Summary
Целью данного исследования было создание метода исследования сердечной динамики с помощью трансляционной модели животных. Описанный экспериментальный подход включает в себя оптокардиографию с двойным излучением в сочетании с электрофизиологическим исследованием для оценки электрической активности в изолированной, нетронутой модели сердца.
Abstract
Мелкие модели животных чаще всего используются в сердечно-сосудистых исследованиях из-за наличия генетически модифицированных видов и более низкой стоимости по сравнению с более крупными животными. Тем не менее, крупные млекопитающие лучше подходят для трансляционных исследований вопросы, связанные с нормальной сердечной физиологии, патофизиологии, и доклинические испытания терапевтических агентов. Чтобы преодолеть технические барьеры, связанные с использованием более крупной модели животных в кардиологических исследованиях, мы описываем подход к измерению физиологических параметров в изолированном, Лангендорф-перфированном сердце поросенка. Этот подход сочетает в себе два мощных экспериментальных инструмента для оценки состояния сердца: исследование электрофизиологии (EP) и одновременное оптическое картирование трансмембранного напряжения и внутриклеточного кальция с использованием параметра чувствительных красителей (RH237, Rhod2-AM). Описанные методологии хорошо подходят для трансляционных исследований, исследующих систему сердечной проводимости, изменения в потенциальной морфологии действия, обработка кальция, соединение эксцитации-сокращение и частота сердечных переменных или Аритмии.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной болезней и смерти во всем мире. Таким образом, основной исследовательский фокус заключается в оптимизации методологий, которые могут быть использованы для изучения нормальной сердечной физиологии и основных механизмов, которые могут способствовать заболеваемости и смертности у людей. Основные сердечно-сосудистые исследования традиционно опирались на мелкие модели животных, в том числе грызунов и кроликов1,2,3, в связи с наличием генетически модифицированных видов4,5, более низкой стоимости, меньше экспериментального следа, и более высокой пропускной всей. Тем не менее, использование модели свиней имеет потенциал, чтобы обеспечить более клинически значимые данные6. Действительно, предыдущие исследования документально сходства в сердечной электрофизиологии (EP) между людьми и свиньями, в том числе аналогичные ионные токи7, действие потенциальной формы8, и ответы на фармакологическое тестирование9. Кроме того, свиное сердце имеет сократительный и релаксации кинетики, которые более сопоставимы с людьми, чем либо грызунов или кроликов10. По сравнению с собачьей моделью, свиная коронарная анатомия больше напоминает сердце человека11,12 и является моделью выбора для исследований, ориентированных на развитие сердца, детскую кардиологию и/или врожденные пороки сердца 13. Хотя Есть различия между свиньей и человеческим сердцем8, эти сходства сделать свиное сердце ценную модель для сердечно-сосудистых исследований14.
Ретроградная перфузия сердца стала стандартным протоколом для изучения сердечной динамики ex vivo15 с момента первого создания Оскаром Лангендорфом16. Соответственно, Лангендорф-перфузия может быть использована для поддержки изолированного, нетронутого сердца при отсутствии вегетативных воздействий. Эта модель является полезным инструментом для непосредственного сравнения сердечной электрофизиологии и соотношения между здоровыми и нездоровыми сердцами. Поскольку сердечная динамика является как временной, так и пространственно сложной, небольшое изменение в одном регионе может резко повлиять на способность всего сердца работать как синцитий17. Таким образом, высокая пространственно-временной визуализации параметра чувствительных красителей является полезным инструментом для мониторинга сердечной функции по всей поверхности сердца18,19. Действительно, одновременные двойные изображения напряжения и чувствительных к кальцию флуоресцентных зондов позволяет оценить электрическую активность, обработку кальция и возбуждение-сокращение соединения на уровне ткани20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Лангендорф-перфузии и / или оптических методов картирования ранее были использованы для документирования снижения сердечной деятельности из-за старения или генетических мутаций, а также для оценки безопасности фармакологических агентов или воздействия на окружающую среду29 ,30,31,32,33.
В клинических условиях, инвазивные сердечной электрофизиологии исследование часто используется для исследования нарушений сердечного ритма, выявление патологий, и определить возможные варианты лечения. Аналогичным образом, мы описываем протокол EP, который может быть использован для оценки функции синусового узла, измерения атриовентрикулярной проводимости и определения огнеупорности ткани миокарда. Описанное исследование EP может быть выполнено в сочетании с оптическим картографией, или оптокардиографией34, чтобы полностью охарактеризовать физиологию сердца в изолированных сердцах. В описанном протоколе, высокое пространственно-временное разрешение флуоресценции изображения была выполнена с сочетанием напряжения (RH237) и кальция (Rhod-2AM) красителей в двойной установки выбросов. Кроме того, параметры сердечной электрофизиологии отслеживались как в синусовом ритме, так и в ответ на запрограммированную электрическую стимуляцию.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Национальным руководством по охране здоровья для ухода и использования лабораторных животных (Восьмое издание). Все методы и протоколы, используемые в этих исследованиях, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и использованию в Детской национальной больнице в соответствии с Руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованными NIH. Все животные, использованные в этом исследовании, получали гуманную помощь в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Подготовка
- Подготовка 6 L модифицированного раствора Krebs-Henseleit16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 глюкоза, 2.0 пируват натрия, 2% альбумин, 2.0 CaCl2). Добавить CaCl2 в день эксперимента, так как со временем, в присутствии фосфатов, хлорид кальция будет неизлечимо осаждается из раствора в виде фосфата кальция.
