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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

मंजूरी दे दी दिल तीन आयामी इमेजिंग के माध्यम से लक्षित सेल आबादी के हृदय चोट प्रतिक्रिया पर कब्जा

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60482
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

चोट के बाद कार्डियोमायोसाइट प्रसार एक गतिशील प्रक्रिया है जिसके लिए गैर-मायोसाइट सेल आबादी से बाह्य संकेतों की सिम्फनी की आवश्यकता होती है। वंश ट्रेसिंग, निष्क्रिय स्पष्टता, और त्रि-आयामी पूरे-माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करते हुए, हम हृदय की मरम्मत और उत्थान पर विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों के प्रभाव का विश्लेषण कर सकते हैं।

Abstract

हृदय रोग मौत के अन्य सभी कारणों को मात देता है और दुनिया भर में मृत्यु का एक चौंका देने वाला 31% के लिए जिम्मेदार है। यह बीमारी हृदय की चोट में प्रकट होती है, मुख्य रूप से एक तीव्र मायोकार्डियल इंफेक्शन के रूप में। चोट के बाद थोड़ा लचीलापन के साथ, एक बार स्वस्थ हृदय ऊतक रेशेदार, गैर संकुचन निशान ऊतक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा और अक्सर दिल की विफलता के लिए एक प्रस्तावना हो । पुनर्योजी चिकित्सा में उपन्यास उपचार विकल्पों की पहचान करने के लिए, अनुसंधान ने जन्मजात पुनर्योजी क्षमताओं के साथ कशेरुकी पर ध्यान केंद्रित किया है। ऐसा ही एक आदर्श जीव नवजात माउस है, जो मजबूत मायोकार्डियल पुनर्जनन के साथ हृदय की चोट का जवाब देता है। नवजात माउस में चोट को प्रेरित करने के लिए जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है, हमने मानव हृदय में एथेरोस्क्लेरोसिस द्वारा शुरू किए गए एक मायोकार्डियल इंफेक्शन को प्रतिबिंबित करते हुए बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (एलएडी) को कम करने के लिए एक सर्जरी विकसित की है। जब कार्डियोमायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट आबादी दोनों के भीतर परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए प्रौद्योगिकी के साथ मिलान किया जाता है, तो यह मॉडल हमें हृदय उत्थान का मार्गदर्शन करने वाले तंत्रों की पहचान करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। चोट के बाद हृदय कोशिका आबादी में परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करना एक बार ऊतक अनुभागन और हिस्टोलॉजिकल परीक्षा जैसे तरीकों पर भारी भरोसा करता था, जो दो आयामी विश्लेषण तक सीमित होते हैं और अक्सर इस प्रक्रिया में ऊतक को नुकसान पहुंचाते हैं। इसके अलावा, इन तरीकों में सेल वंश में परिवर्तन का पता लगाने की क्षमता की कमी है, बजाय केवल चोट प्रतिक्रिया का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। यहां, हम वर्णन करते हैं कि कार्डियक रिपेयर के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए वंश ट्रेसिंग मॉडल, पूरे अंग समाशोधन और त्रि-आयामी (3 डी) पूरी माउंट माइक्रोस्कोपी में तकनीकी रूप से उन्नत तरीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है। नवजात माउस मायोकार्डियल इंफेक्शन सर्जरी, ऊतक समाशोधन, और 3 डी पूरे अंग इमेजिंग के लिए हमारे प्रोटोकॉल के साथ, कार्डियोमायोसाइट प्रसार को प्रेरित करने वाले जटिल रास्ते सुलझाया जा सकता है, हृदय उत्थान के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों का खुलासा।

Introduction

दिल लंबे समय से एक के बाद माइटोटिक अंग माना जाता है, अभी तक हाल ही में सबूत दर्शाता है कि कार्डियोमायोसाइट नवीकरण वयस्क मानव दिल में प्रति वर्ष1%के बारे में होता है । हालांकि, कार्डियोमायोसाइट कारोबार की ये कम दरें चोट के बाद होने वाले ऊतकों के भारी नुकसान की भरपाई करने के लिए अपर्याप्त हैं। एक दिल है कि एक मायोकार्डियल इंफेक्शन का सामना करना पड़ा है लगभग एक अरब कार्डियोमायोसाइट्स खो देंगे, अक्सर दिल की विफलता और अचानक हृदय मृत्यु2,,3के लिए एक प्रस्तावना के रूप में सेवारत । दुनिया भर में दिल की विफलता से प्रभावित २६,०००,००० से अधिक लोगों के साथ, चिकित्सीय चिकित्सा के लिए एक अपूरित जरूरत है कि हृदय रोग4द्वारा दिए गए नुकसान रिवर्स कर सकते हैं ।

चिकित्सा विज्ञान में इस अंतर को पाटने के लिए, वैज्ञानिकों ने विकासवादी रूप से संरक्षित तंत्रों की जांच शुरू कर दी है जो चोट के बाद एंडोजेनस पुनर्जनन को रेखांकित करते हैं । स्तनधारी हृदय उत्थान का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल नवजात माउस है। जन्म के बाद सप्ताह के भीतर, नवजात चूहों हृदय क्षति5के बाद एक मजबूत पुनर्योजी प्रतिक्रिया है । हमने पहले यह दर्शाया है कि नवजात चूहे एक एपिकल रिसेक्शन5के बाद कार्डियोमायोसाइट प्रसार के माध्यम से अपने दिल को पुनर्जीवित कर सकते हैं। हालांकि इस तकनीक नवजात णों में हृदय उत्थान पैदा कर सकते हैं, सर्जरी मानव दिल की चोटों के लिए नैदानिक प्रासंगिकता का अभाव है । नवजात माउस मॉडल में मानव चोट की नकल करने के लिए, हमने कोरोनरी धमनी ऑक्सीलेशन6के माध्यम से एक मायोकार्डियल इंफेक्शन को प्रेरित करने की तकनीक विकसित की है। इस तकनीक में बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (एलएडी) के सर्जिकल लिगेशन की आवश्यकता होती है, जो 40% -50% रक्त को बाएं वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम6,,7तक पहुंचाने के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार, सर्जरी के परिणामस्वरूप एक इंफर्ट होता है जो बाईं वेंट्रिकुलर दीवार के एक महत्वपूर्ण हिस्से को प्रभावित करता है। मायोकार्डियम को होने वाले नुकसान से नवजात5में कार्डियोमायोसाइट प्रसार और हृदय उत्थान को बढ़ावा मिलेगा ।

