechst), 488 (אלקסה-488), 555 (אלקסה-555) ערוצים. להגדיר את החור באמצעות ערוץ אורך הגל הארוך ביותר, במקרה זה 555. מצא את המטוס המוקד הנכון עבור ויזואליזציה של חיידקים שכותרתו בערוץ 488. מבלי לשנות את המישור המוקד, לקבוע את הרווח, כוח לייזר והיסט עבור כל ערוץ, כך שהאות אינו רווי, והרקע אינו מתוקן. לרכוש את התמונה בכל שלושת הערוצים.
הערה: השתמש באותן הגדרות עבור ערוץ 488 כדי לדמות כל שקופית בניסוי. כוח הלייזר עשוי לדרוש התאמה 405 ו 555 ערוצים אם המטוס המוקד האופטימלי עבור הדמיה בקטריאלי שינויים בין שדות. - חזור על שדות נוספים עד לרכישת תמונות של משטח האפיתל כולו.
הערה: ייתכן שיהיה עליך לשנות את המישור המוקד מעט כדי להמחיש חיידקים שכותרתו בתחומים שונים, אבל לעולם לא לשנות את הרווח, כוח לייזר או היסט עבור 488 ערוץ בין שדות. אם עובד על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, זה עשוי להיות אינפורמטיבי כדי ללכוד Z-מחסנית כך הלוקליזציה תלת מימדי של החיידקים בתוך הרקמה עשוי להיות מנותח. - עיבוד תמונות וככמת המסומנים חיידקים בתוך או הקשורים ברקמה באמצעות ImageJ או תוכנה דומה. עיבוד מינימלי של התמונות מומלץ (למשל, פיצול/מיזוג ערוצים והמרה לתוך קבצי תמונה), למרות תיקון רקע ניתן לבצע במידת הצורך. כל התיקונים או שינויים אחרים צריכים להישאר עקביים בין התמונות.
Representative Results
הפרוטוקול כבר אופטימיזציה עבור זיהוי משוחדת של חיידקים הקשורים רירית שלפוחית השתן ב פרפין-שלפוחית השתן מוטבע סעיפים ביופסיה. איור 1 מציג מיקרוגרפים מייצגים נציג מתוך ניסוי באמצעות פרוטוקול זה על סעיפים של ביופסיות שלפוחית השתן שהתקבלו מנשים עם דלקת בדרכי השתן חוזרות ונשנות. שני מקטעים סידוריים ההוכלא עם rRNA האוניברסלי 16S (לוחות העליון) או לטרוף (לוחות התחתון) בבדיקות. תמונות מאותו אזור של הרקמה נלקחו חיידקים (ירוק) הם גלויים בבירור הוכלא הרקמה עם הבדיקות rRNA של 16 ולא עם הלווין לטרוף. איור 2 מייצג תוצאה חיובית כוזבת. האות המתאים קולגן פלורסנט או אלסטין מזוהה ב 405 ו 488 ערוצים ב-16S rRNA ו לטרוף בדיקה הוכלא סעיפים ביופסיה המדגיש את החשיבות של תמיד באמצעות בקרת לערבל לטרוף.
| דיקה | רצף | Tm | פלואור | צמדה |
| מיקום | 5 '-כמוסות קטקק GTAGGAGT-3 ' |
54.9 | אלקסה-488 (5 ' ו-3 ') | בינה לבין |
| לטרוף | 5 '-שטטקג'ה גגנג -3 |
נה | אלקסה-488 (5 ' ו-3 ') | בינה לבין |
שולחן 1: רצפי דגים בדיקה ומאפיינים. Tm מעיד על טמפרטורת ההיתוך והוא קיצור של N-הידרוקסינימיד.
איור 1: מיקרוגרפים מייצגים של דג של יוניברסל 16 s rRNA ולטרוף לבדוק את שלפוחית השתן האנושית ביופסיה. Actin ו Mucin מסומנים באדום, גרעיני הסלולר מסומנים בכחול, חיידקים בירוק. רקמות הקשורות חיידקים מזוהים רק עם בדיקה 16SrRNA ולא לטרוף. תמונות שצולמו בהגדלה של 63 x. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרוגרפים מייצגים של הנציג של מיקרו-מיקוד אוטומטי ירוק שווא ביופסיה של שלפוחית השתן האנושית. Actin ו ריריות מסומנים באדום, גרעיני הסלולר מסומנים בכחול, חיידקים ורכיבים פלורסנט אוטומטית של מטריצה המתכלים (למשל, קולגן ואלסטין) הם ירוקים. הזריחה הירוקה נצפתה עם rRNA 16S ו לטרוף בדיקה המציינת תוצאה שווא-חיובי. תמונות נלקחים בהגדלה של 63 x. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי של חיידקים הקשורים לרקמות ביופסיה של שלפוחית השתן האנושית על ידי ה -16 rRNA FlSH. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות עבור ביופסיות נלקח מרקמות אחרות, כגון מערכת העיכול או העור, ניתן להרחיב את הרקמות שנקטפו ממגוון של אורגניזמים מודל היונקים. הפרוטוקול המתואר כאן יכול גם להיות מותאם לשימוש של קיבעון מרובים (למשל, פורמאלין, אתנול, methacarn) וטכניקות הכנה לרקמות (למשל, פרפין או שרף מוטבע, ו הקפאה רקמות). הבדיקה כפולה אוניברסלי 16s rrna מאפשר זיהוי משוחדת של כל המינים חיידקי נוכח בתוך הרקמה והוא יכול לספק תובנה רבת ערך כיצד פתוגנים ואינטראקציה microbiota מיקרו עם משטחים רירית במחלות ובריאים ארצות. באמצעות משאבים כגון probeBase, PhylOPDb או הכלי PROBE_DESIGN של חבילת התוכנה ARB לבחירה או עיצוב של מינים או כללי-מסוימים 16S או 23S בדיקות rRNA, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לאיתור מינים חיידקיים ספציפיים או כללי . בתוך רקמה15,21,22 הכיוון העתידי החשוב עבור שיטה זו הוא ריבוב באמצעות מינים-או genera-בדיקה ספציפיים המסומנים עם fluorophores שונים, דיסקרטית להערכת הגיוון של חיידקים בתוך רירית שלפוחית השתן.
