Summary
Bu protokol, hasta biyopsilerinde doku ilişkili bakterilerin situ hibridizasyon ve konfokal mikroskopide 16S rRNA ile tarafsız olarak saptanması içindir.
Abstract
Bakterilerin konak mukozal yüzeyler ve dokularla etkileşiminin görselleştirilmesi patogenez mekanizmalarına değerli bir bakış açısı sağlayabilir. Bakteriyel patojenlerin hayvansal enfeksiyon modellerinde görselleştirilmesi GFP gibi floresan proteinleri ifade etmek için tasarlanmış bakteriyel suşlara dayanabilirken, insan hastalardan elde edilen biyopsi veya doku mukozası içinde bakterilerin görüntülenmesi tarafsız bir yöntemdir. Burada, insan biyopsisi bölümlerinde doku ile ilişkili bakterilerin tespiti için etkili bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, tekrarlayan hastalardan edinilen mesane biyopsisi bölümlerinde doku ile ilişkili bakterileri etiketlemek için 16S rRNA için floresan etiketli evrensel oligonükleotid probu ile situ hibridizasyonda (FISH) floresan kullanır idrar yolu enfeksiyonu. Evrensel bir 16S rRNA probu kullanımı sayesinde, bakteriler, immünororesans deneyleri ile tespit edilmesi gereken lipopolisakkarit (LPS) gibi türler, cinsler veya biyokimyasal özellikler hakkında önceden bilgi sahibi olmadan tespit edilebilir. Biyopsi fiksasyonundan konfokal mikroskopi ile görüntülemeye kadar 16S rRNA FISH için tam bir protokol tanımladık. Bu protokol hemen hemen her doku türünde kullanılmak üzere uyarlanabilir ve hasta dokusunda klinik olarak ilgili bakteriyel konak etkileşimlerinin tarafsız görselleştirme için güçlü bir araç temsil eder. Ayrıca, türler veya cinslere özgü problar kullanılarak, bu protokol hasta dokusu içinde belirli bakteriyel patojenlerin tespiti için uyarlanabilir.
Introduction
Üretra, mesane, üreter ve böbreklerden oluşan idrar yolu, üropatojenik E. coli (UPEC) gibi üropatojenik e. coli (UPEC) gibi üropatojenleri oluşturan bakterilere ve üropatojenik sistemden sürekli olarak maruz kalmaktadır. 1,2. Glikozaminoglikanlardan oluşan sulu mukus tabakası ve yüzeysel hücrelerin yüzeyinde ifade edilen glikozile üroplakin proteinlerinden oluşan geçirimsiz bir plak, mesane epitelyumunu yapışıklık tan arınmış olarak rutin olarak koruyan bir bariyer oluşturur. bakteri3,4. İdrar yolu enfeksiyonu (İYE) sırasında, bu bariyerler bozulur veya yok edilir, idrar patojenik bakteriler tarafından mesane epitelinin bağlanmasını ve invazyonunukolaylaştırır. Murine modellerinde yapılan çalışmalar, UPEC, Klebsiella pneumoniaeve Enterococcus faecalis gibi birçok üropatojenik bakterinin yüzeysel hücrelerin sitoplazması içinde replastik hücre içi topluluklar (IbCs) oluşturabileceğini ve geçiş epitel hücreleri içinde quiescent hücre içi rezervuarlar (QIRs)7,8,9. UPEC insan İye hastalarından dökülen epitel hücreleri içinde tespit edilmiş olmasına rağmen, insanlarda mesane mukozası ile üropatojenlerin etkileşimi daha önce görselleştirilmiş olmamıştı10.