- Отрегулируйте рН до 7,4 после стерильной фильтрации (размер пор: 0,22 мкм). Проверьте раствор osmolality, чтобы обеспечить диапазон 275-310 мОзм/кг. Охладите 1 л на льду для использования сразу после того, как сердце будет вырезано. Теплый 3 L в водяной бане примерно до 37 градусов по Цельсию до восходящей с карбогеном (95% O2,5% CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Потепление сводит к минимуму пузырьки и потенциальную эмболию, так как холодная жидкость имеет повышенную способность газа растворяться; поэтому, как модифицированные Кребс-Хенселит сми проходит через перфузионную систему и нагревается, газ будет выпущен как пузырьки. - Подготовка 2 L кардиоплегии (модифицированный раствор кардиоплегии дель Нидо, таблица 1). Заморозить достаточно кардиоплегии в лоток кубик льда, чтобы заполнить 500 мл стакан.
- Включите циркулирующие водные ванны, установленные до 42 градусов по Цельсию. Включите насосы, чтобы распространить perfusate в закрытой гидронической тепловой петли (для полного списка материалов, см. Таблица материалов и рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагретая циркулирующая ванна воды использована для того чтобы нагреть water-jacketed пробки и обменники жары. - Очистите трубы схем и камер, запустив 2 л 1% растворуниверсального моющего средства в воде через систему. Промыть все трубы схем и камер системы Langendorff с йgt;4 L очищенной воды. Запустите насосы, пока вся вода не будет удалена из системы.
- Добавьте синтетический мембранный фильтр в соответствии с перфузионными насосами (полипропиленовый фильтр, размер поры . Газ микрофибры оксигенатор (гемофильтр) с 95% O2 и 5% CO2 на 80 кПа.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании альбумина часто происходит вспенивание, связанное с оксигенией и/или насосной активностью через трубную цепь. Анти-пена соединение (антипена Y30 эмульсии) могут быть добавлены dropwise периодически (каждые 30 минут), чтобы утолить его, как это происходит. - Проверьте двухточечную калибровку (0 и 60 мм рт. ст.) датчика давления, расположенного над аортой или в пузырчатой ловушке; калибровать по мере необходимости.
- Непосредственно перед иссечением сердца, залить средств массовой информации в Лансендорф цикла перфузии системы. Убедитесь, что перфусат проходит через микрофиновые оксигенаторы (гемофильтры) газом с кислородом перфузат, который затем течет через теплообменники для поддержания медиа перфузатной температуры 37 градусов по Цельсию в аорте.
- Установите циркулирующую водяную ванну на несколько градусов выше, чем 37 градусов по Цельсию, таких как 42 градуса по Цельсию, для учета потери тепла во время обмена и по всей системе. Мониторинг циркулирующей температуры перфузата с термопарами.
2. Иссечение сердца и Лангендорф-перфузия
- Успокоите свинью внутримышечной (I.M.) инъекцией кетамина (20 мг/кг) и ксилазина (2 мг/кг) и интубировать эндотрахеальную трубку. При индукции вводят внутривенную (I.V.) инъекцию болюса фентанила (50 мкг/кг) и рокурония (1 мг/кг). Поддержание анестезии с ингаляцией изофлуран (0,5-3%), фентанил (10-25 мкг/кг) и панкуроний (1 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого доказательства принципа исследования, несовершеннолетних йоркширских свиней (14-42 дней, No 18) были использованы, которые варьировались от 2,5 до 10,5 кг веса тела и 18-137 г веса сердца(рисунок 2). Если необходима дополнительная инъекция для индукции, кетамин (10 мг/кг) можно вводить I.M. - После того, как животное полностью обезотечат и не отвечает, выполнить стернотомии, чтобы разоблачить восходящую аорту и правое предсердие.
- Используя скальпель, сделать разрез средней линии от верхней части грудины в грудной входе, вплоть до процесса сифоида. С каутери (или ножницами), вскрыть основной жир и мышцы, пока грудина видна.
- От процесса xiphoid, отрежьте средней линии грудины вверх через manubrium с или хирургическими ножницами косточки или пилой косточки. Вставьте втягивания в разрез, чтобы разоблачить сердце.
- Доставьте дозу болиса гепарина (300 U/kg) в правое предилухи, используя 18 G иглу и шприц, чтобы свести к минимуму сгустки помарки при иссечении органов. Поместите абсорбциватые прокладки в грудной полости и лед вокруг сердца.
- Ножницами аккуратно прорежьте перикард, изолируйте аорту тупым вскрытием от окружающей соединительной ткани и зажимайте аорту чуть ниже первой артериальной ветви на аортальной арке. Используя 50 мл шприца с иглой 18 G, вводят ледяную кардиоплегию (20 мл/кг) через верхнюю часть восходящей аорты.
- Вырезать через сосуды, ведущие к сердцу и удалить сердце с восходящей аорты нетронутыми и окунуть вырезанное сердце в ледяной кардиоплегии.
- Возьмитесь за стенки аорты парой гемостатов и сужайте ее на ребристую канюлю, прикрепленную к трубам, ведущей к 1 л ледяных холодов кардиоплегии, взвешенных над сердцем (95 см, чтобы обеспечить 70 мм рт. ст.). Разрешить жидкости для входа и заполнить аорту, пока она не переполнена, чтобы предотвратить любой пузырь от входа в сосуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование механического разъединения (2,3-бутанедион моноксим (BDM) или блеббистатина) приведет к снижению скорости коронарной перфузии по мере снижения спроса на кислород ткани. - Закрепите аорту канюле с помощью пупочной ленты и далее якорь его, связывая гемостаты нести вес сердца, которое в настоящее время висит от канюли (Рисунок 1C). Разрешить холодные носители ретроградной пронизывает сердце при постоянном давлении 70 мм рт. ст. через гравитацию. Держите сердце погруженным в холодную кардиоплегию до тех пор, пока не будет готово к переносу в разогретую (37 градусов) систему Лангендорф-перфузии (злт;10 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Аорта на маленьких сердцах (злот;50 г, до 2 недельной свиньи) будет нести вес сердца, но большие сердца подвергаются риску соскальзывания канюли. Во время первоначальной каниляции и при переходе к разогретой системе, предотвратить попадание воздуха в аорту, которая может вызвать коронарные эмболии. Используйте большие необработанные трубки (внутренний диаметр no 3/8), который позволяет пузырькам расти быстрее, чем раствор, попадающий в аорту. - Перенесите сердце в систему Langendorff (37 градусов по Цельсию) без введения воздуха в канюльу. Разрешить нормальный синусовой ритм, чтобы промыть сосуды любой оставшейся крови и кардиоплегии.
ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном исследовании средняя начальная скорость потока 184 и 17 мл/мин наблюдалась в изолированных сердцах ювенильных поросят. Скорость потока снизилась до 70 и 7,5 мл/мин (средний и SEM) после проницательного сига с разогретыми носителями, содержащими механический отъем (20 мМ БДМ). Не погружайте в воду сердечную ткань, так как она может посягать на сердечную визуализацию. Температура тканей поддерживается коронарным потоком в свином сердце из-за его большего объема и меньшей площади поверхности, по сравнению с грызунами. При полном потоке температура эпикардия и эндокардия колебалась от 35 градусов по Цельсию до 37 градусов соответственно.
ПРЕДЕКТО: Носите соответствующее индивидуальное защитное оборудование, включая износ глаз при работе с механическими разъединениями. Сердце может извлечь средства массовой информации быстро и неожиданно. - Дефибрилляция сердца в случае шокирующей аритмии (желудочковая тахикардия, фибрилляция желудочков), поместив внешние весла на вершине и основании сердца и доставляя одиночный шок при 5 J, увеличиваясь в 5 J приращений (или как выбираемые дефибриллятор) до 50 J, кардиоверсия, или нешокирующий ритм. Повторите удары при 50 J по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном исследовании 89% препаратов требовали дефибрилляции. После равновесия (10 мин), средняя частота сердечных приступов 70 и 4,5 bpm (средний - SEM) наблюдалась для ювенильных сердца поросят(рисунок 2). - Промыть сердце с по крайней мере 1 L модифицированных Кребс-Хенселейт средств массовой информации, без рециркуляции, чтобы удалить остаточной крови и кардиоплегии. Как только средства массовой информации проходит ясно через сердце, закрыть циркулирующую петлю для рециркуляции perfusate.
3. Исследование электрофизиологии
- Для записи стандартной электрокардиограммы свинца II (ЭКГ) на протяжении всего исследования, прикрепите электрод иглы 29 G к желудочковому эпикарду вблизи вершины, с другим электродом в правом предсердии. Соедините положительные и отрицательные входы дифференциального биоусилителя к вершине и правому предсердию, соответственно.
- Прикрепите один биполярный электрод стимула на правой предии, и второй биполярный электрод стимула к боковому левому желудочку для ходить целей.
- Пейс сердце с помощью стимулятора электрофизиологии, с первоначальным током установить в два раза диастолический порог (1'2 мА) и 1 мс шириной импульса35,36.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если стимуляция не вызывает реакции, ширина пульса может быть увеличена до 2 мс. Больше тока (10x) необходимо с большими коаксиальными электродами (биполярной стимуляции). - Определите порог темпа, применяя ряд стимулирующих импульсов (1'2 mA, 1 мс ширины импульса) при определенных длинах цикла темпа (PCL) для обеспечения последовательной реакции стимула.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только внутренняя скорость установлена, начальный импульсный поезд может начаться с немного более короткого PCL. -
Выполните экстрастимул, шагающий с помощью либо s1'S1, либо S1'S2, в последнем поезде из 6 х 8 импульсов (S1) последовал один импульс (S2). Уменьшите S2 PCL пошагово на 10 мс (т.е. 200 мс, 190 мс, 180 мс и т.д.), пока он не сможет захватить. Подойдите к предпоследнему PCL (т.е. 190 мс) и уменьшите интервалы на 1 мс, чтобы найти наиболее точный PCL до потери захвата (т.е. 184 мс).
ПРИМЕЧАНИЕ: Одни и те же параметры стимуляции используются как для S1, так и для S2 (1 х 2 мА, ширина пульса 1 мс). См Рисунок 3 для репрезентативных примеров, или ранее опубликованных значений на свиной сердце электрофизиологии измерений37.- Чтобы установить желудочковый эффективный огнеупорный период (VERP), используйте стимулирующий электрод на боковом левом желудочке, чтобы определить кратчайший интервал S1'S2, с которым S2 (преждевременный удар) инициирует деполяризацию желудочков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Огнеупорный период является кратчайшим достижимым интервалом соединения S1-S2. - Чтобы определить длину цикла Венкебах (WBCL), используйте стимулирующий электрод на правом предсердии, чтобы найти кратчайший интервал S1-S1, с которым 1:1 атриовентрикулярная проводимость распространяется через нормальный путь проводимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Невыполнение этого требования представляет собой сердечную блокаду2-й степени. - Чтобы определить время восстановления синусового узла (SNRT), используйте стимулирующий электрод на правом предсердии, чтобы применить курсирующий поезд (S1-S1) и измерить задержку времени между последним импульсом в темпе поезда и восстановлением спонтанной активности, опосредованной синоатрийным узлом.
- Для установления атриовентрикулярного узла эффективного огнеупорного периода (AVNERP), используйте стимулирующий электрод на правом предсердии, чтобы найти кратчайший интервал соединения S1'S2, с которым за преждевременной стимуляцией предсердий следует его потенциал расслоения, который вызывает УОРС комплекс, что означает деполяризацию желудочков.
- Чтобы установить желудочковый эффективный огнеупорный период (VERP), используйте стимулирующий электрод на боковом левом желудочке, чтобы определить кратчайший интервал S1'S2, с которым S2 (преждевременный удар) инициирует деполяризацию желудочков.
