Summary
Hier beschrijven we een groeivoorwaarde om de kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosate kweken. We beschrijven ook twee afzonderlijke methoden voor de detectie en kwantificering van de exopolysaccharide alginaat geproduceerd door P. aeruginosa met behulp van een traditionele uronic zuur carbazole test en een alginaat-specifieke monoklonale antilichaam (mAb) gebaseerde ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische Gram-negatieve bacteriële ziekteverwekker, kan overproduceren een exopolysaccharide alginaat resulteert in een unieke fenotype genaamd slijmvlies. Alginaat is gekoppeld aan chronische longinfecties wat resulteert in een slechte prognose bij patiënten met cystische fibrose (CF). Inzicht in de paden die de productie van alginaat reguleren, kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën die gericht zijn op de alginaatvorming. Een ander ziektegerelateerd fenotype is de kleine kolonievariant (SCV). SCV is te wijten aan de trage groei van bacteriën en vaak geassocieerd met verhoogde resistentie tegen antimicrobiële stoffen. In dit artikel tonen we eerst een methode om een genetisch gedefinieerde vorm van P. aeruginosa SCV te kweken als gevolg van pyrimidine biosynthesemutaties. Suppletie van stikstofhoudende bases, uracil of cytosine, geeft de normale groei terug aan deze mutanten, het aantonen van de aanwezigheid van een bergingstraject dat vrije bases uit het milieu scharrelt. Vervolgens bespreken we twee methoden voor het meten van bacteriële alginaat. De eerste methode is gebaseerd op de hydrolyse van de polysaccharide tot zijn uronic acid monomeer, gevolgd door derivatisatie met een chromogene reagens, carbazole, terwijl de tweede methode een ELISA gebruikt op basis van een commercieel verkrijgbare, alginaat-specifieke mAb. Beide methoden vereisen een standaardcurve voor kwantificering. We tonen ook aan dat de immunologische methode specifiek is voor alginaatkifie en kan worden gebruikt voor de meting van alginaat in de klinische monsters.
Introduction
Chronische longinfecties met Pseudomonas aeruginosa zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met cystische fibrose (CF). Tijdens de vroege kindertijd worden patiënten gekoloniseerd door meerdere bacteriële pathogenen, waaronder niet-mucoïde isolaten van P. aeruginosa1,2. De totstandkoming van de kleine kolonievariant (SCV) isoleert evenals slijmervormige isolaten is een teller voor het begin aan chronische besmettingen. SCV isolaten zijn zeer resistente3 als gevolg van hun trage groeipercentages4, waardoor ze een ernstig afschrikmiddel in de behandeling regimenten en andere chronische infecties5 door P. aeruginosa. Werk van Al Ahmar et al.6 toonde een verband tussen SCV en slijmvlies verbonden door de novo pyrimidine biosynthese. Pyrimidinehonger, als gevolg van mutaties in genen die betrokken zijn bij de productie van pyrimidine, resulteerde in SCV fenotype in de nonmucoid referentiestam PAO1 en het slijmvliesderivaat PAO581 (PAO1mucA25).
Hoewel alginaatoverproductie een belangrijke ziektemarker is voor chronische longinfecties in CF, is het niet duidelijk of er een directe correlatie is tussen de hoeveelheid alginaat en longpathologie, en het is onduidelijk of alginaat kan worden gebruikt als prognosemarker voor behandeling7. De productie van alginaat wordt voornamelijk gereguleerd door twee operonen, een regelgevende operon (algUmucABCD)8,9 en de biosynthetische operon (algD operon)10,11. Alginaat productie wordt strak gereguleerd door de sigma factor AlgU9,12 (ook bekend als AlgT) en de afbraak van de anti-sigma factor MucA13. De mogelijkheid om de productie van alginaat ter plaatse te controleren van de sputummonsters van de patiënten kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties.