İleri düzey trigonoz (CEFT) elektrofulgurasyonu ile sistoskopi uygulanan postmenopozal hastalardan alınan mesane biyopsilerinin mukozasında ki bakterileri tespit etmek için situ hibridizasyonda (FISH) floresans( antibiyotik refrakter tekrarlayan UTI11yönetimi . 16S rRNA için evrensel bir prob kullanarak, tekrarlayan İye hastalarının mesane mukozası ile ilişkili bakteri türlerini objektif olarak tespit edebildik ve mesane duvarı içindeki konumlarını belirledik12. Evrensel 16S rRNA nükleotit probu daha önce e. coli 16s rRNA pozisyonları 388-355 karşılık gelen bakteriyel 16S rRNA13korunmuş bir bölge hedef için tasarlanmıştır. 16S rRNA ve scramble prob dizileri daha önce doğrulanmış ve fare gastrointestinal sistem 14 ,15kullanılmak üzere yayınlanmıştır. Sondaların dizileri ve özellikleri Tablo 1'deaçıklanmıştır. Bu protokolde biri 16S rRNA sondası için diğeri de karıştırma sondası için olmak üzere iki sıralı bölüm kullanmak, gerçek ve arka plan sinyalini mesane epiteli, kollajen ve elastin otofloresans 16 olarak ayırt edebilmek için gereklidir. . Bu protokolde, 16S rRNA ve scramble probları floresan sinyali artırmak için N-hidroksisuccinimid (NHS) ester bağlantıları ile hem 3' hem de 5' termini floresan Alexa Fluor 488 etiketleri ile tasarlanmıştır.
Bu protokol insan mesane biyopsisi bölümlerinde kullanılmak üzere geliştirilmiş olmasına rağmen, bakterilerin yaşadığına inanılan herhangi bir dokudan parafin gömülü bölümlerde kullanılmak üzere kolayca adapte edilebilir. Bakteriyel yüzeyde spesifik antijenleri (örn. lipopoliskarit) hedef alan immünohistokimya deneylerinden farklı olarak, bu yöntem dokuyla ilişkili bakteriler tarafından ifade edilen antijenler hakkında önceden bilgi gerektirmez10,17 . Evrensel 16S rRNA sondasının kullanılması, numunedeki tüm bakteri türlerinin tarafsız bir şekilde tespit edilmesine olanak sağlar, ancak kimliklerinin belirlenmesine izin vermez. Tespit edilen bakterilerin tanımlanması için türler veya cinse özgü 16S veya 23S rRNA probları kullanılmalıdır. Bu protokol aynı zamanda candida albicansgibi mantar patojenleri tespit olmaz , konak doku ile ilişkili. Mantar patojenlerinin tespiti için 28S veya 18S rRNA probları18kullanılmalıdır.
Protocol
Çalışma protokolü ut Dallas ve UT Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Biyogüvenlik ve Kimyasal Güvenlik Komiteleri tarafından onaylandı ve yönergeleri izledi. Bu protokolde insan deneklerin biyopsi kullanımı UT Dallas ve UT Southwestern Tıp Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylandı ve yönergeleri izledi. Biyopsi toplama ve işleme ile ilgili tüm bireyler mevcut insan konu koruma (HSP) ve HIPPA eğitimi var.
1. Fiksasyon ve Parafin Katıştırma için Doku Hazırlama
NOT: Tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonunun (rUTI) ileri tedavisi için trigonitin elektro fulgurasyonu ile sistoskopi uygulanan rıza gösteren kadınlardan biyopsi alındı. rUTI, 12 aylık dönemde 3 İye olarak tanımlanır. UTSW IRB protokolü STU 082010-016 uyarınca hasta onayı alındıktan sonra ameliyathanede biyopsi yapıldı. Tüm örnekler denemeden önce kodlanmış ve tanımdan arındırılmış.
- Esnek sistoskop ile ürolojik forsepslerle mesane trigone'den soğuk bardak (~1 mm3)biyopsi alın ve 1x steril fosfat tamponlu salinde hazırlanan 1,5 mL v/v paraformaldehit (PFA) içeren steril 2 mL cryovial'a hemen yerleştirin (PBS).
NOT: 1x PBS'de %4 PFA önceden yapılabilir ve -20 °C'de ihtiyaç duyulana kadar saklanabilir. - Biyopsiyi oda sıcaklığında 6 saat veya 4 °C'de 16-24 saat için düzeltin.
NOT: Fiksasyon süresi doku örneğinin büyüklüğüne göre hesaplanmalı ve aşırı fiksasyondan kaçınılmalıdır. Otofloresans ı sayılsa da glutaraldehit infiksolarak kullanılması tavsiye edilmez. - Sterilize edilmiş bir başlık veya biyogüvenlik kabininde, pipetleme ile fiksatifi çıkarın ve 1,5 mL steril 1x PBS ile değiştirin. Örnekleri bir gecede 4 °C'de tutun veya hemen doku işleme ve parafin gömme19gerçekleştirin.