कोरोनरी धमनी ऑक्सीलेशन सर्जरी हृदय उत्थान के आंतरिक कामकाज को उजागर करने के लिए एक अत्यधिक प्रजनन योग्य और सीधे अनुवाद विधि प्रदान करती है। नवजात सर्जरी मानव हृदय में कोरोनरी धमनी एथेरोस्क्लेरोसिस समानताएं, जहां धमनियों की भीतरी दीवारों के भीतर पट्टिका का संचय एक occlusion और बाद में मायोकार्डियल इंफेक्शन8पैदा कर सकता है । दिल की विफलता के रोगियों के लिए चिकित्सीय उपचार में एक शूंय के कारण, बालक में एक occlusion मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है एक साल के भीतर 26% तक पहुंचने के लिएचोट 9के बाद, और फलस्वरूप "विधवा निर्माता कहा गया है." चिकित्सा विज्ञान में प्रगति के लिए एक मॉडल की आवश्यकता होती है जो हृदय की चोट के जटिल शारीरिक और रोग प्रभावों को सटीक रूप से दर्शाता है। नवजात माउस हृदय चोट के लिए हमारा सर्जिकल प्रोटोकॉल एक मंच प्रदान करता है जो शोधकर्ताओं को आणविक और सेलुलर संकेतों की जांच करने की अनुमति देता है जो चोट के बाद स्तनधारी हृदय उत्थान का संकेत देते हैं।

हाल के शोध में बाह्य वातावरण और कार्डियोमायोसाइट्स के बीच गतिशील संबंध पर प्रकाश डाला गया है। उदाहरण के लिए, प्रसवोत्तर पुनर्योजी खिड़की को हृदय10के आसपास के बाह्य मैट्रिक्स की कठोरता को कम करके बढ़ाया जा सकता है। नवजात बाह्युशिकी मैट्रिक्स से बायोमैटेरियल्स हृदय की चोट11के बाद वयस्क स्तनधारी दिलों में हृदय उत्थान को भी बढ़ावा दे सकते हैं । कार्डियोमायोसाइट प्रसार के साथ एक एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया12,13है; कोलैटरल धमनी नवजन्म माउस के पुनर्जीवन दिल के लिए अद्वितीय गठन हृदय उत्थान12उत्तेजक के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था . इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला ने दिखा दिया है कि तंत्रिका सिग्नलिंग विकास कारक स्तरों के मॉड्यूलेशन के माध्यम से कार्डियोमायोसाइट प्रसार और हृदय उत्थान को नियंत्रित करता है, साथ ही चोट14के बाद भड़काऊ प्रतिक्रिया भी देता है। ये निष्कर्ष हृदय की चोट के जवाब में गैर-मायोसाइट सेल आबादी का पता लगाने की आवश्यकता पर जोर देते हैं। इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, हमने वंश ट्रेसिंग के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन की संविलियन या सशर्त अभिव्यक्ति को शामिल करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों लाइनों में क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली का लाभ उठाया है। इसके अलावा, हम इंद्रधनुष माउस लाइन के साथ क्लोनल विस्तार पैटर्निंग निर्धारित करने के लिए उन्नत तरीकों का उपयोग कर सकते हैं, जो लक्षित सेल आबादी15के क्लोनल विस्तार को निर्धारित करने के लिए क्रे-निर्भर, बहु-रंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं की उदासीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। नवजात कोरोनरी धमनी ऑक्सीलेशन सर्जरी के साथ वंश अनुरेखण को नियोजित करना हृदय उत्थान के जटिल सेलुलर तंत्र को विच्छेदन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

तीन आयामी (3 डी) पूरे अंग इमेजिंग के साथ फ्लोरोसेंटी लेबल कोशिकाओं के वंश पर नज़र रखने के लिए पारंपरिक अनुभागऔर पुनर्निर्माण तकनीक का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए मुश्किल है-खासकर जब सेल आबादी नाजुक हैं, जैसे तंत्रिका फाइबर या रक्त वाहिकाओं । जबकि ऑप्टिकल सेक्शनिंग द्वारा अंग की प्रत्यक्ष संपूर्ण-माउंट इमेजिंग सतही कोशिका आबादी को कैप्चर कर सकती है, ऊतक के भीतर गहरी रहने वाली संरचनाएं दुर्गम रहती हैं। इन बाधाओं को दरकिनार करने के लिए, पूरे अंग ऊतकों की अस्पष्टता को कम करने के लिए ऊतक समाशोधन तकनीक विकसित की गई है। हाल ही में, लिपिड-एक्सचेंज एक्रिलामाइड-हाइब्रिड्ड कठोर इमेजिंग संगत ऊतक हिड्रोगेल (स्पष्टता) आधारित तरीकों को साफ करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की गई है, जो लिपिड निष्कर्षण16के माध्यम से निश्चित ऊतक को स्पष्ट करते हैं। अपवर्तक सूचकांक को समरूप बनाने और बाद में इमेजिंग17के दौरान प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए भी कदम उठाए जाते हैं । ऐसी ही एक विधि सक्रिय स्पष्टता है, जो पूरे ऊतक18में डिटर्जेंट को भेदने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके लिपिड अपघटन को तेज करती है। हालांकि प्रभावी, इस ऊतक समाशोधन विधि महंगे उपकरणों की आवश्यकता है और ऊतक क्षति का कारण बन सकता है, इस तरह के हृदय नसों19के रूप में नाजुक सेल आबादी के साथ असंगत दृष्टिकोण बना । इस प्रकार, हम निष्क्रिय स्पष्टता दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं, जो डिटर्जेंट प्रवेश को धीरे-धीरे सुविधाजनक बनाने के लिए गर्मी पर निर्भर करता है, इसलिए जटिल कोशिका संरचनाओं को बनाए रखने में सहायता करता है20,,21।

निष्क्रिय स्पष्टता को आम तौर पर सक्रिय स्पष्टता18की तुलना में कम कुशल माना जाता है, क्योंकि तकनीक अक्सर दो प्रमुख बाधाओं के साथ होती है: पूरे अंग गहराई को साफ करने में असमर्थता और वयस्क ऊतकों को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक समय की व्यापक मात्रा। हमारा निष्क्रिय स्पष्टता दृष्टिकोण इन दोनों बाधाओं को एक त्वरित समाशोधन प्रक्रिया के साथ दूर करता है जो नवजात और वयस्क हृदय ऊतक ों को पूरी तरह से साफ करने में सक्षम है। हमारे निष्क्रिय स्पष्टता ऊतक समाशोधन तकनीक एक दक्षता है कि हृदय सेल आबादी की एक किस्म के दृश्य की अनुमति देता है, दुर्लभ वयस्क दिल भर में वितरित आबादी सहित पहुंच गया है । जब स्पष्ट दिल को फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित किया जाता है, तो विकास, रोग और उत्थान के दौरान सेल-विशिष्ट पैटर्निंग की वास्तुकला को प्रकाशित किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग और देखभाल के लिए गाइड के अनुसार और विस्कॉंसिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड पब्लिक हेल्थ में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुपालन में किए गए थे । सभी तरीकों जंगली प्रकार C57BL/6J (B6) और ट्रांसजेनिक माउस जैक्सन प्रयोगशालाओं से प्राप्त लाइनों पर प्रदर्शन किया गया ।