Hier beschrijven we een groeitoestand die de aanwezigheid van SCV detecteert die wordt veroorzaakt door mutanten die de pyrimidine de novo niet kunnen synthetiseren. Suppletie van uracil en/of cytosine, de stikstofachtige basis van pyrimidine nucleotide, aan het medium activeert het bergingstraject, waardoor de normale groei in mutanten wordt hersteld. Deze groeimethode voor deze specifieke SCV mutanten kan worden gebruikt als een screeningmethode om pyrimidinemutaties in patiëntenmonsters te identificeren. Daarnaast bespreken we twee methoden voor detectie en meting van alginaat geproduceerd en afgescheiden door P. aeruginosa. De eerste is de traditionele methode14,15,16 van het vernederen van de polysaccharide met behulp van een hoge concentratie zuur en vervolgens het toevoegen van een colorimetrische indicator om de concentratie in het monster te kwantificeren. De tweede methode, ontwikkeld in ons laboratorium, maakt gebruik van de Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) met behulp van een anti-alginaat monoklonale antilichaam (mAb) ontwikkeld door QED Biosciences. De ELISA-methode blijkt specifieker en gevoeliger te zijn dan de uronic zuurtest en maakt veiliger gebruik mogelijk door het vermijden van het sterk geconcentreerde zwavelzuur. Met het vermogen van de ELISA om direct op de sputummonsters van de patiënt te worden gebruikt om alginaat te meten, kan het worden ontwikkeld als een diagnostisch hulpmiddel voor monitoring om de hoeveelheid alginaat in de longen te volgen in verschillende perioden van de infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SCV groeiomstandigheden en fysiologische activering van de bergingsroute
- Detectie van SCV.
- Streep de P. aeruginosa stammen PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581, en PAO581ΔpyrD op voorverwarmde Pseudomonas isolatie agar (PIA) platen en groeien bij 37 °C voor 48 uur. Op de groeiplaat wordt één kolonieisolaat je geïdentificeerd met het SCV-fenotype (koloniegrootte van 1−3 mm in tegenstelling tot de normale grootte van 3−5 mm kolonie).
- Herhaal stap 1.1.1 om een zuiver isolaat van de SCV te verkrijgen.
OPMERKING: Groei kan tot 72 uur nodig zijn als gevolg van de trage groei van de SCV-kolonies.
- Fysiologische activering van het bergingstraject.
- Met behulp van een steriele inenting lus, kies de SCV kolonie van de PIA plaat en streep op een voorverwarmde PIA aangevuld met 0,1 mM uracil. Kweek plaat bij 37 °C gedurende 24−48 uur.
OPMERKING: Alle PIA-platen die in dit protocol worden gebruikt, bevatten 20 mL/L glycerol toegevoegd aan het mengsel voordat ze autoclaven. Na autoclaven en na mengsel temperatuur is onder 55 °C voeg 11,21 mg/L uracil (0,1 mM) aan de vloeibare media voor het gieten van platen. Deze methode zou helpen bij het identificeren van pyrimidine mutaties die SCV fenotype veroorzaken in P. aeruginosa. Als het SCV fenotype het gevolg is van deze mutatie, dan zouden normale koloniegroei en grootte (3−5 mm) worden waargenomen op de uracil aangevulde PIA-platen. Als stammen de mogelijkheid hadden om alginaat te produceren, dan zal het slijmvlies fenotype ook terugkeren bij uracil suppletie.
- Met behulp van een steriele inenting lus, kies de SCV kolonie van de PIA plaat en streep op een voorverwarmde PIA aangevuld met 0,1 mM uracil. Kweek plaat bij 37 °C gedurende 24−48 uur.
2. Uronic Acid Carbazole Assay
- Van een zuivere cultuur van gewenste stam te testen, identificeren van een enkele kolonie. Met behulp van een steriele tandenstoker, kies de kolonie, en plaats de tandenstoker in een cultuur reageerbuis met 5 mL pseudomonas isolatie bouillon (PIB). Groei in een shaker incubator bij 37 °C gedurende 24 uur.
OPMERKING: De volgende stammen PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB, en PAO581pyrD werden geteeld op PIA platen of PIA platen aangevuld met 0,1 mM uracil te oogsten alginaat voor meting. - Voeg op een voorverwarmde PIA-plaat 150 μL gekweekte PIB-bouillon (voor 15 mm x 100 mm platen) of 450 μL bouillon (voor 15 mm x 150 mm platen) toe. Met behulp van een steriele celverspreider, verspreid de bouillon over de plaat. Laat de plaat 24 uur groeien op 37 °C.