- Sterilize edilmiş bir mikrotomu kullanarak doku bloklarını 5 μm kalınlığında kesebilir ve parafin doku kesitlerini yüklü cam mikroskop slaytlarına yapıştırın. 16S rRNA FISH protokolü için biyopsi başına en az iki slayt gerekecektir.
NOT: Biyopsi dokusu, tüm bölümlerdeki ürotelyal tabakaların görselleştirilmesini sağlamak için kesme düzlemine göre kesitsel olarak düzenlenmelidir. Ayrıca kesit kalınlığı bakteri topluluk tespiti için optimize edilmelidir unutulmamalıdır. Dokuda yerleşik bakterilerin son derece az olduğu enfeksiyonlarda (örneğin, 1.000 memeli hücresi başına doku yayan bakteri) daha ince kesitler veya birden fazla seri bölüm den örnekleme gerekebilir.
2. Evrensel 16S rRNA Probları ile Situ Hibridizasyon floresan
NOT: Biyopsi başına iki slayt gereklidir. Evrensel 16S rRNA sondası için bir slayt ve şifreli bir sırayla bir kontrol sondası için bir slayt gereklidir. Mesane epiteli birden fazla kanalda otomatik floresan olduğundan bu, mikroskopi sırasında arka plan sinyalinden gerçek sinyali ayırt etmek için önemlidir. Scramble probu ek olarak, montaj önce% 0.1 Sudan Black B ile engelleme doku20doğasında arka plan otofloresans azaltabilir.
- Reaktif ve duman kaputunun hazırlanması
- Boş bir duman kaputunu (veya uygun şekilde donatılmış biyogüvenlik kabinini) %70 etanolle temizleyin.
- 0,9 M sodyum klorür (NaCl), 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), %0,1 sodyum dodecil sülfat (SDS) içeren hibridizasyon tamponunu 10 mL steril filtreli suda hazırlayın.
NOT: Steril filtrelenmiş su, otoklavlı distile suyun 0,22 μM'lik bir filtreden geçirilerek hazırlanabilir. Melezleme arabelleği oda sıcaklığında depolanabilir, ancak SDS çözeltiden çökelebilir. SDS çökelti ederse, çözeltiyi kullanmadan önce 50 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. - Yıkanmış, otoklavlı şişelerde steril filtreli suda en az 100 mL%95 ve %90 etanol hazırlayın.
- Filtre sterilize edilmiş çekirdeksiz suda hazırlanan 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 mM ethylenediamminetetraacetic asit (EDTA) tamponunda (TE) floresan etiketli lyophilized probları 100 μM'lik son konsantrasyona kadar çözün. Bu protokolde kullanılmak üzere TE arabelleğinde 1 μM'lik bir seyreltme hazırlayın. 100 μM konsantre stoku ve 1 μM stok yeniden oluşturduğunuz probları -20 °C ışıktan korunan olarak saklayın.
NOT: Floresan etiketli probları suda çözünme. Tamponlama, floroforu nükleotit sondasına konjuge eden NHS ester bağının hidrolizini önlemek için gereklidir. - Beş Coplin kavanozu %70 etanol ile temizleyin, kurumaya izin verin, aşağıdaki gibi etiketleyin: ksilenes I, ksilenes II, %95 EtOH, %90 EtOH, ddH2O ve uygun çözeltinin 100 mL'si ile doldurun. Bu, daha sonraki adımlarda karışıklığı önlemeye yardımcı olacaktır.
- Doku de-parafinizasyon ve rehidrasyon
- Kaputun içine biyopsi başına iki slayt dikey bir slayt rafına yerleştirin.
- 10 dakika boyunca xylenes I Coplin kavanozuna (100 mL ksilenes içeren) dikey bir slayt rafı yerleştirin.
- Slayt rafını Xylenes I'den çıkarın ve fazla ksileni gidermek için bir kağıt havlunun altını lekeleyin. 10 dakika ksylenes II Coplin kavanoziçine yerleştirin.
NOT: Sertifikalı bir duman kaputunun dışında ksilenes ile çalışmak asla. - Ardışık etanol yıkarlarda rehidrat deparafinize doku kesitleri (%95 ve %90) 10 dakika her biri için sırasıyla etiketli Coplin kavanoz.
NOT: Bu aşamada, sıcak Hibridizasyon Tampon 50-56 °C bir su banyosu - Slayt rafını %90 etanol yıkamadan çıkarın, fazla etanol çıkarmak için kağıt havluların altını kapatın ve 10 0 0 mL filtre steril ddH2O içeren ddH2O Coplin kavanozuna yerleştirin.