המגבלה העיקרית של שיטה זו לשימוש בדגימות אדם היא הזמינות של רקמת הביוביופסיה. המועצה סקירה מוסדית אישור הסכמה המטופל הודיע נדרשים כדי לקבל ביופסיות ושיתוף פעולה ישיר עם המרפאה לבצע את ההליך הוא הכרחי איסוף מדגם אופטימלי וגישה למטא-נתונים של המטופל. הליך CEFT עצמה הורסת את אפיתל שלפוחית השתן כך היינו מסוגלים להצדיק ביופסיה של אזורים אלה לפני ההליך. מכסה המנוע או ארון בטיחות מצויד כראוי נדרש עבור פרוטוקול זה בשל השימוש בגרד רעיל בשלב החוצה והצורך לשמור על סביבה סטרילית במהלך ההליך. מיקרוסקופ פלורסנט, רצוי confocal וקד, עם 63 x או מטרה 100x וסטים מסנן המתאים עבור ויזואליזציה של Hoechst, אלקסה-555, ו אלקסה-488 נדרש עבור פרוטוקול זה. תוצאות הנציגים המתוארים באיור 1 היו מתוארות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד של סריקת לייזר. לייזר דומה סריקת מיקרוסקופים צריך לייצר תמונות דומות. פרוטוקול זה מוגבל על ידי יכולתו לזהות רק חיידקים הקשורים לרקמות ולא, למשל, פטריות. בדיקה מסוימת של הפטרייה 18 או של 28 rRNA יש להשתמש כדי לזהות פתוגנים פטרייתיים בתוך רקמות18.
צעדים קריטיים לפרוטוקול זה כוללים שמירה על סביבה סטרילית במהלך ההליך ולהבטיח כי הרקמה לא להתייבש בין הכלאה לבין שלבים הצביעת. אם הרקמה מתייבש במהלך ההליך, האות עשוי להיות לחוץ או הרקמה עלולה ליפול מהשקופית במהלך צעד לשטוף. זה גם קריטי להשתמש תמיד שני מקטעים סידוריים עבור פרוטוקול זה — אחד עבור בדיקה rRNA 16S ואחד עבור לווין לערבל. ללא שליטה זו, ייתכן שיהיה קשה מאוד להבחין בתוצאות חיוביות שגויות והנתונים שהושגו עשויים שלא להיות שימושיים או אינפורמטיביים. אם פרוטוקול זה מותאם לשימוש עם בדיקה אחרת מאשר החללית האוניברסלית 16S rRNA, הטיפול חייב להילקח כדי לבחור את טמפרטורת הכלאה המתאימה, כ 5 ° c נמוך יותר מאשר טמפרטורת ההיתוך החזוי של הגשוש. כדי לשמור על עוצמת האות, אין לחשוף את הרקמה לאור לפרקי זמן ארוכים לאחר הבדיקה שנוספה ואין לחשוף אותם במהלך המיקרוסקופיה. לבסוף, במהלך מיקרוסקופ את אותן הגדרות עבור הערוץ המתאים fluorophore מצופהים לתוך בדיקה הדג חייב להיות מוחזק עקבי בין ניסיוני (הבדיקה rRNA של 16) ושליטה (לטרוף בדיקה) שקופיות. המחשה של מערכת היחסים המרחבית של חיידקים בתוך משטחי רירית של רקמות המטופל נגזר הוא קריטי להבנת ובניית השערות הרלוונטיות קלינית על אינטראקציות מארח הפתוגן בבסיס מחלה זיהומית.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנחנו רוצים להודות לקים אורth ומרסלה דה סוזה סנטוס לעצת הפרוטוקול ולאמנדה אריוט לתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי ססיל H. ו אידה גרין כיסא במדעי הביולוגיה של מערכות שנערך על ידי K.P..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