LET OP: Aanzuigen overtollige vloeistof, indien aanwezig, van de plaat met behulp van een pipet door het kantelen van de plaat aan de ene kant. Zowel PIB- als PIA-platen die in het protocol worden gebruikt, bevatten 20 mL/L glycerol die door cellen als koolstofbron moet worden gebruikt om te helpen bij de productie van alginaat. - Met behulp van een pipet controller en een steriele 50 mL pipet, voeg 0,85% NaCl aan het gazon geteeld en monster te verzamelen door het slopen van de plaat met behulp van een cel spreader. Zuig het monster aan met een verse 50 mL pipet in een 50 mL-inzamelbuis. Vortex het monster op hoog te mengen en plaats de monsters op ijs.
OPMERKING: Het volume van de toegevoegde 0,85% NaCl varieert afhankelijk van de grootte van de plaat. Gebruik voor platen van 15 mm x 100 mm 10−30 mL en gebruik voor platen van 15 mm x 150 mm 20−50 mL. - Meet de optische dichtheid op 600 nm (OD600) van de monsters door 1 mL van het monster toe te voegen aan een wegwerpcuvette en de OD te lezen met behulp van een spectrofotometer. Herhaal deze stap 2x om een drieling van leest voor elk monster te verkrijgen.
- Voeg 3 mL van de zwavelzuur/borate oplossing toe aan kweekbuizen en laat op ijs zitten. Voeg 350 μL van het verzamelde monster Langzaam aan de zure mix in de reageerbuizen en vortex op lage kort.
- Bereid borate voorraad door het toevoegen van 10.099 g kaliumhydroxide (KOH) poeder tot 45 mL water. Voeg 24,74 g boorzuur (H3BO3)toe aan het mengsel en breng het volume op 100 mL.
- Plaats 1 L fles in een gootsteen met ijs en vul fles met 500 mL geconcentreerd zwavelzuur. Voeg langzaam 15 mL van de bereide borate voorraad toe. Laat de fles afkoelen.
- Voeg nog eens 10 mL borate voorraad voor een totaal van 25 mL. Zodra de fles is afgekoeld, breng het volume op 1 L.
LET OP: Deze methode is gebaseerd op het gebruik van sterk geconcentreerd zwavelzuur. Er moet een goede persoonlijke beschermingsuitrusting worden gebruikt om de veiligheid en het juiste verwijderingsprotocol van het monster te waarborgen.
OPMERKING: Voor een positieve controle een bekende concentratie d-mannuronzuur en/of een bekende bacteriële alginaatmonsters geoogst en gezuiverd door middel van alginaat producerende stammen van P. aeruginosa (bijvoorbeeld: PAO581-PAO1mucA25). Voor een negatieve controle gebruik 0,85% NaCl oplossing en / of PAO1ΔalgD (In-frame schrapping van algD gen dat maakt de bacteriën volledig niet in staat om alginaat te produceren). Van elk monster kunnen meerdere buizen worden gemaakt om het aantal technische herhalingen te verhogen om te helpen bij statistische analyse. Bereid 3−5 buizen van elk monster.
- Voeg 100 μL van 0,1% carbazol in ethanoloplossing toe aan de zuur/monstermix. Sluit de buis en vortex af op medium stand voor 5 s. Plaats in een droog bad op 55 °C gedurende 30 min.
- Verwijder na incubatie de buizen en vortex kort op hoog en laat 5 min afkoelen.
LET OP: Kleur te zien zou een schaduw van paars. Kleur blijft stabiel voor meting gedurende 1−2 uur. - Lees de OD530 van elke buis door 1 mL van het mengsel toe te voegen aan een schone cuvette en de OD van de monsters op 530 nm te lezen op een spectrofotometer. Gebruik de buis met 0,85% NaCl als een blanco aan de spectrofotometer.
- Maak een standaardcurve voor door de OD530 van seriële verdunningen van bekende concentraties D-Mannuronzuur (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL en 8 μg/mL) te meten. Herhaal 2x. Haal een lineaire vergelijking uit deze metingen.
LET OP: Standaardcurve hoeft maar één keer te worden uitgevoerd. De lineaire vergelijking die daaruit wordt gehaald, kan worden gebruikt voor latere tests.- Bereken de concentratie van het alginaat in elk monster met behulp van de standaardcurve en verdeel de alginaatconcentratie van lineaire vergelijking door OD600 om de totale hoeveelheid alginaat per OD600te verkrijgen .