1. कोरोनरी धमनी Occlusion (Myocardial Infarction) 1 दिन पुराने नवजात चूहों में बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (LAD) के लिगेशन के माध्यम से प्रेरित6

  1. 1 दिन पुराने नवजात पिल्ले को मूल नेस्टिंग सामग्री के साथ एक साफ पिंजरे में रखकर मां से अलग करें।
  2. एक हीटिंग पैड मध्यम गर्मी के लिए सेट पर पिंजरे के आधे जगह है । पिल्ले पिंजरे के गरम पक्ष पर रहना चाहिए, केवल सर्जरी के बाद गर्म पक्ष पर रखा जा रहा है ।
  3. एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र बनाएं। निष्फल सर्जिकल उपकरण(तालिका 1)इकट्ठा करें।
  4. हाइपोथर्मिया के माध्यम से पिल्ला को एनेस्थेटिज़ करें: बर्फ के साथ सीधे त्वचा के संपर्क से बचने के लिए धुंध में पिल्ला लपेटें और लगभग 3-4 मिन के लिए इसे बर्फ के बिस्तर में दफनाएं। एक अंगूठे की चुटकी करके समय-समय पर चूहों के हाइपोथर्मिया की जांच करें। नवजात ों ने हाइपोथर्मिया को अच्छी तरह से सहन किया, हालांकि, हाइपोथर्मिया के लंबे समय तक संपर्क में रहने के परिणामस्वरूप ठंढ और बाद में मृत्यु हो सकती है।
  5. एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद माउस को सर्जिकल एरिया पर स्पूर स्थिति में रखें, जिससे हाथ और पैर टेप से सुरक्षित हो जाएं। माउस के सर्जिकल क्षेत्र को एंटीसेप्टिक समाधान के साथ स्टरलाइज करें।
  6. निचले छाती क्षेत्र का पता लगाएं और छोटे विच्छेदन कैंची के साथ त्वचा में एक ट्रांसवर्स चीरा बनाते हैं। पसलियों के सर्जिकल दृश्य को चौड़ा करने के लिए, ड्रेसिंग संदंश की एक जोड़ी के साथ त्वचा को धीरे से उठाकर मांसपेशियों से त्वचा को अलग करें और बंद स्थिति में छोटी कैंची के साथ इंटरकोस्टल मांसपेशियों के खिलाफ धीरे-धीरे दबाएं।
  7. चौथे इंटरकोस्टल स्पेस(चित्रा 1ए)का पता लगाएं और तेज संदंश का उपयोग करके एक छोटा, सतही पंचर बनाएं, किसी भी आंतरिक अंगों को पंचर न करें। ड्रेसिंग संदंश के साथ इंटरकोस्टल मांसपेशियों के बीच में क्षेत्र को चौड़ा करके एक कुंद विच्छेदन करें। चीरा की उचित शारीरिक स्थिति दिल तक उचित पहुंच के लिए आवश्यक है।
  8. धीरे-धीरे उंगली रखकर और पेट के बाईं ओर बढ़ते दबाव को लागू करके छाती गुहा से दिल का मार्गदर्शन करें, जबकि ड्रेसिंग संदंश(चित्रा 1बी)के साथ इंटरकोस्टल स्पेस खुला थामे हुए। एक बार जब दिल छाती के बाहर हो जाए, तो ड्रेसिंग संदंश को हटा दें, दबाव को दूर करें, और दिल को इंटरकोस्टल मांसपेशियों पर आराम करने दें।
  9. दिल के क्षेत्र के रूप में बालक का पता लगाएं कि कम जमा रक्त है और सही शारीरिक स्थिति में है(चित्रा 1सी)। बालक केवल माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है अगर दिल सर्जरी शुरू करने के कुछ ही मिनटों के भीतर पहुँचा है।
  10. एक 6-0 सीवन(चित्रा 1डी)के साथ बालक को मजबूत करके बालक लिगेशन करें। मायोकार्डियल इंफेक्शन(चित्रा 1ई)को प्रेरित करने के लिए दो बार एक वर्ग गाँठ बांधें। मायोकार्डियम में टांके की गहराई भिन्न हो सकती है, हालांकि, लाड लिगेशन की उचित शारीरिक स्थिति प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। बालक को लिगाटिंग करते समय, सीवन को कसकर लेकिन ध्यान से खींचा जाना चाहिए ताकि बालक को न तोड़ सके। दिल के शीर्ष पर ब्लैंचिंग तुरंत देखा जाएगा(चित्रा 1ई)
  11. दिल को छाती गुहा में वापस फिसलने दें; इस प्रक्रिया को धीरे से ड्रेसिंग संदंश के साथ सुविधा दी जा सकती है। पसलियों को एक सर्जन की गाँठ के साथ एक साथ टांका करें, जिसके बाद एक वर्ग गाँठ, पसलियों के ऊपरी सेट को उठाने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करके पसलियों के ऊपरी और निचले सेट के माध्यम से 6-0 टांके गुजरते हैं।
  12. पिल्ला के पिछले पैरों को सुरक्षित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले टेप को हटा दें।
  13. ऊपरी पेट पर थोड़ी मात्रा में स्किन ग्लू रखकर त्वचा का एक साथ पालन करें। फिर, ठीक संदंश के साथ निचले पेट की त्वचा को पकड़ो और उजागर छाती क्षेत्र को कवर करें। अतिरिक्त गोंद की मात्रा को सीमित करें जो पिल्ले पर रहता है, क्योंकि इससे मां द्वारा अस्वीकृति और नरभक्षी होने की संभावना बढ़ सकती है।
  14. तुरंत एक हीटिंग पैड पर पिल्ला डालकर संज्ञाहरण से वसूली की सुविधा मध्यम गर्मी के लिए सेट । समय-समय पर नवजातों की प्लेसमेंट को शरीर के सभी हिस्सों को समान रूप से गर्म करने के लिए स्विच करें।
  15. नवजात को 10-15 मिनट के लिए हीटिंग पैड पर सीधे रहने दें। आमतौर पर, गर्मी पर रखे जाने के 5 मिनट के भीतर आंदोलन वापस आ जाता है।
  16. अवशिष्ट रक्त और गोंद को अल्कोहल पोंछके से साफ करें।
  17. मूल पिंजरे से बिस्तर के साथ पूरे शरीर को रगड़कर नवजातों पर विदेशी सुगंध को कवर करें। पिल्ला को गर्म साइड पर पिंजरे में रखें जबकि अन्य सर्जरी की जा रही है।
  18. एक बार सभी सर्जरी पूरी हो जाती है और पिल्ले गर्म और मोबाइल होते हैं, तो मूल घोंसले की सामग्री के साथ कूड़े को मां के पिंजरे में स्थानांतरित कर देते हैं।
  19. सर्जरी के बाद 30-60 मिन के लिए चूहों की निगरानी करें और घोंसले और/या संवारने द्वारा पिल्ले की मां की स्वीकृति के लिए देखो ।
  20. सर्जरी के बाद सुबह चूहों पर जांच करें। यदि मां व्यथित है और पिल्ले नेस्टेड नहीं किया है, पिल्ले के लिए एक पालक मां पर विचार करें ।