- ddH2O yıkama beklerken, boyama çözeltisi oluşturmak için hibridizasyon tamponunda probları 10 nM'ye seyreltin. Slayt başına 150 μL boyama çözeltisi hazırlayın.
NOT: Boruları alüminyum folyoya sararak ve çekmecede saklayarak boyama çözeltisini ışıktan koruyun. Tezgah üzerinde floresan etiketli problarla çalışırken, mümkün olduğunda havai ışıkları kapatmayı düşünün. Hibridizasyon tamponunda seyreltilmiş problar yeniden kullanılmamalıdır.
- Hibridizasyon ve karşı boyama
- Bir P1000 ucu kutusunun rezervuarına ıslatılmış, buruşmuş Kimwipe ve steril su yerleştirerek her sonda için bir nemlendirici hazne hazırlayın. Uç tutucu kartuşunu üste yerleştirin - slaytlar burada oturacaktır.
NOT: Hibritizasyon sırasında biyopsi bölümlerinin kurumasını önlemek için nemlendirici hazne kullanmak önemlidir. Bu ticari olarak kullanılabilir nemlendirici odaları istikrarlı, nemli bir atmosfer korumak için tasarlanmıştır unutulmamalıdır. Ancak, burada ayrıntılı teknik yeterince önemli ölçüde daha az maliyetle nem kontrol eder. - Slaytları kaydırakrafından çıkarın ve taze bir kağıt havluya (doku tarafı yukarı) yerleştirin. Slaytı kurutmak için Kimwipe kullanın. Sadece hafifçe yakın dab dikkatli olun (üzerinde değil) su wick biyopsi bölümü. Hidrofobik kalem kullanarak, biyopsi bölümünün etrafına bir kenarlık çizin ve slayt dokusunu nemlendirme odasına yerleştirin.
NOT: Dokuların hibridizasyondan önce kuruması için hızlı çalışın. - Nemlendirme odasını 50 °C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin. Pipet 50-150 μL boyama çözeltisi doğrudan dokunun üstüne böylece doku etrafında hidrofobik sınır tarafından yapılan dikdörtgen doldurulur. Hidrofobik sınır taşma olarak çok fazla çözüm eklemek için dikkatli olun. Kutuyu nazikçe kapatın.
- Karanlıkta 50 °C'de bir gecede (~16 saat) kuluçkaya yat. Kuvözbir pencere varsa, karanlık bir ortam yaratmak için alüminyum folyo ile kaplayın.
NOT: Güvenilir sinyal için FISH sondasının erime sıcaklığının altında bir hibridizasyon sıcaklığı gereklidir. 50 °C, evrensel 16S rRNA probu için en uygun sıcaklıktır ancak diğer problar için uygun olmayabilir. - Ertesi sabah, ddH2O'da 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) içeren en az 500 mL Yıkama tamponu hazırlayın ve vakum şişesi üst filtreli steril bir şişeye filtre uygulayın. Bir su banyosunda 50-56 °C'ye kadar ılık.
- Slaytları nemlendirici bölmelerden çıkarın ve kalan hibridizasyon çözümlerini Kimwipe ile dikkatlice aşındırın. Slaytları dikey boyama rafına yerleştirin.
- Boyama rafını 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış Yıkama tamponu 100 mL içeren opak bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Coplin kavanozları opak değilse (örn. cam), kuluçka adımları sırasında karanlıkta yerleştirin - belki bir kutunun altına veya çekmeceye.
- Yeni Coplin kavanozlarında taze Yıkama tamponu ile yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
- Yıkama adımları sırasında, Hoechst 33342 1:1.000 yıkama tamponundaki 100 μg/mL stok çözeltisini seyrelterek karşı lekeyi hazırlayın. Aynı tüp için, Alexa-555 buğday mikrobu agglutinin ekleyin (WGA) 5μg/mL ve Alexa-555 Phalloidin son konsantrasyon33 nM son konsantrasyona. Kullanıma hazır olana kadar karanlıkta saklayın.