4. Оптическое картирование трансмембранного напряжения и внутриклеточного кальция
ПРИМЕЧАНИЕ: Механический разъединение следует использовать для минимизации артефактов движения во время оптического картирования и для предотвращения гипоксии3,38,39,40. (-/-) Блеббистатин (5 мкм циркулирующей концентрации) может быть добавлен медленно, как доза болис0,5 мм в 5 мл перфузата (100x конечной концентрации)41. Кроме того, БДМ может быть первоначально включен в перфузатные носители при циркулирующей концентрации 20 мМ.
- Подготовка красителя напряжения путем растворения 5 мг RH237 в 4 мл ангидроусов DMSO. Разбавить красителя aliquot с до 5 мл носителей и вихря. Медленно добавьте RH237 (62,1 мкг на 500 мл перфузата) проксимальной к аортальной канюле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань миокарда может быть повторно окрашена RH237, если это необходимо, в течение всего эксперимента. - Приготовьте краску кальция, растворив 1 мг Rhod2-AM в 1 мл ангидроусов Огонек. Смешайте краситель с 50 ллуроновой кислотой, поместите в соникированную ванну на срок до 10 минут, а затем разбавьте до 5 мл носителей. Медленно добавьте краситель кальция (50 мкг на 500 мл перфузата) проксимальной к аортальной канюле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения равномерного окрашивания красителей красители следует добавлять медленно (зgt;30 с). Rhod-2AM занимает до 10 минут, чтобы достичь пиковой флуоресценции, в то время как RH237 окрашивает сердце в течение 1'2 мин. Используя описанную загрузку красителя, диапазоны отношения сигнала к шуму (SNR) могут быть ожидаемыми. Значения SNR могут быть рассчитаны как SNR q (отсчеты пика к пику)/(Стандартное отклонение во время диастолического интервала)42. - Расположите оборудование для визуализации (камера, сплиттер изображения, объектив), как показано на рисунке 1,чтобы сосредоточиться на соответствующем поле зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сплиттер настроен с дихроическим зеркалом (660 нм), которое проходит RH237 и отражает спектры выбросов Rhod2. Высокотрансмиссионные фильтры для выбросов используются для RH237 (710 нм в длину прохода) и Rhod2 (585 и 40 нм) излучаемого света (длинный проход ET710, см. Таблица материалов). К передней части сплиттера крепится широкозрачный объектив 50 мм/F0.95л. Эта конфигурация приводит к адекватному разделению света эмиссии, как ранее проверенные43,44. - Подключите камеру к рабочей станции и приобретайте изображения с помощью выбранного программного обеспечения, со временем экспозиции 0,5 х 2 мс. Выполните выравнивание изображения с помощью программного обеспечения, которое может разделить нужные области, наложить и отобразить вычитание серого масштаба или псевдо-цвет дополнение, чтобы выделить несогласованность (см. Таблица материалов для программного обеспечения вариант).
- Выключите свет комнаты, чтобы свести к минимуму флуоресценцию от окружающего освещения. Проверьте светодиодные фонари (525 нм, 1,4 мВт/мм2) до начала изображения, чтобы обеспечить равномерное и максимальное эпикардиальное освещение, определяемый глубиной скважины датчика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый свет направляется через фильтр возбуждения (535 и 25 нм). Светодиодные фонари могут быть запущены вручную перед съемками, чтобы максимизировать линейность сигнала. Излучаемые флуоресценции из эпикардия передается через сплиттер изображения и эмиссионные фильтры. Сплит изображения проецируются на высокоскоростной датчик. Поле зрения составляет примерно 12 см х 10 см, или 5,9 см х 4,7 см для каждого разделенного изображения, в зависимости от выбора объектива и расстояния от сердца. - Для оптических картографических исследований, изображение миокарда во время синусового ритма, фибрилляции желудочков(рисунок 4) или динамического темпа (S1'S1, 1'2 мА, 1 мс ширина импульса) с помощью электрода стимуляции, расположенного на левом желудочке(рисунок 5). Начните с темпа цикла длиной 350 мс, и decrement на 10-50 мс для создания кривых реституции(рисунок 5E)35,36.
5. Очистка
- Удалить сердце из системы и слейте все perfusate. Промыть систему труб и камер очищенной водой.
- Для рутинного обслуживания периодически промыть систему моющим средством или разбавленным раствором перекиси водорода по мере необходимости.
6. Обработка данных
- Подтвердите качество оптического сигнала на протяжении всего исследования, открывая видеофайл, выбирая интересующую область и прокладывая среднее флуоресценцию с течением времени с помощью соответствующего пакета программного обеспечения или пользовательского алгоритма.
-
Анализ данных изображений, как описано ранее23,33,43,45,46, для количественной оценки потенциала действия и кальция переходных временных временных параметров, в том числе время активации, время соединения напряжения и кальция (разница между временами активации Vm и Ca) и измерения продолжительности реполяризации.
- Применить пороговые значения для изоляции флуоресцентных эпикардиальных пикселей и отбрасывания шумных фоновых данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение упростит и ускорит анализ больших видео. - Пространственно фильтруют оптические сигналы над областью эпикардиальной поверхности размером от 3 мм х 3 мм до 5 мм х 5 мм, как видно на рисунке 4 и рисунке 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последний улучшит SNR без искажения потенциальных особенностей действия, кальция переходных морфологии, или общий контур волн19,47. Это может быть ненужным при использовании датчика с большими пикселями или при связывания во время приобретения. - Временно фильтровальные сигналы с цифровым фильтром lowpass (например, 5-го порядка Butterworth) с частотой отсечения между 100 и 75 Гц для устранения незначительного содержания сигнала45.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5C можно найти пример репрезентативных обработанных следов. - Применить удаление дрейфа и вычитание, через Nth-заказ полиномиальной установки, чтобы свести к минимуму последствия фотоотбелевания, движения, или других значительных источников вариации.