2. निष्क्रिय स्पष्टता21,,22,,23 के साथ माउस हार्ट समाशोधन

  1. आइसोफ्लोरीन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज़ करें। यह सुनिश्चित करने के लिए एक अंगूठे की चुटकी करें कि माउस पूरी तरह से सेगाहुआ है।
  2. माउस को स्किन स्थिति में एक साफ, सर्जिकल क्षेत्र पर रखें, जो टेप के साथ हाथ और पैर सुरक्षित करें।
  3. जब तक दिल निकाला जाता है तब तक नाक शंकु का उपयोग करके माउस पर आइसोफ्लोरीन सेडेशन बनाए रखें।
  4. ऊतक संदंश के साथ xiphoid प्रक्रिया के ठीक नीचे फर पकड़ कर निचले छाती खोलें और बड़े विच्छेदन कैंची का उपयोग कररिबकेज की चौड़ाई में फैले एक चीरा बनाते हैं।
  5. सर्जिकल कैंची के साथ रिब पिंजरे के डिस्टल भागों के साथ कट।
  6. ऊतक संदंश के साथ xiphoid प्रक्रिया लोभी द्वारा डायाफ्राम मांसपेशी का पर्दाफाश। घुमावदार संदंश का उपयोग करके डायाफ्राम को अलग करना।
  7. xiphoid प्रक्रिया की समझ बनाए रखते हुए, ऊतक को क्रैनिली तब तक खींचें जब तक कि धड़कन दिल सुलभ न हो जाए।
  8. घुमावदार संदंश के साथ आधार पर दिल को समझें और इंद्रधनुषी कैंची के साथ महाधमनी और बेहतर वेना कावा को काटकर छाती गुहा से दिल को विच्छेदन करें।
  9. जबकि दिल अभी भी धड़क रहा है, एक पेट्री पीबीएस से भरा पकवान में दिल जगह है ताकि दिल के अंदर खून पंप के रूप में यह धड़कता रहता है । मायोकार्डियल इंफेक्शन की पुष्टि यह जांचकर की जा सकती है कि सीवन का प्लेसमेंट एलएडी लिगेशन के लिए उचित शारीरिक स्थिति में है।
  10. दिल को अवशिष्ट रक्त को निष्कासित करने की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे दिल को संदंश के साथ निचोड़ें।
  11. माउस दिल को पीबीएस के 2 मिलील के साथ डिस्पोजेबल 2.5 मिलीग्लास शेल शीशी में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मीटर के लिए एक शेखर पर दिल इनक्यूबेटिंग द्वारा अवशिष्ट रक्त को कई बार धोलें। पीबीएस स्पष्ट रहने तक हर बार पीबीएस समाधान बदलें।
  12. पीबीएस को त्यागें और शीशी को ठंड के 2 मिलील के साथ भरें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)। आरटी में 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट(चित्रा 2ए)।
  13. ऊष्मायन के बाद पीएफए और शीशी को पीबीएस के 2 एमएल के साथ छोड़ दें। आरटी में 10 मिन के लिए एक शेखर पर दिल धोएं । धोने के कदम को दो बार दोहराएं, निकासी और नए PBS के साथ शीशी भरने के लिए पूरी तरह से दूर अतिरिक्त पीएफए धोने के लिए ।
  14. पीबीएस को छोड़ दें और शीशी को 4% एक्रिलैमाइड और 0.5% वीए-044 समाधान के 2 एलएल के साथ भरें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  15. अगले दिन शीशी को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीट ब्लॉक में स्थानांतरित करपॉलीमराइजेशन करें।
  16. दिल को एक नए ग्लास शेल शीशी में स्थानांतरित करें और चरण 2.12 (पीबीएस वॉश साइकिल) दोहराएं।
  17. पीबीएस को छोड़ दें और समाशोधन समाधान(तालिका 2)के 2 एमएल के साथ शीशी भरें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक दिल को मंजूरी नहीं दी जाती। समाधान बदलें और हर 2-3 दिनों में ताजा समाशोधन समाधान के साथ फिर से भरना। समाशोधन प्रक्रिया में कई सप्ताह तक का समय लग सकता है(चित्रा 2बी-सी)।
    नोट: P1 दिलों में आम तौर पर लगभग 3-5 दिन लगते हैं, जबकि P21 दिलों को क्लीयरिंग सॉल्यूशन इन्क्यूबेशन पूरा होने से पहले लगभग एक महीने लग सकते हैं।
  18. पीबीएस को छोड़ दें और पीबीएस के 2 एमएल के साथ शीशी भरें और चरण 2.12 (पीबीएस वॉश साइकिल) दोहराएं। शीशी को ताजा पीबीएस के साथ फिर से भरें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  19. यदि इम्यूनोस्टेनिंग किया जाएगा, तो 2.21-2.22 चरणों को छोड़ दें और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए धारा 3 पर जाएं। यदि पूरी तरह से एंडोजेनस फ्लोरेसेंस पर भरोसा करें, तो चरण 2.21-2.22 के साथ आगे बढ़ें और धारा 3 को छोड़ दें।
  20. पीबीएस को छोड़ दें और अपवर्तक इंडेक्स मैचिंग सॉल्यूशन (रिम्स)(टेबल 3)का समाधान बदलें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  21. ऊष्मायन के बाद, साफ ऊतक आरटी में रिम्स समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है । ऊतक केंद्र में सफेद और अपारदर्शी प्रतीत हो सकता है जब पहली बार रिम्स में स्थानांतरित; ऊतक कई हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर रिम्स में इनक्यूबेटेड होने के बाद पारदर्शी हो जाना चाहिए(चित्रा 2डी)।

3. वैकल्पिक: पूरे माउंट माउस हार्ट के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला

  1. रिम्स समाधान से साफ दिल निकालें और पीएसटी के 2 मिलील के साथ एक साफ 2.5 मिलीएल ग्लास शीशी में जगह (0.1% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ पीबीएस)
  2. एसटीबी में दिल को 3 बार एक कक्षीय रोटेटर पर 30 मिन ऊष्मायन के साथ टी में धोएं।
  3. 20% अवरुद्ध बफर (PBST में पतला) के 2 mL में दिल विसर्जित करके गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी ब्लॉक करें और आरटी में 3 घंटे के लिए रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें। रात भर रोटेशन के साथ दाग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
    नोट: ब्लॉकिंग बफर सामान्य सीरम से बनाया जाता है जो उन प्रजातियों से मेल खाता है जिनमें माध्यमिक एंटीबॉडी उठाया गया था।
  4. आरटी में 5 मिन ऊष्मायन के लिए रोटेशन के साथ 3 बार PBST में दिल धोएं।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी (PBST के साथ बफर को अवरुद्ध करने में पतला) में दिल को विसर्जित करें और एल्यूमीनियम पन्नी में ग्लास शीशी लपेटकर प्रकाश जोखिम को रोकें। आरटी में रात भर रोटेशन के साथ इनक्यूबेट ।
    नोट: इस बिंदु से आगे, एल्यूमीनियम पन्नी लगातार परिवेश प्रकाश जोखिम से माध्यमिक की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  7. प्राथमिक धुंधला के बाद, ऊतक से अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए चरण 3.2 (लंबे पीएसटी वॉश चक्र) को दोहराएं। आरटी में रोटेशन के साथ एक रात ऊष्मायन के साथ धोने का विस्तार ।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए सीमित प्रकाश व्यवस्था वाले क्षेत्र में काम करना, माध्यमिक एंटीबॉडी (पीएसटी के साथ बफर को अवरुद्ध करने वाले 2% में पतला) में दिल को विसर्जित करें और आरटी में 3 घंटे के लिए रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें। रात भर रोटेशन के साथ दाग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  9. अगले दिन, अबाध्य माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए चरण 3.2 (लंबे पीएसटी वॉश साइकिल) को दोहराएं।
  10. 2% अवरुद्ध बफर (पीएसटी में पतला) के साथ समाधान को बदलें। आरटी में रोटेशन के साथ रात भर धोकर अवशिष्ट अनबाउंड एंटीबॉडी निकालें।
  11. अगले दिन, जांच करें कि अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हटा दिया गया है। जरूरत के रूप में धोने का विस्तार, 2% अवरुद्ध बफर समाधान दैनिक की जगह । कोई गैर विशिष्ट माध्यमिक के लिए एक बार थोड़ा आगे बढ़ना मौजूद है ।
  12. इम्यूनोदाग्ड हार्ट को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर करें।
  13. पूरी माउंट माइक्रोस्कोपी से पहले सीधे, रिम्स समाधान में दिल को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। यदि ऊतक अभी भी पूरी तरह से साफ नहीं है तो ऊष्मायन को अतिरिक्त 24 घंटे बढ़ाएं।
  14. आरटी में रिम्स में पूरी तरह से मंजूरी दे दी और इम्यूनोदागेड दिल स्टोर करें।

4. 3 डी में नॉन-माइओसाइट आबादी की कल्पना करना- क्लियर माउस हार्ट की सिंगल-फोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

नोट: यदि माउस दिल भ्रूण काटा जाता है, धारा 4.1 के साथ जारी रखें। माउस दिल ों के लिए पोस्टनेटल काटा, धारा 4.2 के साथ जारी रखें।

  1. इमेजिंग क्लियर भ्रूणीय माउस हार्ट
    1. पीबीएस समाधान के साथ माइक्रोस्कोप अवसाद स्लाइड भरें।
    2. ध्यान से घुमावदार संदंश के साथ साफ दिल उठाओ और स्लाइड पर ऊतक जगह है ।
    3. स्लाइड को ग्लास कवरस्लिप के साथ माउंट करें। ऊतक अब एक confocal माइक्रोस्कोप के तहत छवि जा सकता है।
  2. इमेजिंग मंजूरी दे दी प्रसवोत्तर माउस हार्ट
    1. पीबीएस समाधान के साथ अवसाद स्लाइड के कक्ष के आधे भरें। वयस्क माउस दिल को फिट करने के लिए एक कक्ष बनाने के लिए, 3 डी-मुद्रित पॉलीप्रोपाइलीन अवसाद स्लाइड कस्टम-मेड(चित्र4)थी।
    2. ध्यान से घुमावदार संदंश के साथ साफ दिल उठाओ और कक्ष में ऊतक जगह है । पीबीएस के साथ चैंबर की शेष मात्रा भरें।
    3. कक्ष को पीबीएस से भरें ताकि तरल की सतह कक्ष के ऊपर एक गुंबद बनाती है। कवर स्लाइड माउंट। ऊतक अब एक ईमानदार confocal माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया जा सकता है ।

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Representative Results

अक्सर दो सबसे चुनौतीपूर्ण कदम छाती गुहा से बाहर दिल का मार्गदर्शन कर रहे है और बालक ligating । इन चरणों को परेशान करने के लिए, चौथे इंटरकोस्टल मांसपेशियों के बीच प्रारंभिक पंचर के प्लेसमेंट में समायोजन किया जा सकता है; यदि पंचर और कुंद विच्छेदन उरोस्थि के निकट बहुत करीब हैं, तो दिल छाती गुहा(चित्रा 1ए)से बाहर निकलने में सक्षम नहीं हो सकता है।

इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए बाएं पेट पर दबाव बढ़ने की आवश्यकता हो सकती है(चित्रा 1बी)। इंटरकोस्टल मांसपेशियों पर दिल को आराम देते समय जटिलताएं भी हो सकती हैं। हमने पाया कि दिल वापस लेने के बिना गुहा के बाहर रहेगा जब कुंद विच्छेदन एक ंयूनतम आकार के लिए रखा जाता है और मुख्य रूप से क्षैतिज दिशा में प्रदर्शन किया । यह अभिविन्यास स्पष्ट दृश्य और बालक(चित्रा 1सी)तक पहुंच के लिए भी अनुमति देता है।

बालक के पीछे सीवन सुई रखते समय, बाएं वेंट्रिकल की पूर्वकाल की दीवार में गहरी पैठ बनाने का सुझाव दिया जाता है, क्योंकि सतही लिगेशन में अंतिम सीवन प्लेसमेंट(चित्रा 1डी)में समायोजन के लिए कम जगह होती है। बालक के चारों ओर सीवन बांधने को नियंत्रित, स्थिर आंदोलनों के साथ किया जाना चाहिए, क्योंकि बालक नाजुक है और इस कोरोनरी धमनी को तोड़ रहा है और पूर्वकाल की दीवार मृत्यु दर का कारण बनजाएगी(चित्रा 1ई)। सर्जरी पूरी होने के 5-10 मिनट के भीतर नवजात को जीवंत होना चाहिए और सामान्य रूप से सांस लेना चाहिए।