NOT: Hoechst, Alexa-555 WGA ve Alexa-555 Phalloidin etiket DNA, müsin / üroplakinler, ve aktin, sırasıyla ve üreticinin talimatları başına karanlıkta uzun vadeli saklanabilir. Problar ve karşı lekeler için kullanılan floresan etiketler, mikroskobun kullanılabilen filtre setleri için özelleştirilebilir. - Slaytları son yıkamadan çıkarın ve aşırı yıkama tamponunu Kimwipe ile hafifçe uzaklayın. Bir kağıt havlu üzerine slaytlar doku tarafı yerleştirin ve hidrofobik sınır dolu, ancak taşan değil, böylece doğrudan doku üstüne karşı leke 50-150 μL ekleyin. Dört slaytı bir kriyobox-top ile kapatın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Yanları boyama rafına geri yerleştirin ve coplin kavanozlarında her biri 10 dakika boyunca taze Yıkama tamponuyla iki kez daha yıkayın.
- Son yıkamadan sonra slaytları iyice kurutun ve doku tarafını bir kağıt havlunun üzerine kriyobox-top un altına yerleştirin. Bir damla montaj ortamını doğrudan dokunun üzerine sıkıştırın. Yavaşça üzerine uygun büyüklükte bir kapak fişi (biyopsi boyutuna bağlı olacaktır) yerleştirin. Görüntülemeyi engelleyecek ve kapak kayması olan slaytların karanlıkta bir gecede tedavi etmesini sağlayacak şekilde kabarcıkları hafifçe bastırın.
- Ertesi gün, açık oje hafif bir kat ile slayt için coverslip kenarları mühür. Karanlıkta 10 dakika kurumaya bırakın ve konfokal mikroskopi için 4 °C'de karanlıkta saklayın.
- Bir P1000 ucu kutusunun rezervuarına ıslatılmış, buruşmuş Kimwipe ve steril su yerleştirerek her sonda için bir nemlendirici hazne hazırlayın. Uç tutucu kartuşunu üste yerleştirin - slaytlar burada oturacaktır.
3. Konfokal Mikroskopi ile 16S rRNA FISH Görselleştirilmesi
NOT: Bu protokol için en iyi sonuçlar 63x ve 100x hedefli lazer taramalı konfokal mikroskop ile elde edilir. Hoechst, Alexa-488 ve Alexa-555 floresan görselleştirme için uygun filtre setleri gereklidir. Ancak, konfokal mikroskop kullanılamıyorsa standart floresan mikroskopi kullanılabilir. Bu protokol lazer tarama konfokal mikroskobu içindir.
- Konfokal mikroskobu ve üretici başına mikroskopla ilişkili bilgisayar yazılımını açın.
- Kaydırağı yükleyin ve mavi (DAPI/Hoechst) kanalındaki 10x hedefiyle görselleştirin. Çekirdekler görünene kadar dikkatlice odaklanın.
- Bir kez odaklanmış, yüksek büyütme (63x veya 100x) için hedef değiştirin. Kapak fişinin üstüne yağ ekleyin. Yeni hedef ile yeniden odaklama, objektif objektif odaklama sırasında yağ ile temas halinde olduğundan emin olun.
NOT: Yüksek büyütme (63x veya 100x) sadece ince odaklama kullanın. Yağ sadece bir yağ amacı için kullanılmalıdır. - Hangi slaytların FISH pozitif ve hangilerinin FISH negatif olduğunu belirlemek için yeşil (eGFP/Alexa-488) kanaldaki göz parçasındaki her slaytı hızlı bir şekilde değerlendirin.
NOT: Bu ilk değerlendirme / puanlama deneysel önyargı azaltmak için ayrı bir birey tarafından kör yapılırsa en iyisidir. - Lekeli biyopsileri görüntülemek için FISH pozitif slaytla başlayın ve bilgisayar görselleştirme moduna geçin. 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555) kanallarını seçin. Bu durumda, en uzun dalga boyu kanalını kullanarak iğne deliğini ayarlayın 555. 488 kanalda etiketli bakterilerin görselleştirilmesi için doğru odak düzlemini bulun. Odak düzlemini değiştirmeden, her kanal için kazanç, lazer gücü ve mahsup ayarlayın, böylece sinyal doygun değildir ve arka plan aşırı düzeltilmez. Görüntüyü üç kanaldan da edinin.
NOT: Bir denemedeki her slaytı görüntülemek için 488 kanalının aynı ayarlarını kullanın. Lazer gücü, alanlar arasında bakteriyel görüntüleme için en uygun odak düzlemi değişirse, 405 ve 555 kanallarında ayar yapılmasını gerektirebilir. - Tüm epitel yüzeyinin görüntülerini elde edene kadar ek alanlarda tekrarlayın.