- После обработки и нормализации оптических данных по всему видео вычислите потенциал действия и временные параметры кальция, представляющие интерес. Определить время активации, определяемое как время максимальной производной во время деполяризации, и пик флуоресценции для того, чтобы вычислить переполяризацию в процентах времени и периодов (действия потенциальной продолжительности (APD) и «Ca 2» (a2)(i продолжительность), см. Рисунок 5).
- После расчета временных параметров, генерировать изохрональные карты, чтобы изохрональные карты, чтобы изобразить аспекты одного потенциала действия или кальция переходных по всей изображенной эпикардиальной поверхности с помощью пользовательских алгоритмов23,33, 43,45,46.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, на рисунке 5D.
- Применить пороговые значения для изоляции флуоресцентных эпикардиальных пикселей и отбрасывания шумных фоновых данных.
Representative Results
На рисунке 1A показана схема изолированной системы перфузии сердца, которая включает в себя трубную цепь, насос, фильтр, оксигенатор, резервуары и нагревательные элементы. Размещение ЭКГ (конфигурация свинца II) и темпэлектродов показано на рисунке 1B,а настройка изображения изображена на рисунке 1С. Схема оптических компонентов и световых путей показана на рисунке 1D.
Экспериментальные исследования были проведены на нетронутых, целые сердца изолированы от несовершеннолетних йоркширских свиней (14-42 дней, n No 18), которые варьировались в размерах от 2,5 до 10,5 кг массы тела и 18-137 г веса сердца(рисунок 2A). После переноса изолированного сердца в систему Langendorff (37 градусов по Цельсию), частота сердечных приступов стабилизировалась до 70 и 4,5 б/с (средний и SEM) в течение 10 мин дефибрилляции и оставалась неизменной на протяжении всего исследования(рисунок 2B). Измерялась средняя скорость потока 184 и 17 мл/мин (средняя - SEM), которая замедлилась до 70 и 7,5 мл/мин после того, как он проникся подогретым носителями, содержащими механический отъем(рисунок 2C).
Свинец II ЭКГ были зарегистрированы на протяжении всего исследования во время синусового ритма(рисунок 3A) или в ответ на внешние темпы(Рисунок 3B-E) для количественной оценки электрофизиологических параметров. Для оценки EP, динамическое темпирование (S1'S1) было применено к правому предсердию, чтобы определить WBCL и SNRT (время восстановления после начала S1-S1, Рисунок 3C), в котором WBCL был обозначается как кратчайший PCL, который инициировал предсердий к желудочковой проводимости. Протокол шага S1'S2 был реализован с использованием биполярного электрода стимула на левом желудочке для того, чтобы определить кратчайший интервал соединения, который инициировал деполяризацию желудочков, тем самым выявляя VERP (Рисунок 3D). Кроме того, для определения AVNERP (S1-S2), как показано на рисунке 3E,применяется протокол шага предсердий S1'S2. Репрезентативные примеры параметров электрофизиологии сердца свиньи выравниваются в тесном контакте с ранее опубликованными37.
Эксперименты оптического картирования проводились во время синусового ритма, спонтанной фибрилляции желудочков(рисунок 4),или во время динамического темпа (S1-S1) левого желудочка (LV) для генерации электрических и кальциевых кривых реституции, изображенных в Рисунок 5. Репрезентативные изображения сердца поросенка, нагруженного красителями, показаны на рисунке 4 с соответствующими оптическими потенциалами действия (Vm) и переходными кальцием (Ca), собранными из двух областей, представляющих интерес на эпикардиальной поверхности (правый желудочек (RV) - синий, LV и красный) . Необработанные сигналы отображаются во время синусового ритма и во время фибрилляции желудочков. Как упоминалось ранее, динамические эпикардиальные темпы (S1'S1) также был использован во время оптических картографических экспериментов, чтобы нормализовать любую небольшую разницу в внутренней частоте сердечных выражений(рисунок 5A-E). Отображаются сырые сигналы (RV , синий, LV и красный), которые были использованы для изображения потенциала действия - время переходного соединения кальция(рисунок 5C),активация и время продолжительности(Рисунок 5D),электрическая и рекуперация кальция(рисунок 5E). Для густых препаратов миокарда пространственная фильтрация размером 3 мм х 3 мм подходит для потенциала эпикардиального действия или переходного анализа кальция19,47. Соответственно, изображения с высоким пространственным разрешением (в описанной установке 1240 x 1024 всего, или 620 х 512 на канал, размер пикселей 6,5 мкм) часто пространственно binned во время или после приобретения (Рисунок 5C). Обработка изображений может быть выполнена для генерации карт активации и переполяризации с помощью пользовательских алгоритмов23,33,43,45 (рисунок 3D),с временем активации каждый пиксель на сердце был определен как максимальная производная от потенциального действия или кальция переходного upstroke.