निष्क्रिय स्पष्टता प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ते समय, एक माउस लाइन से काटा गया दिल जो सेल वंश ट्रेसिंग के लिए एक एंडोजेनस फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को शामिल करता है, प्रकाश(चित्रा 2)से संरक्षित किया जाना चाहिए, जिसे एल्यूमीनियम पन्नी में ग्लास शीशी लपेटकर पूरा किया जा सकता है। समाशोधन चरण के दौरान, समाशोधन समाधान में इनक्यूबेटिंग समय माउस की उम्र के आधार पर चर है जब दिल काटा गया था। यह कदम तब पूरा हो जाता है जब पूरे ऊतक लगातार अपारदर्शी हो जाते हैं, केंद्र में कोई मलिनकिरण नहीं है(चित्रा 2बी-सी)। दिल कुछ दिनों के लिए कमरे के तापमान पर रिम्स समाधान में भंडारण के बाद तेजी से पारदर्शी हो जाएगा(चित्रा 2डी)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि समाशोधन प्रक्रिया के दौरान ऊतक विस्तार हो सकता है।

हमारा निष्क्रिय स्पष्टता प्रोटोकॉल प्रभावी एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देता है और इस प्रकार प्रोटीन (एस) ब्याज के लेबल के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विधियों के साथ संगत है। यह Actl6bCreमें मान्य किया गया था; Rosa26tdT ट्रांसजेनिक चूहों, जो tdTomato (tdT) रिपोर्टर प्रोटीन के साथ परिपक्व न्यूरॉन्स लेबल । हृदय तंत्रिकाएं मुख्य रूप से सतही हैं, कुछ आबादी के साथ एपिकार्डियल परत में रहने वाले हैं, इसलिए हमने इस सेल आबादी का उपयोग एंडोजेनस रिपोर्टर सिग्नल(चित्रा 3ए)के प्रजनन के लिए एक प्रमाण-प्रमुख मॉडल के रूप में किया, साथ ही स्पष्टता से पहले और बाद में रिपोर्टर प्रोटीन संरचना का संरक्षण(चित्रा 3बी-सी)। हमारे प्रतिनिधि Actl6bCreसे परिणाम; Rosa26tdT चूहों से पता चलता है कि एक अस्पष्ट P7 दिल की नसों में देखा अंतर्जात टीडी प्रोटीन संकेत ईमानदारी से दोनों अस्पष्ट और मंजूरी दे दी टीडी इम्यूनोलेबल P7 दिल(चित्रा 3)की नसों में recapitulated था । इम्यूनोलेबल टीडीटी-पॉजिटिव नसों को इम्यूनोलेबल करने के लिए, एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश पॉलीक्लोनल; 1:200 कमजोर पड़ने; रॉकलैंड #600-401-379) का उपयोग एलेक्सा फ्लोर 488 द्वितीयक एंटीबॉडी (बकरी पॉलीक्लोनल; 1:1000 कमजोर पड़ने के साथ किया गया था; इनविट्रोजन #A-11008) । इम्यूनोस्टेनिंग और इमेजिंग स्टेप्स के दौरान आंखों से साफ दिल की कल्पना करने के लिए, एक पराबैंगनी टॉर्च संक्षेप में दिल को रोशन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (LAD) के कोरोनरी धमनी Occlusion के माध्यम से नवजात माउस में Myocardial Infarction का प्रेरण । (क)एक ही तारक (*) द्वारा इंगित चौथा इंटरकोस्टल स्पेस स्थित है और एक कुंद विच्छेदन किया जाता है। (ख)छाती गुहा से दिल का मार्गदर्शन करने के लिए बाएं पेट पर दबाव डाला जाता है। (ग)बालक, एक डबल तारक (**) द्वारा चिह्नित, प्रमुख धमनी और शारीरिक स्थिति के रूप में पहचानकी जाती है । (D, ई) एक सीवन तो बालक के पीछे पारित कर दिया है और एक वर्ग गांठ बालक के चारों ओर बंधा हुआ है एक कोरोनरी धमनी occlusion और बाद में infarct प्रेरित करते हैं । (ई)एक बार पूरा हो जाने के बाद, दिल के शीर्ष पर, सीवन के नीचे ब्लैंचिंग देखी जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक P14 माउस हार्ट पर निष्क्रिय स्पष्टता विधि की प्रगति । दिल P14 चूहों से काटा गया था,(ए)तय है, और(बी-डी)निष्क्रिय स्पष्टता प्रोटोकॉल से गुजरना पड़ा । P14 टाइमपॉइंट पर लिए गए दिलों के लिए, क्लियरिंग सॉल्यूशन इन्क्यूबेशन स्टेप(बी)अधूरा है जब दिल के केंद्र में मलिनकिरण स्पष्ट है, 6 दिनों के बाद देखा जाता है, और(C)पूरा होता है जब दिल समान रूप से अपारदर्शी दिखाई देता है, 10 दिनों के बाद देखा जाता है। (D)रिम्स में दिल जमा होने के बाद टिश्यू पूरी तरह से साफ हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: संफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ P7 माउस हार्ट्स की पूरी माउंट 3डी इमेजिंग। P7 Actl6bक्रेसे प्रतिनिधि पूरे माउंट 3 डी छवियां; Rosa26tdT ट्रांसजेनिक चूहों दिलजेड-खड़ी छवियों की अधिकतम तीव्रता अनुमानों के रूप में दिखाया गया है। दिल ों को दिखाने के लिए इमेज्ड थे(ए)अंतर्जात टीडीटोमैटो (टीडीटी) फ्लोरेसेंस सीधे कटाई के बाद (लाल)(बी)एक अस्पष्ट दिल में टीडीटी-पॉजिटिव नसों का इम्यूनोस्टेनिंग (एलेक्सा फ्लोर ४८८; ग्रीन) और(सी)एक स्पष्ट दिल (एलेक्सा फ्लोर ४८८; ग्रीन) में टीडीटी-पॉजिटिव नसों की प्रजनन अमुनोलेबलिंग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र4: 3डी मुद्रित पॉलीप्रोपाइलीन डिप्रेशन स्लाइड। प्रसवोत्तर हृदय के नमूनों को चित्रित करने के लिए, कस्टम अवसाद स्लाइड पॉलीप्रोपाइलीन पर 3 डी मुद्रित किए गए थे। स्लाइड आयाम 25 मिमी x 75 मिमी x 1 मिमी हैं, जिसमें स्लाइड डिप्रेशन व्यास में 13 मिमी और या तो(ए)6.5 मिमी या(बी)17 मिमी गहराई में है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

उपकरण प्रकार विवरण कंपनी कैटलॉग नंबर
ग्लास शीशी कैप के साथ 12 x 35mm शीशी फिशरब्रांड 03-339-26A
6-0 प्रोलीन टांके पॉलीप्रोपाइलीन टांके एथिक्सन 8889H
तेज संदंश ठीक टिप, सीधे, 4.25 में सिग्मा-अड्रिच Z168777
ड्रेसिंग फोर्सप्स विच्छेदन, 4.5 में फिशरब्रांड 13-812-39
सुई धारक मेयो-हेगर, 6 में फिशरब्रांड 08-966
छोटे विच्छेदन कैंची 30 मिमी अत्याधुनिक वाल्टर स्टर्न इंक 25870-002
ऊतक संदंश मध्यम ऊतक, 1X2 दांत एक्सेल्टा 16050133
बड़े विच्छेदन कैंची सीधे, 6 में फिशरब्रांड 08-951-20
इरिडेस्टोमी कैंची 2 मिमी अत्याधुनिक ललित विज्ञान उपकरण 15000-03
घुमावदार संदंश आधा घुमावदार, सेरेटेड, 4 में एक्सेल्टा 16-050-146