3. ELISA voor Alginate Quantitation
- Herhaal stap 2.1−2.4 om monsters te verkrijgen voor alginaatmeting.
OPMERKING: Gebruikte stammen waren PAO1, PAO1ΔalgDen PAO1 met pHERD20T-algU. - Voeg met behulp van een micropipette 50 μL van het verzamelde monster toe aan een onbehandelde 96-putplaat. Voeg 50 μL coatingbuffer (carbonaat/bicarbonaatbuffer pH 9.6) toe aan de putten. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 2 uur.
OPMERKING: Voor een positieve controle kan een bekende concentratie D-Mannuronzuur en/of een bekende stabiele alginaatworden gebruiken die stam produceert (bijvoorbeeld: PAO581-PAO1mucA25). Voor een negatieve controle gebruik 0,85% NaCl oplossing en / of PAO1ΔalgD (in-frame schrapping van algD gen maakt de bacteriën volledig niet in staat om een alginaat te produceren). Uit elke steekproef kunnen meerdere putten worden gemaakt om het aantal technische herhalingen te verhogen om te helpen bij statistische analyse. Bereid 3−5 putten van elk monster. - Met behulp van een spuitfles, was de plaat putten 2x met 1x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) met 0,05% Tween 20 (PBS-T) door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door het omdraaien van de plaat over.
- Met behulp van een micropipette voeg 200 μL van het blokkeren buffer (10% magere melk in PBS-T) aan de putten. Incubeer bij 4 °C 's nachts.
LET OP: Wikkel plaat in paraffine film of krimpen wrap om te helpen voorkomen dat verdamping in de koelkast. - Met behulp van een spuitfles wassen de plaat putten 2x met PBS-T door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door flipping plaat over.
- Met behulp van een micropipette voeg 100 μL verdund primair antilichaam (muis anti-alginaat monoklonale antilichaam) toe aan de putten en uitbroed bij 37 °C gedurende 1−2 uur.
OPMERKING: Primair antilichaam (muisantialginaat monoklonale antilichaam) werd geleverd bij een concentratie van 0,5 μg/mL (verdunning van 1:2.000 van 1 mg/mL-voorraad) in antilichaamverdunningsoplossing (1% magere melk in 1x PBS). - Met behulp van een spuitfles wassen de plaat putten 3x met PBS-T door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door flipping plaat over.
- Met behulp van een micropipette voeg 100 μL verdund secundair antilichaam toe aan de putten en uitbroed bij 37 °C gedurende 1−2 uur.
OPMERKING: Secundair antilichaam gebruikt was pierce geit anti-muis poly-HRP antilichaam tot een concentratie van 0,25 μg/mL (verdunning van 1:2.000 van 0,5 mg/mL voorraad) in antilichaam verdunningoplossing. - Met behulp van een spuitfles wassen de plaat putten 3x met PBS-T door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door flipping plaat over.
- Voeg met behulp van een micropipette 100 μL TMB-ELISA-oplossing(Tabel met materialen)toe en broed op kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker.
LET OP: De kleur van een positieve reactie zou een schaduw van blauw. - Voeg met behulp van een micropipette 100 μL stopoplossing (2 N zwavelzuur) toe.
OPMERKING: De kleur wordt van blauw naar geel wanneer de stopoplossing wordt toegevoegd. Kleur is stabiel tot 30 min nadat de reactie is gestopt. - Lees met behulp van een plaatlezer de OD op 450 nm.
- Produceer een standaardcurve door de OD450 van seriële verdunningen van bekende concentraties D-Mannuronzuur (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL en 8 μg/mL) te meten. Herhaal 2x. Uit deze metingen halen een lineaire vergelijking.
LET OP: De standaardcurve hoeft maar één keer te worden uitgevoerd. De lineaire vergelijking die daaruit wordt gehaald, kan worden gebruikt voor latere tests.- Bereken de concentratie van het alginaat in elk monster met behulp van de standaardcurve en verdeel de alginaatconcentratie van lineaire vergelijking door OD600 om de totale hoeveelheid alginaat per OD600te verkrijgen .