NOT: Farklı alanlarda etiketli bakterileri görselleştirmek için odak düzlemini biraz değiştirmeniz gerekebilir, ancak alanlar arasındaki 488 kanalının kazancını, lazer gücünü veya ofsetini asla değiştirmeniz gerekebilir. Bir konfokal mikroskop üzerinde çalışıyorsa, doku içindeki bakterilerin üç boyutlu lokalizasyonu analiz edilebilmek için bir Z-destesi yakalamak bilgilendirici olabilir. - Görüntüleri işleyin ve ImageJ veya benzeri bir yazılımı kullanarak doku içinde veya dokuyla ilişkili etiketli bakterileri ölçün. Gerekirse arka plan düzeltmesi yapılsa da, görüntülerin en az işlenmesi (örneğin, kanalların bölünmesi/birleştirilmesi ve görüntü dosyalarına dönüştürülmesi) önerilir. Tüm düzeltmeler veya diğer değişiklikler görüntüler arasında tutarlı kalmalıdır.
Representative Results
Protokol, parafin gömülü mesane biyopsisi bölümlerinde mesane mukozası ile ilişkili bakterilerin tarafsız tespiti için optimize edilmiştir. Şekil 1, tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonu olan kadınlardan elde edilen mesane biyopsilerinin kesitleri üzerinde bu protokolü kullanarak yapılan bir deneyden temsili konfokal mikrografları gösterilmektedir. İki seri bölüm ya evrensel 16S rRNA (üst paneller) ya da scramble (alt paneller) probları ile hibridize edildi. Dokunun aynı bölgesinden görüntüler alınmış ve bakteriler (yeşil) 16S rRNA probları ile melezleştirilmiş dokuda açıkça görülebilir, karıştırma sondası ile değil. Şekil 2 yanlış pozitif bir sonucu temsil eder. Otofloresan kollajen veya elastine karşılık gelen sinyal, 16S rRNA ve scramble prob-hibrid biyopsi bölümlerinde 405 ve 488 kanallarda tespit edilir ve her zaman bir karıştırma prob kontrolü kullanmanın önemini vurgular.
| Sonda | Sıra | Tm | Florofor | Bağlantı |
| Evrensel 16S rRNA | 5'-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3' |
54.9 | Alexa-488 (5' ve 3') | NHS Ester |
| Kapış | 5'-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3' |
Na | Alexa-488 (5' ve 3') | NHS Ester |
Tablo 1: FISH sonda dizileri ve özellikleri. Tm erime sıcaklığını gösterir ve NHS N-hidroksisuccinimide için bir kısaltmadır.
Şekil 1: Evrensel 16S rRNA FISH'in temsili konfokal mikrografları ve insan mesane biyopsisinde prob karıştırın. Aktin ve Müsin kırmızı, hücresel çekirdekler mavi ve bakteriler yeşil olarak etiketlenmiştir. Doku ilişkili bakteriler sadece 16SrRNA sondası ile tespit edilir, karıştırma ile değil. 63x büyütmede çekilen görüntüler. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsan mesane biyopsisinde yanlış pozitif yeşil otofloresanin temsili konfokal mikrografları. Aktin ve müsin kırmızı ile etiketlenir, hücresel çekirdekler mavi olarak etiketlenir ve hücre dışı matriksin bakteri ve otofloresan bileşenleri (örn. kollajen ve elastin) yeşildir. Yeşil floresan hem 16S rRNA ile gözlenir hem de yanlış pozitif bir sonuç gösteren problar scramble. Görüntüler 63x büyütme alınır. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada, 16S rRNA FlSH ile insan mesane biyopsilerinde doku ilişkili bakterilerin tespiti için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol gastrointestinal sistem veya deri gibi diğer dokulardan alınan biyopsiler için kolayca uyarlanabilir ve çeşitli memeli model organizmalardan hasat edilen dokulara da uzatılabilir. Burada açıklanan protokol aynı zamanda çoklu fiksasyon (örneğin, formalin, etanol, methacarn) ve doku hazırlama teknikleri (örneğin, parafin veya rezorin gömülü ve kriyokorunmuş dokular) kullanımı için uyarlanabilir. Çift etiketli evrensel 16S rRNA sondası, doku içinde bulunan tüm bakteri türlerinin tarafsız olarak algılanmasını sağlar ve patojenlerin ve mikrobiyotaların hastalık ta mukozal yüzeylerle nasıl etkileşime girdiğine dair değerli bilgiler sağlayabilir. Devletleri. Türlerin veya cinslere özgü 16S veya 23S rRNA sondalarının seçimi veya tasarımı için ProbeBase, PhylOPDb veya ARB yazılım paketinin PROBE_DESIGN aracı gibi kaynakları kullanarak, bu protokol belirli bakteri türlerinin veya cinslerinin tespiti için uyarlanabilir doku içinde15,21,22. Bu yöntem için önemli bir gelecek yönü, mesane mukozası içindeki mikrobiyal çeşitliliğin değerlendirilmesi için farklı, ayrık foroforlarla etiketlenmiş türler veya cinse özgü problar kullanılarak çoklamadır.