तालिका 1: सर्जिकल उपकरण।

क्लीयरिंग सॉल्यूशन
अभिकर्मक अंतिम राशि नोट्स
सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडी) 8.0% w/v 40 ग्राम
बोरिक एसिड 1.25% w/v 6.25 ग्राम
1-थिओग्लिसेरोल 0.5% w/v 5 माइक्रोन/एमएल समाधान के लिए आवश्यक के रूप में जोड़ा
1 एल बीकर के लिए अल्ट्राप्योर एच20 के 400 मिलीलीटर जोड़ें। चुंबकीय सरगर्मी के साथ एसडीएस और बोरिक एसिड में मिलाएं।
6M NaOH का उपयोग कर 8.5 पीएच समायोजित करें। 500 मिलीलीटर और ऑटोक्लेव के लिए मात्रा लाओ।
कमरे के तापमान पर स्टोर समाधान।
अन्य स्पष्टता अभिकर्मक
अभिकर्मक अंतिम भंडार नोट्स
पीएफए 4.0% 16% पीबीएस में पतला
एक्रिलैमाइड 4.0% 40% पीबीएस में पतला
वीए-044 0.5% 10% समाधान के लिए आवश्यक के रूप में जोड़ा

तालिका 2: क्लियरिंग सॉल्यूशन और अन्य स्पष्टता अभिकर्मक।

अभिकर्मक अंतिम राशि
फॉस्फेट बफर 0.02 मीटर 90 करोड़
हिस्टोडेन्ज़ 133.3% w/v 120 ग्राम
सोडियम अजाइड 0.05% w/v 45 मिलीग्राम
एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे 250 मीटर ग्लास मीडिया बोतल में 0.02 एम फॉस्फेट बफर के 90 मिलीएल जोड़ें।
चुंबकीय सरगर्मी के साथ सूचीबद्ध अभिकर्मकों में मिलाएं। घटकों को रातोंरात भंग करने की अनुमति दें।
भंवर समाधान और फिल्टर एक बाँझ 250 मीटर ग्लास मीडिया की बोतल में छानने का काम प्रणाली के साथ शुद्ध।
एल्यूमीनियम पन्नी में बोतल लपेटें और कमरे के तापमान पर स्टोर समाधान।

तालिका 3: अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान (रिम्स) ।

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Discussion

कार्डियोमायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट आबादी के बीच सेल-सेल बातचीत इस बात का एक निर्धारण कारक है कि क्या दिल को चोट के बाद फाइब्रोसिस या मरम्मत से गुजरना होगा। खोजों का प्रदर्शन किया गया है कि कोशिका प्रकार की एक किस्म, नसों14सहित, एपिकार्डियल कोशिकाओं24,पेरिटोनियल मैक्रोफेज25,आर्टेरियोल12,,13,और लिंफेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं26,सभी हृदय की मरम्मत मध्यस्थता में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं । इन सेल वंशों और ब्याज के अन्य लोगों को चूहों में क्रे-लोक्स और CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकियों को लागू करके विकास, रोग और उत्थान के दौरान आनुवंशिक रूप से पता लगाया जा सकता है। जब अंग समाशोधन और उन्नत माइक्रोस्कोपी विधियों के साथ मिलकर, गैर-मायोसाइट आबादी के योगदान का सही आकलन किया जा सकता है, चोट के बाद मायोकार्डियल पुनर्जनन के सेलुलर और आणविक लक्ष्यों को स्पष्ट करने के लिए दरवाजा खोलना।

प्रोटोकॉल की दक्षता कोरोनरी धमनी ऑक्सीकरण सर्जरी के दौरान एलएडी के सुसंगत और प्रजनन योग्य लिगेशन पर निर्भर है। नवजात चूहों हाइपोथर्मिया के लिए विस्तारित जोखिम के प्रति संवेदनशील हैं; इस प्रकार, सर्जरी न केवल सटीकता के साथ किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी मिनट के भीतर । शुरू से खत्म करने के लिए, मायोकार्डियल इंफेक्शन सर्जरी में 8 मिनट से भी कम समय लगना चाहिए। हम प्रवीणता प्राप्त होने तक प्रयोगात्मक चूहों के रूप में एक ही पृष्ठभूमि के कई कूड़े पर पहले अभ्यास करने की सलाह देते हैं।

कार्डियक रिपेयर की प्रगति का आकलन हृदय समारोह को मापने के लिए इकोकार्डियोग्राफी (यानी आंशिक छोटा, रिजेक्शन अंश, सिस्टोलिक और डायस्टोलिक वॉल्यूम) को मापने के लिए इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके किया जा सकता है, एक बार सर्जरी के बाद 3 से 7 दिनों के भीतर और फिर से दिल की कटाई से कुछ ही समय पहले , 21 और 28 दिनों के बाद चोट के बीच सुझाव दिया । हृदय मायोकार्डियल इंफेक्शन सर्जरी के बाद कई समय बिंदुओं पर समाशोधन के लिए एकत्र किया जा सकता है।