4. Statistische analyse van alginaatmeting
- Stel in een grafisch softwareblad een kolom in met de lineaire vergelijking die is afgeleid van de standaardcurve. Stel de y-asresultaten in als de alginaatconcentratie en de x-asresultaten als de OD530 voor uronic acid test en OD450 voor ELISA om de alginaatconcentraties in elk monster te verkrijgen.
- Om de hoeveelheid alginaat in elk monster te normaliseren tot het bedrag per 5,5 x108 CFU/mL (1 OD600), de concentratie van elk monster dat hierboven is verkregen door de respectieve OD600-waarde, wordt verdeeld. Als voor elk monster meerdere OD600 werden gemeten, verdeel dan door de gemiddelde OD600.
- Statistische analyse uitvoeren met behulp van voorkeursstatistische software (bijvoorbeeld GraphPad Prism 7.02).
- Open de software. Kies Kolom onder Nieuwe tabel en grafiek en kies de eenrichtingsanova-gegevensset.
- Noem elke kolom met de geteste stam en voeg de alginaatconcentraties eronder toe.
- Klik na het invoeren van alle gegevens op Analyseren in het bovenste menu. Hiermee wordt een venster voor analyse-instellingen geopend. Kies de juiste parameters voor het testen en geef aan of er meerdere vergelijkingen moeten worden uitgevoerd.
OPMERKING: Na analyse bevat de gegevensset een p-waarde die de statistische significantie van de gegevens kan bepalen. Gegevens zouden statistisch significant worden geacht als de p-waarde lager is dan de ingestelde α-waarde (normaal gesproken wordt α-waarde ingesteld voor p < 0,01). - Kies onder het grafiektabblad het type Staafgrafiek. Hiermee worden de gegevens automatisch in kaart gebracht met de aangegeven titel uit het invoergegevensblad. Geef de statistische significantie van de gegevens aan als dat nodig is door het * symbool boven de verbindingslijnen tussen de balken van belang weer te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont platen van PAO1 en PAO581 met of zonder in-frame deletie in het pyrd-gen (een gen in de pyrimidine biosyntheseroute) die resulteert in SCV6. De PAO1 SCV mutant werd hersteld tot een normale groei in reactie op uracil suppletie(figuur 1A,B). Bovendien werd de PAO581ΔpyrDSCV mutant teruggegeven aan mucoidy met dezelfde uracil behandeling, omdat de moederstam PAO581 een extra mucA25-mutatie heeft (figuur 1C,D). De resultaten voor de uronic acid carbazole test zijn weergegeven in figuur 26. De gegevens vertegenwoordigen monsters van PAO581 en PAO581 met mutaties in genen die pyrimidine de novo biosynthese op PIA en PIA reguleren aangevuld met 0,1 mM uracil (figuur 2A). De gegevens tonen aan dat de aanwezigheid van uracil in de media resulteert in de omzetting van de gemuteerde stam terug naar slijm (zoals blijkt uit de toename /herstelde alginaatproductie) (figuur 2B). De resultaten voor de antialginaat monoklonale elisa-antilichaam zijn vertegenwoordigd in figuur 3. De gegevens tonen PAO1, PAO1 met een in-frame schrapping van het algD-gen dat het belangrijkste alginaat biosynthetische enzym BBP-mannose dehydrogenase codeert, en PAO1 met een expressieplasmid pHERD20T met de belangrijkste alginate-specifieke sigmafactor algU wanneer gekweekt op PIA-platen met arabinose voor de inductie de pBAD promotor in pHERD20T. Deze gegevens tonen de niet-mucoïdenniveaus van alginaat gemeten voor PAO1, en PAO1ΔalgD versus de mucoid niveaus van alginaat gemeten voor PAO1 +pHERD20T-algU. Figuur 4 vergelijkt de twee methoden van alginaatmetingen met elkaar. De resultaten waren statistisch niet significant in vergelijking met elkaar met behulp van een twee-weg ANOVA met p < 0,01. Figuur 5A vergelijkt de kruisreactiviteit van de anti-alginaat mAb met andere polysachariden, waaronder amylopectine, amylose, collageen en glycogeen. Figuur 5B toont de vergelijking in specificiteit en gevoeligheid van de uronic zuur carbazole test met de nieuw ontwikkelde anti-alginaat monoklonale antilichaam gebaseerde ELISA met de controle gebruik te maken van de sterk gezuiverde zeewier alginaat ( Tabelvan materialen). Figuur 6 toont directe tests van de ELISA op patiënt sputum monsters die positief waren voor mucoid P. aeruginosa en patiënten die geen mucoid P. aeruginosabevatten .