Рисунок 1: Экспериментальная установка. (A) Диаграмма изолированной системы перфузии сердца; стрелки обозначают направление потока. (B) Каннулированное сердце показано с размещением электрода. РА - правая предрия, Р.В. и правый желудочек, л.с. левый желудочек, ЭКГ и электрокардиограмма свинца II. (C) Платформа визуализации в непосредственной близости от ткани сердца. (D) Выбросы каждого дополнительного зонда (напряжение, кальций) разделены длиной волны с помощью устройства расщепления изображений с соответствующими фильтрами выбросов и дихроическим зеркалом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Измерения веса сердца, скорости и потока. (A) Соотношение веса сердца к массе тела для каждого поросенка, используемого в исследовании (n No 18). (B) Частота сердечных приступов измеряется 10 мин после дефибрилляции и снова в конце исследования (примерно 1 ч). (C) Коронарный поток падает стремительно после перфузии с механическим uncoupler (BDM) из-за снижения спроса на кислород. Шкала баров представляют среднее количество SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные примеры записей свинца II электрокардиограммы, собранных во время синусового ритма или в ответ на внешние темпы. (A) Нормальный синусовой ритм. (B) Пример эпикардиального темпа при длине цикла 400 мс (S1'S1), который был использован для экспериментов изображений. (C) Топ: Предсердие ходить, чтобы определить WBCL; успешный захват наблюдается на S1 и 250 мс в котором предсердие к желудочковой проводимости наблюдается. Обратите внимание, что ход предсердий может быть использован для определения SNRT (время разгрузки синусового узла, после того, как начался внешний темп). Внизу: По мере уменьшения длины цикла S1 до 205 мс, проведение желудочка завершается неудачей. (D) Топ: Эпикардиальный темп (S1'S2) для идентификации VERP; успешный захват наблюдается на S1 и 450 мс, S2 и 300 мс. Нижняя: Как S2 длина цикла уменьшается до 250 мс, желудочковой ткани не удается захватить. (E) Предсердие ходить (S1'S2) для идентификации AVNERP. Вверху: Успешный захват наблюдается на S1 450 мс, S2 и 200 мс. Нижняя: Как S2 длина цикла уменьшается до 199 мс, проведение желудочка не удается. Синие стрелки обозначают темп шипы, красные стрелки обозначают захват ('C') или нет захвата ('NC'). S1'S1 - динамический темп, S1'S2 - экстрастимул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Оптические данные во время синусового ритма и фибрилляции желудочков. Слева: Репрезентативные изображения свиного сердца, нагруженного краской (Vm и напряжение, RH237; Ca кальций, Rhod2), передний вид. Пространственно фильтруется трансмембранное напряжение и внутриклеточные флуоресцентные сигналы кальция от свиного сердца во время синусового ритма (Центр). Сигналы напряжения и кальция во время фибрилляции желудочков (справа). Размеры области сигнала (15 х 15 пикселей и 2,4 х 2,4 мм2,30 х 30 х 4,8 х 4,8 мм2 размера ядра) представлены в виде красных и синих квадратов. Единицы и F /F. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Оптические данные из Langendorff-перфированных свиных сердец. Необработанные, пространственно фильтруемые(A)трансмембранное напряжение и (B)внутриклеточные сигналы флуоресценции кальция из правого и левого желудочков во время электрического темпа на вершине. Нефильтрованные, пространственно усредненные сигналы изображают оптические потенциалы действия и переходные кальция из регионов, представляющих интерес (сигнальные единицы являются Фз/Ф). (C) Наложение нормализованных переходных иллюстрирует действие потенциального кальция переходного времени соединения (низкий проход фильтруется на 75 Гц). (D) Обработка сигналов по всей эпикардиальной поверхности для генерации изохроновых карт временных параметров, включая время активации (tact)и время реполяризации 80%. (E) Электрические и кальций переходных кривых реституции, генерируемых на нескольких частотах (слева) со статистическим анализом (справа), чтобы проиллюстрировать больше времени реполяризации при более медленном темпе длины цикла. Шкала баров - означает SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Химических | Формула | Молекулярный вес | г/л |
| Хлорид натрия | Nacl | 58.44 | 5.26 |
| Глюконат натрия | C6Н11НаО7 | 218.14 | 5.02 |
| Тригидрат ацетата натрия | C2H3NaO2No3H2O | 136.08 | 3.68 |
| Хлорид калия | Kcl | 74.55 | 0.63 |
| Хлорид магния (ангидра) | MgCl2 | 95.21 | 0.1405 |
| 8.4% Бикарбонат натрия | NaHCO3 | 84.01 | 13 |
| Маннитол | C6H14O6 | 182.17 | 16.3 |
| Сульфат магния | MgSO4 | 120.37 | 4 |
| Ph | 7.4 | ||
| Осмоляритность (моосмол/L) | 294 |
Таблица 1: Модифицированный рецепт кардиоплегии дель Нидо.
Discussion
Хотя модели сердечно-сосудистых исследований варьируются от клеточных до препаратов in vivo, существует неотъемлемый компромисс между клинической актуальностью и экспериментальной полезностью. На этом спектре, изолированные Langendorff-перфированные сердца остается полезным компромиссом для изучения сердечной физиологии48. Вся модель сердца представляет собой более высокий уровень функциональной и структурной интеграции, чем монослои одной клетки или ткани, но также позволяет избежать сложностей, связанных с моделями in vivo. Основным преимуществом во время двойных оптических картографических экспериментов является то, что эпикардиальная поверхность изолированного сердца может наблюдаться, а флуоресцентная визуализация трансмембранного потенциала и обработки кальция может быть использована для мониторинга сердечной физиологии34.
Модели грызунов чаще всего используются для изолированных препаратов сердца, в отличие от крупных животных, отчасти из-за связанных с этим расходов на увеличение размера всех элементов,участвующих (например, объем раствора, перфузионная схема, количество красителей и механических разъемов) наряду с большей нестабильностью и склонностью к аритмии у крупных животных10,36,49. Одним из преимуществ использования свиных сердец является то, что они очень похожи на человеческое сердце по структуре, размеру и скорости сокращения, поэтому более точно моделируя гемодинамические параметры, такие как коронарный кровоток и сердечный выброс. Аналогичным образом, люди и свиньи имеют аналогичные обработки кальция, электрокардиограмма интервалы37, и действия потенциальной морфологии, включая основные каналы, которые он представляет12,50,51, 52. Этот протокол подробно описывает шаги по созданию воспроизводимой большой животной модели для всесторонней характеристики функции миокарда. Одновременное изображение трансмембранного напряжения (RH237) и внутриклеточного кальция (Rhod2), используемого в сочетании с установленными электрофизиологическими протоколами, дает возможность определить механизмы, которые отвечают за изменение сердечного Функции. Описанная методология может быть использована для доклинического тестирования безопасности, токсикологического скрининга и исследования генетических или других патологий заболеваний. Кроме того, описанная методология может быть изменена и адаптирована для использования с другими сердечными моделями (например, собачьими, человеческими) в зависимости от конкретного исследовательского фокуса53,54,55.