Bu yöntemin insan örneklerinde kullanılmasının başlıca sınırlaması biyopsi li dokunun kullanılabilirliğidir. Biyopsi almak için Kurumsal İnceleme Kurulu onayı ve bilgili hasta onayı gereklidir ve optimal numune toplama ve hasta meta verilerine erişim için prosedürü uygulayan klinisyen ile doğrudan işbirliği gereklidir. CEFT prosedürü mesane epitelini yok eder, bu yüzden işlemden önce bu bölgelerin biyopsisini haklı çıkarmayı başardık. Deparafinizasyon adımında toksik ksilenlerin kullanımı ve prosedür boyunca steril bir ortamın korunması gerektiğinden bu protokol için bir duman başlığı veya uygun şekilde monte edilmiş biyogüvenlik kabini gereklidir. Bir floresan mikroskop, tercihen konfokal, 63x veya 100x objektif ve uygun filtre setleri Hoechst, Alexa-555 ve Alexa-488 görselleştirme için bu protokol için gereklidir. Şekil 1'de gösterilen temsili sonuçlar lazer tarama konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. Benzer lazer tarama mikroskopları karşılaştırılabilir görüntüler üretmelidir. Bu protokol sadece doku ile ilişkili bakterileri tespit yeteneği ile sınırlıdır ve, örneğin, mantarlar. Doku içindeki mantar patojenlerini tanımlamak için mantar 18S veya 28S rRNA'ya özgü problar kullanılmalıdır18.
Bu protokolün kritik adımları, prosedür boyunca steril bir ortamın korunmasını ve dokunun hibridizasyon ve boyama adımları arasında kurumamasını sağlamayı içerir. İşlem sırasında doku kurursa, sinyal nemlendirilebilir veya yıkama adımı sırasında doku kaydıraktan düşebilir. Ayrıca her zaman bu protokol için iki seri bölüm kullanmak önemlidir - biri 16S rRNA sondası için, diğeri de karıştırma sondası için. Bu denetim olmadan, yanlış pozitifleri ayırt etmek çok zor olabilir ve elde edilen veriler yararlı veya bilgilendirici olmayabilir. Eğer bu protokol evrensel 16S rRNA sondası dışında bir sonda yla kullanılmak üzere uyarlanıyorsa, probun öngörülen erime sıcaklığından yaklaşık 5 °C daha düşük, uygun bir hibridizasyon sıcaklığı seçmek için dikkatli olunmalıdır. Sinyal yoğunluğunu korumak için, doku sonda eklendikten sonra uzun süre ışığa maruz kalmamalı ve mikroskopi sırasında aşırı pozlanmamalıdır. Son olarak, mikroskopi sırasında FISH sondasına konjuge olan florofora karşılık gelen kanalın aynı ayarları deneysel (16S rRNA prob) ve kontrol (scramble prob) slaytları arasında tutarlı tutulmalıdır. Hastaların türetilmiş dokularının mukozal yüzeyleri içindeki bakterilerin mekansal ilişkisinin görselleştirilmesi, bulaşıcı hastalığın altında yatan konak-patojen etkileşimleri hakkında klinik olarak ilgili hipotezlerin anlaşılması ve oluşturulması açısından önemlidir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Kim Orth ve Marcela de Souza Santos'a protokol tavsiyesi için, Amanda Arute'a ise teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Cecil H. ve Ida Yeşil Sandalye Sistemleri Biyoloji Bilim K.P tarafından düzenlenen tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