Figuur 1: Representatieve beelden van de de novo pyrimidine biosynthesemutaties die resulteren in SCV fenotype in PAO1 en PAO581. Afbeelding toont PAO1 (links) en PAO1ΔpyrD (rechts) op PIA platen (A) en PIA platen aangevuld met uracil (B) geteeld op 37 °C voor 48 uur. Afbeelding toont PAO581 (links) en PAO581ΔpyrD (rechts) op PIA platen (C) en PIA platen aangevuld met uracil (D) geteeld op 37 °C voor 48 uur. Dit cijfer is gewijzigd van het werk gedaan door Al Ahmar et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve grafiek van uronic acid carbazole test. (A) Het beeld van mucoid P. aeruginosa stam PAO581(PAO1mucA25) geteeld bij 37 °C voor 24 uur op PIA platen (links) en PIA platen met uracil (rechts). (B) Alginaatproductie voor PAO581, PAO581carA, PAO581carBen PAO581pyrd wanneer ze werden geteeld op PIA-platen met en zonder uracil bij 37 °C gedurende 24 uur. Alginate werd verzameld en gemeten met behulp van de standaard carbazole test. Getoonde waarden zijn gemiddelde alginaat ± standaarddeviatie van drievoud leest. (**** = p < 0,0001). Dit cijfer is gewijzigd van het werk gedaan door Al Ahmar et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve grafiek van anti-alginaat mAb-gebaseerde ELISA. Alginaat productie voor PAO1, PAO1ΔalgD en PAO1 met de uitdrukking vector pHERD20T-algU geteeld op PIA met 0,1% arabinose bij 37 °C voor 24 uur. Alginate werd verzameld en gemeten met behulp van de anti-alginaat ELISA met de muis anti-alginaat monoklonale antilichaam. Getoonde waarden zijn gemiddelde alginaat ± standaarddeviatie van drievoud leest. p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking tussen de resultaten van uronic acid test en anti-alginaat mAb-gebaseerde ELISA. Alginaat productie van vijf verschillende mucoid P. aeruginosa eigen stammen geteeld op PIA platen op 37 °C voor 24 uur. Alginate werd verzameld en gemeten door de uronic zuur test en anti-alginaat ELISA. Getoonde waarden zijn gemiddelde alginaat ± standaarddeviatie van drievoud leest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Specificiteit en gevoeligheid van de op antialginaat mAb gebaseerde ELISA in vergelijking met de uronic acid carbazole test. (A) ELISA werd uitgevoerd met hoge (800 μg/mL) en lage (100 μg/mL) interne testcontroles van het zeewieralginaat. Deze alginaat werd ook gebruikt als standaard voor de ELISA. Andere polysachariden getest die kunnen kruisen reageren met anti-alginaat mAb waren amylopectine, amylose, collageen, en glycogeen (500 μg/mL per stuk). (B) Uronic acid carbazole assay en ELISA werden uitgevoerd met dezelfde reeks standaardconcentraties met zeewieralginaat: 50 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,1 μg/mL en 0,05 μg/mL. Getoonde waarden zijn gemiddelde alginaat ± standaarddeviatie van drievoud leest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Direct monsteronderzoek van patiënten. Anti-alginaat ELISA werd getest op sputummonsters van patiënten zonder voorafgaande groei op platen. Drie CF sputum monsters die groei van mucoid P. aeruginosa had werden gebruikt, evenals twee patiënt sputum monsters die ofwel niet-mucoid P. aeruginosa (Neg 1) of geen P. aeruginosa groei (Neg 2) bevatte. Getoonde waarden zijn gemiddelde alginaat ± standaarddeviatie van drievoud leest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zowel SCV en alginaat zijn belangrijke ziekte markers betrokken bij verschillende chronische infecties. Daarom is het vermogen om SCV te laten groeien en de regulatie en productie van alginaat door P. aeruginosa te bestuderen een integraal onderdeel van de ontdekking van nieuwe behandelingen voor deze chronische ziekten.