Есть несколько критических изменений, чтобы иметь в виду при переходе от меньшего модели грызунов к более крупной модели свиньи для изолированных, все сердца препаратов. Во время подготовки и установки, мы рекомендуем добавить альбумин в перфусат для поддержания онкотического давления и уменьшить отек (плюс антипены, если это необходимо)56,57,58,59. Кроме того, перфусат, содержащий альбумин может также помочь в метаболических исследований, которые также требуют жирных кислот добавок к средствам массовой информации60,61. В отличие от сердца грызунов, больше сердце свиньи не должны быть погружены в теплые носители из-за его меньшей поверхности к объему соотношение и увеличение объема разогретых носителей, протекающих через коронарные сосуды, которые лучше поддерживает температуру. Как отмечалось ранее, мы разместили температурные зонды внутри правого желудочка и на эпикардиальной поверхности как правого, так и левого желудочков, наблюдая лишь незначительные колебания температуры в размере 1,2 градуса Цельсия во всех трех местах на протяжении всего исследования. Важно отметить, что такие более быстрые скорости потока могут также увеличить вероятность пузырьков и потенциальной эмболии. Чтобы обойти эту проблему, мы рекомендуем использовать пузырь ловушку с большими трубками, ведущими прямо к аортной канюле. Аналогичным образом, мы сочли наиболее полезным иметь двух человек, работающих в тандеме, чтобы канюляции аорты на большем (и тяжелее) сердце; один человек, чтобы держать аорту открытым с крепкими hemostats и другой, чтобы обеспечить аорту в канулу с помощью пупочной ленты. В описанной методологии, мы обнаружили, что перфузия с кардиоплегией и дефибрилляции имеют жизненно важное значение для восстановления сердца, что противоречит препаратов сердца грызунов. По нашему опыту, лишь немногие вырезанные сердца возобновили нормальную синусовые действия без кардиоверсии.
Для улучшения оптических конечных точек изображения, подвесной препарат сердца ограничил эффект блики, которые могут возникнуть с погруженным сердцем. Кроме того, висячие сердца также избегает каких-либо сжатия или компромисса коронарных сосудов на задней аспект сердца, которые могут возникнуть при укладке сердца вниз горизонтально для вертикальной визуализации. Мы также обнаружили, что погрузка флуоресцентных красителей после пузырька ловушки (близко к аорты канюли) значительно улучшилось окрашивание тканей и оптических сигналов. Наконец, для улучшения конечных точек сердечной электрофизиологии, использование более крупного коаксиального электрода стимуляции способствовало успешному темпу предсердий. Хотя мы описываем использование электрокардиограмм для выявления захвата и потери захвата для различных параметров EP, интракардиальный катетеры или биполярные электроды записи также могут быть использованы.
Наше исследование было сосредоточено на разработке методологии двойного оптического картирования и сердечной электрофизиологической оценки в изолированной, нетронутой модели сердца. Из-за сходства с ювенильным человеческим сердцем, свиное сердце остается популярной моделью для исследований, ориентированных на детскую кардиологию или врожденные пороки сердца. Важно отметить, что описанный подход может быть адаптирован для использования с большим размером взрослых сердец и / или различных видов, представляющих интерес. Действительно, другие лаборатории могут обнаружить, что использование собачьих или человеческих сердец (либо доноров или больных) являются более применимыми для их конкретного исследования фокус53,54,55. Еще одним потенциальным ограничением для этого исследования является использование механического разъединения для уменьшения артефакта движения во время визуализации. Blebbistatin стал uncoupler выбора в сердечных приложений визуализации из-за его минимального воздействия на параметры ЭКГ, активации и огнеупорных периодов41,62,63. BDM является менее дорогостоящим выбором, который может быть особенно важным в крупных исследованиях на животных, которые требуют больших объемов перфузата и механического разъединения, но это, как известно, имеют большее влияние на калий и кальций токов, которые могут изменить потенциал действия морфология64,65,66,67. Если БДМ используется, обратите внимание, что сокращение APD увеличивает уязвимость сердца к шок-индуцированных арритмии68. И наоборот, основным ограничением к использованию блеббистатина является его фоточувствительность и фототоксичность, хотя альтернативные формулировки, которые уменьшили эти эффекты69,70,71. Наконец, описанная методология использует единую систему камер для двойного оптического картографирования экспериментов, но важно отметить, что исследования сосредоточены на фибрилляции желудочков и / или отслеживания электрических волн по всей эпикардиальной поверхности необходимо будет изменить этот подход, чтобы включить трехмерные панорамные изображения, как описанодругими 15,19,72,73,74,75 .