समाशोधन चरण (चरण 2.17) उस माउस की उम्र और तनाव के आधार पर अवधि में भिन्नता के अधीन है जिससे दिल काटा गया था, जिसके परिणामस्वरूप हृदय के आकार में अंतर हो सकता है। B6 पृष्ठभूमि माउस के लिए, आयु के आधार पर समाशोधन अवधि का अनुमान इस प्रकार है: P1 (7-10 दिन), P7 (14-17 दिन), P14 (21-24 दिन), P21 (28-31 दिन), P28 (35-38 दिन)। हालांकि हमारी प्रयोगशाला का प्राथमिक ध्यान दिल समाशोधन है, हमारे निष्क्रिय स्पष्टता विधि चूहों फेफड़ों (अप्रकाशित परिणाम) समाशोधन के लिए सफल रहा है और हम मोटे तौर पर अंय अंगों के लिए इस लागू करने पर कोई सीमा की उंमीद है । कुल मिलाकर, हमारी त्वरित समाशोधन प्रक्रिया ऊतकों को तेजी से और प्रभावी ढंग से स्पष्ट करने की क्षमता के लिए अत्यधिक मूल्यवान है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दुर्लभ उपआबादी में अंतर्जात संवाददाताओं के साथ अंगों में ऊतक समाशोधन तकनीकों को लागू करते समय जटिलताएं उत्पन्न हो सकती हैं। घने सेल आबादी में रिपोर्टर संकेत (जैसे myocytes23)समाशोधन प्रक्रिया के लिए अधिक प्रतिरोधी लगते हैं और इस प्रकार संकेत आम तौर पर बनाए रखा जाता है; हालांकि, अन्य अधिक संवेदनशील सेल आबादी (जैसे हृदय तंत्रिकाएं) लंबे समय तक निर्धारण या समाशोधन के बाद एंडोजेनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन सिग्नल बुझाने की संभावना होती है। यह एक्टल6बीक्रेमें स्पष्ट हो गया ; Rosa26tdT रिपोर्टर माउस मॉडल, जहां P7 दिल 15 मिनट के लिए संक्षेप में तय मजबूत टीडीटी संकेत(चित्रा 3ए)दिखाया, लेकिन इस फ्लोरोसेंट संकेत समाशोधन समाधान में 1 घंटे या रात भर ऊष्मायन के लिए निर्धारण के बाद बुझा दिया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया) । खो रिपोर्टर संकेत के परिदृश्य में, एंटीबॉडी धुंधला रिपोर्टर प्रोटीन को लक्षित करने के लिए संकेत बढ़ाना ऊतक समाशोधन के साथ संगत है(चित्रा 3)। एक इम्यूनोलेबलिंग कदम के अलावा व्यापक इमेजिंग के दौर से गुजर ऊतकों के लिए लाभप्रद हो सकता है, के रूप में conjugated एंटीबॉडी ब्लीच प्रतिरोधी है और स्थिर, दीर्घकालिक अभिव्यक्ति का उत्पादन । प्रोटीन को अंतर्जात रूप से और इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से ट्रैक करने की क्षमता के साथ, हमारा प्रोटोकॉल विशिष्ट रूप से दुर्लभ हृदय कोशिका आबादी के सटीक स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है जो दिल के भीतर गहरे रहते हैं।

क्लीयर किए गए दिल पूरे माउंट 3डी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वंश ट्रेसिंग या फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से गुजर सकते हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप लेजर लाइनों से लैस है जो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स (या कंजुगेड सेकेंडरी एंटीबॉडी) को उत्तेजित करने के लिए अनुकूलित है, उदाहरण के लिए: बीएफपी (डीपीआई, एलेक्सा फ्लोर 405), ईजीएफपी (फिटैक, एलेक्सा फ्लोर 488), डीएसरेड (TRITC, एलेक्सा फ्लोर 546/555), और एपीसी (Cy5, Alexa Fluor 647) पर 405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम, और 683 एनएम, क्रमशः। दिल के नमूनों के लिए एक अवसाद स्लाइड में फिट करने में असमर्थ - आम अगर दिल प्रसवोत्तर काटा - पॉलीप्रोपाइलीन पर 3 डी प्रिंटिंग द्वारा एक कस्टम अवसाद स्लाइड बनाया जा सकता है। कस्टम स्लाइड एक माइक्रोस्कोप अवसाद स्लाइड (25 मिमी x 75 मिमी x 1 मिमी) के आयामों के बाद, या तो 6.5 मिमी या 17 मिमी(चित्रा 4)के लिए अच्छी तरह से गहराई बदलती है।

3 डी में रिपोर्टर सेल लाइनों की कल्पना करने के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पूरे दिल में जेड-स्टैक्ड छवियों को प्राप्त करने के लिए तैयार है। बड़े दिलों की इमेजिंग करते समय, पूरे दिल को कम आवर्धन उद्देश्य के साथ भी एक जेड-स्टैक ्ड छवि में कब्जा नहीं किया जा सकता है। इस परिदृश्य में, विभिन्न हृदय क्षेत्रों में ली गई कई जेड-स्टैक वाली छवियों की एक श्रृंखला को एक बड़ी छवि समारोह का उपयोग करके एक साथ सिला जा सकता है। यह उचित उद्देश्य लेंस के लिए माइक्रोस्कोप अंशांकन और बड़ी छवि स्कैन क्षेत्र के लिए क्षेत्र निर्दिष्ट द्वारा पूरा किया जाता है । फिर, जेड-स्टैक वाली छवियां वॉल्यूम प्रतिपादन कार्यक्रम और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण(चित्रा 3)का उपयोग करके 3डी पुनर्निर्माण से गुजरती हैं। प्राप्त उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का विश्लेषण लक्षित सेल आबादी के सटीक 3 डी स्थानिक सेल पैटर्निंग को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

सामूहिक रूप से, यह प्रोटोकॉल हृदय की मरम्मत और उत्थान के दौरान होने वाले गतिशील सेलुलर परिवर्तनों को समझने के लिए एक शक्तिशाली आणविक उपकरण प्रदान करता है। यह विधि एक मायोकार्डियल इंफेक्शन को प्रेरित करने, पूरे अंग समाशोधन करने, सेल विशिष्ट आबादी का पता लगाने और 3 डी सेल पैटर्निंग का विश्लेषण करने के चरणों का वर्णन करती है। एक साथ, ये तकनीकें कोशिका आबादी का पता लगाने तक पहुंच प्रदान करती हैं जो ऊतक के भीतर उनकी विरल उपस्थिति या स्थान के कारण पहले दुर्गम थीं। यह पुनर्योजी चिकित्सा में चिकित्सीय दृष्टिकोणों को आगे बढ़ाने के लिए सर्वोपरि प्रश्नों की आगे की जांच में सक्षम होगा, विशेष रूप से अंतर्जात हृदय उत्थान को उत्तेजित करने के उद्देश्य से ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए वित्तपोषण यूडब्ल्यू स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड पब्लिक हेल्थ द्वारा विस्कॉन्सिन पार्टनरशिप प्रोग्राम (एआईएम) और एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड 19CDA34660169 (A.I.M.) से प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures Ethicon 8889H Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps Excelta 16-050-146 Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps Fisherbrand 13-812-39 Dissecting, 4.5 in
Glass Vial Fisherbrand 03-339-26A 12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz Sigma-Aldrich Density gradient medium
Iridectomy Scissors Fine Science Tools 15000-03 2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors Fisherbrand 08-951-20 Straight, 6 in
Needle Holder Fisherbrand 08-966 Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps Sigma-Adrich Z168777 Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor Walter Stern Inc 25870-002 30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps Excelta 16050133 Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044 Wako Chemicals Water-soluble azo initiator

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 157 मायोकार्डियल इंफेक्शन हृदय उत्थान ऊतक समाशोधन वंश ट्रेसिंग 3 डी इमेजिंग नवजात माउस
मंजूरी दे दी दिल तीन आयामी इमेजिंग के माध्यम से लक्षित सेल आबादी के हृदय चोट प्रतिक्रिया पर कब्जा
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Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud,… More

Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60482, doi:10.3791/60482 (2020).

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