SCV stammen zijn notoir moeilijk om te groeien als gevolg van hun trage groeipercentage 4 in vergelijking met andere P. aeruginosa stammen, die helpt bij hun antimicrobiële resistentie3. Ons werk identificeert een specifieke vorm van P. aeruginosa SCV die het resultaat is van mutaties in de de novo pyrimidine biosynthese. Hier bespreken we een groeivoorwaarde voor een dergelijke SCV om terug te keren naar een normaal groeifenotype wanneer nucleoside uracil wordt geleverd. Echter, toen UMP / UTP werd toegevoegd aan het medium, de gebrekkige groei werd niet hersteld (gegevens niet weergegeven). De porin(s) die verantwoordelijk zijn voor deze selectiviteit moet verder worden bestudeerd. Suppletie van de groeimedia met uracil geholpen bij het verlichten van de stress veroorzaakt door pyrimidine honger (Figuur 1). Op dezelfde manier, toevoeging van vrije cytosine aan de media in dezelfde methode van toevoeging van uracil, geholpen bij de verlichting van pyrimidine honger (gegevens niet getoond). Zowel gratis uracil als gratis cytosine in de media komen de cellen binnen en helpen de normale niveaus van uridine monofosfaat (UMP) en uridine trifosfaat (UTP)6 in de cel terug te geven, waardoor de SCV-isolaten terugkeerden naar de normale groei.
Er bestaan verschillende kritische stappen voor de alginaatmetingen die kunnen helpen bij de reproduceerbaarheid van de resultaten. In eerste instantie moeten de monsters, nadat ze van de platen zijn gesloopt, op ijs blijven om de afbraak van alginaat in het monster te helpen blokkeren en te resulteren in lagere gemeten concentraties. Bovendien is het voorafgaand aan OD600-metingen belangrijk om het monster grondig te mengen om een homogene oplossing te verkrijgen, aangezien klonten zich vormen in monsters die al een tijdje zitten en die de OD-meting en daarmee de uiteindelijke concentratieberekeningen kunnen verstoren. Bij het gebruik van de ELISA-methode moeten monsters van groeiplaten mogelijk worden verdund, vooral bij het gebruik van stammen die een grote hoeveelheid alginaat produceren, omdat de resultaten buiten het standaardcurvebereik kunnen vallen. Bij het gebruik van het uroniczuur, grondig vortex de kweekbuizen na toevoeging van de carbazole en na de incubatie om een homogeen monster te garanderen. Bij het werken met de uronic acid test, is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het hanteren van het zuurmengsel en om de monsters goed te verwijderen.
De traditionele meetmethode die zure hydrolyse van hierboven beschreven alginaat vereist, heeft een groot potentieel getoond en is door veel onderzoekers al enkele jaren gebruikt. In dit werk tonen we de procedure voor de traditionele test samen met een in eigen huis ontwikkelde ELISA met behulp van een anti-alginaat monoklonale antilichaam. Deze antilichamen werden ontwikkeld bij muizen en kunnen alginaat herkennen bij een nog te identificeren epitoop. De specificiteit van de ELISA-methode werd grondig getest tegen alginaat van P. aeruginosa en van zeewier. Bovendien was de ELISA vergelijkbaar met de uronic acid test bij het kwantificeren van alginaat in geteste bacteriële monsters (figuur 3). Bovendien werd het getest op andere polysachariden die kunnen resulteren in vals-positieve resultaten. Ons werk toonde een hoge specificiteit van het antilichaam aan alginaat en zijn vermogen om onderscheid te maken tussen alginaat en de andere geteste polysachariden(figuur 5A). Het ELISA-protocol heeft een hogere gevoeligheid in vergelijking met de uronic acid test(figuur 5B)omdat we in staat waren om sporen van alginaat met behulp van ELISA die niet werden gedetecteerd met behulp van de uronic acid test bij het testen van patiënt sputum monsters(figuur 6) te detecteren. De ELISA-methode kan worden aangepast voor in vivo meting van alginaat uit het sputum van de patiënten (figuur 6). Zowel de groeiomstandigheden met behulp van uracil suppletie als de nieuw ontwikkelde ELISA zou krachtige instrumenten in een beter begrip P. aeruginosa pathogenese in CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur Hongwei D. Yu is de Chief Science Officer en mede-oprichter van Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies R44GM1113545 en P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