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признают д-ра Мэтью Кей за полезное экспериментальное руководство, и Манелл Рамадан и Muhaymin Чоудхури за техническую помощь. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01HL139472 в NGP, R01 HL139712 в NI), Детским научно-исследовательским институтом, Детским национальным институтом сердца и Институтом детских хирургических инноваций имени Шейха Заида.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560-5MG | Mechanical Uncoupler |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753-100G | Mechanical Uncoupler |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| Analog signal interface | emka Technologies | itf16USB | |
| Antifoam | Sigma-Aldrich | A5758-250ML | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A5758 | |
| Aortic cannula, 5/16” | Cole-Parmer | 45509-60 | |
| Bubble trap | Sigma-Aldrich | CLS430641U-100EA | |
| CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
| Camera, sCMOS | Andor Technology | Zyla 4.2 PLUS | |
| Coaxial stimulation electrode (atria) | Harvard Apparatus | 73-0219 | |
| Defibrillator | Zoll | M Series | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology | T660lpxrxt-UF2 | |
| Differential amplifier | Warner Instruments | DP-304A | |
| Emission filter, calcium | Chroma Technology | ET585/40m | |
| Emission filter, voltage | Chroma Technology | ET710lp | |
| EP stimulator (Bloom) | Fisher Medical | DTU-215B | |
| Excitation filter | Chroma Technology | CT510/60bp | |
| Excitation lights | Thorlabs | SOLIS-525C | |
| Filter | McMaster-Carr | 8147K52 | |
| Filter cartridge, polypropylene | Pentair | PD-5-934 | |
| Filter housing | McMaster-Carr | 9979T21 | |
| Flow transducer | Transonic | ME6PXN | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Hemofilter | Hemocor | HPH 400 | |
| Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501326 | |
| Image Splitter | Cairn Research | OptoSplit II | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
| Large-bore tubing, I.D. 3/8” | Fisher Scientific | 14-169-7H | |
| Lens 50 mm, 0.95 f-stop | Navitar | DO-5095 | |
| Metamorph | Molecular Devices | Image Alignment | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
| Mucasol detergent | Sigma-Aldrich | Z637181-2L | |
| Na Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
| Needle Electrodes 29 G, 2 mm | AD Instruments Inc. | MLA1204 | |
| Noise eliminator | Quest Scientific | Humbug | |
| Perfusion pump | PolyStan | A/S 1481 | |
| Pressure transducer | World Precision Instruments | BLPR2 | |
| Reservoir, 2 L | Cole-Parmer | UX-34541-07 | |
| RH237 | AAT Bioquest Inc. | 21480 | |
| Rhod2-AM | AAT Bioquest Inc. | 21062 | |
| Stimulation electrode (ventricle) | Harvard Apparatus | 73-0160 | |
| Surgical Suture | McKesson Medical-Surgical | 890186 | |
| Transducer amplifier | World Precision Instruments | TBM4M | |
| Tubing flow console | Transonic | TS410 | |
| Umbilical tape | Jorvet | J0025UA | |
| Water bath/circulator | VWR | 89400-970 | |
| Surgical Tools | |||
| Bandage shears | Harvard Apparatus | 72-8448 | Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm |
| Electrocautery | Dalwha Corp. Ltd. | BA2ALD001 | Model: 200 Basic |
| Hemostat | Roboz | RS-7476 | St Vincent Tube Occluding Forceps |
| Hemostatic forceps | Harvard Apparatus | 72-8960 | Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm |
| Hemostats | Harvard Apparatus | 72-8985 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm |
| Mayo scissors | WPI | 501749 | 14.5 cm, Straight |
| Metzenbaum scissors | WPI | 501747 | 11.5 cm, Straight |
| Mosquito forceps | Harvard Apparatus | 72-8980 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm |
| Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8828 | Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length |
| Pediatric cross clamp | Roboz | RS-7660 | Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations |
| Right angle forceps | WPI | 501240 | Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle |
| Scalpel | Ted Pella | 549-4 | Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades |
| Scissors | Harvard Apparatus | 72-8380 | Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm |
| Straight Serrated forceps | WPI | 500363 | Dressing Forceps 15.5 cm |
| Towel clamp | WPI | 501700 | Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS |
| Weitlaner retractor | WPI | 501314 | Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs |
| Disposables | |||
| 3-0 prolene suture | Various vendors | Various vendors | |
| Vessel loop | Aspen surgical | 011001PBX | Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm |
| Cardioplegia (Plegisol) | Pfizer | 00409-7969-05 | Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg |
| Heparin | Various vendors | Various vendors | 300 U/kg |
| Syringe and Needle | Various vendors | Various vendors | 60 mL & 18 G respectively |
| Umbilical tape | Ethicon | U12T |
References
- Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166 (2015).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2012).
- Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115 (2012).
- Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5 (3), 70-76 (1989).
- Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 19, Unit 19 1-17 (2009).
- Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671 (2014).
- Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, Pt 1 105-119 (1998).
- Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60 (1), 79-87 (2009).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
- Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30 (2016).
- Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (6), 2210-2213 (2013).
- Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92 (3), 1090-1095 (2007).
- Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
- Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89 (4), 2332-2349 (2005).
- Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 291 (4), 1935-1941 (2006).
- Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217 (2017).
- Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11 (1), 39 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95 (1), 21-33 (2004).
- Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68 (1), 106-114 (2000).
- Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1388-1401 (2016).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, Clifton, N.J. 205 (2011).
- Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
- Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (2), 28 (2018).
- Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88 (3), 23-30 (2001).
- Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122 (4), 384-390 (2014).
- Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595 (12), 3799-3813 (2017).
- Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127001 (2018).
- Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596 (17), 3977-3991 (2018).
- Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (7), (2019).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
- Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
- Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8 (6), 66658 (2013).
- Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25 (6), 1249-1254 (2016).
- Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (4), 529-537 (2014).
- Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
- Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
- Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
- Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1241-1243 (2008).
- Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. , 651380 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (7), 753-765 (2012).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (1), 327-335 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12 (2), 160-172 (2010).
- Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30 (2016).
- Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
- Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), 006692 (2018).
- Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79 (1), 168-177 (2005).
- Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104 (7), 915-923 (2009).
- Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87 (7), 956-965 (2009).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254 (6), 1105-1112 (1988).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241 (5), 364-371 (1981).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13 (1), 168-172 (1989).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), 262-269 (2012).
- Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (5), 503-512 (2012).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27 (11), 1991-1997 (1993).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (45), 419-424 (2010).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74 (6), 305-313 (1994).
- Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 310-318 (2004).
- Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320 (3), 1020-1025 (2004).
- Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44 (2), 584-588 (2005).
- Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6 (1), 26141 (2016).
- Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47 (10), 1382-1391 (2000).
- Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12 (4), 44019 (2007).
- Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8 (1), 2921 (2018).
- Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51 (7), 1219-1229 (2004).
