Summary
La proliferazione cardiomiocite a seguito di lesioni è un processo dinamico che richiede una sinfonia di segnali extracellulari da popolazioni di cellule non miociti. Utilizzando il tracciamento del lignaggio, il CLARITY passivo e le tecniche di microscopia confocale a cavalcatura integrale tridimensionale, possiamo analizzare l'influenza di una varietà di tipi di cellule sulla riparazione e rigenerazione cardiaca.
Abstract
La malattia cardiovascolare supera tutte le altre cause di morte ed è responsabile di uno sconcertante 31% dei mortali in tutto il mondo. Questa malattia si manifesta in lesioni cardiache, principalmente sotto forma di un infarto miocardico acuto. Con poca resilienza dopo un infortunio, il tessuto cardiaco una volta sano sarà sostituito da tessuto cicatriziale fibroso e non contrattuale e spesso sarà un preludio all'insufficienza cardiaca. Per identificare nuove opzioni di trattamento nella medicina rigenerativa, la ricerca si è concentrata sui vertebrati con capacità rigenerative innate. Uno di questi organismi modello è il topo neonato, che risponde alle lesioni cardiache con robusta rigenerazione miocardiale. Al fine di indurre una lesione nel topo neonatale che è clinicamente rilevante, abbiamo sviluppato un intervento chirurgico per occludono l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), rispecchiando un'infarzione miocardiale innescata dall'aterosclerosi nel cuore umano. Se abbinato alla tecnologia per monitorare i cambiamenti sia all'interno di cardiomiociti che di popolazioni non miociti, questo modello ci fornisce una piattaforma per identificare i meccanismi che guidano la rigenerazione del cuore. Ottenere informazioni sui cambiamenti nelle popolazioni di cellule cardiache a seguito di lesioni una volta si è basato pesantemente su metodi come il sezionamento dei tessuti e l'esame istologico, che sono limitati all'analisi bidimensionale e spesso danneggiano il tessuto nel processo. Inoltre, questi metodi non sono in grado di tracciare i cambiamenti nei lignaggi cellulari, fornendo invece semplicemente un'istantanea della risposta alle lesioni. Qui, descriviamo come i metodi tecnologicamente avanzati nei modelli di tracciamento del lignaggio, nella cancellazione di organi interi e nella microscopia tridimensionale (3D) a montaggio intero possono essere utilizzati per chiarire i meccanismi di riparazione cardiaca. Con il nostro protocollo per la chirurgia dell'infarto miocardico del topo neocardico, la compensazione dei tessuti e l'imaging dell'intero organo 3D, i percorsi complessi che inducono la proliferazione cardiomiocita possono essere svelati, rivelando nuovi obiettivi terapeutici per la rigenerazione cardiaca.
Introduction
Il cuore è stato a lungo considerato un organo post-mitotico, ma prove recenti dimostrano che il rinnovamento cardiomiocito si verifica nel cuore umano adulto a circa 1% all'anno1. Tuttavia, questi bassi tassi di avvicendamento cardiomiocito sono insufficienti per ricostituire la massiccia perdita di tessuto che si verifica dopo lesioni. Un cuore che ha subito un infarto miocardico perderà circa un miliardo di cardiomiociti, spesso servendo come preludio all'insufficienza cardiaca e morte cardiaca improvvisa2,3. Con oltre 26 milioni di persone affette da insufficienza cardiaca in tutto il mondo, c'è un bisogno insoddisfatto di terapie che possono invertire i danni inflitti da malattie cardiache4.
Al fine di colmare questa lacuna nelle terapie, gli scienziati hanno iniziato a studiare meccanismi evolutivamente conservati che sono alla base della rigenerazione endogena a seguito di lesioni. Un modello per studiare la rigenerazione cardiaca dei mammiferi è il topo neoooatale. Entro la settimana successiva alla nascita, i topi neonatali hanno una robusta risposta rigenerativa in seguito a danni cardiaci5. Abbiamo dimostrato in precedenza che i topi neotossici possono rigenerare il loro cuore attraverso la proliferazione cardiomiocite a seguito di una resezione apicale5. Anche se questa tecnica può evocare la rigenerazione cardiaca nei neonati, l'intervento chirurgico manca di rilevanza clinica per le lesioni cardiache umane. Al fine di imitare una lesione umana nel modello murino neonatale, abbiamo sviluppato una tecnica per indurre un infarto miocardico attraverso un'occlusione coronaria6. Questa tecnica richiede la legatura chirurgica dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), che è responsabile della consegna 40-50% del sangue al miocardico ventricolare sinistro6,7. Così, l'intervento chirurgico si traduce in un infarto che colpisce una parte significativa della parete ventricolare sinistra. Questo danno al miocardio stimolerà la proliferazione cardiomiocita e la rigenerazione del cuore nei neonati5.
La chirurgia dell'occlusione coronaria fornisce un metodo altamente riproducibile e direttamente traslazionale per scoprire il funzionamento interno della rigenerazione cardiaca. La chirurgia neonatale parallela all'aterosclerosi coronaria nel cuore umano, dove l'accumulo di placca all'interno delle pareti interne delle arterie può causare un'occlusione e la successiva infarto miocardico8. A causa di un vuoto nei trattamenti terapeutici per i pazienti con insufficienza cardiaca, un'occlusione nel LAD è associata a tassi di mortalità che raggiungono fino al 26% entro un anno dopo la lesione9, e di conseguenza è stato definito il "fabbricante di vedove". I progressi nelle terapie richiedono un modello che rifletta con precisione i complessi effetti fisiologici e patologici delle lesioni cardiache. Il nostro protocollo chirurgico per lesioni cardiache del topo neooatale fornisce una piattaforma che consente ai ricercatori di studiare gli spunti molecolari e cellulari che segnalano la rigenerazione cardiaca dei mammiferi dopo l'infortunio.
Recenti ricerche evidenziano la relazione dinamica tra l'ambiente extracellulare e i cardiomiociti che proliferano. Ad esempio, la finestra rigenerativa postnatale può essere estesa diminuendo la rigidità della matrice extracellulare che circonda il cuore10. I biomateriali della matrice extracellulare neooooordinata possono anche promuovere la rigenerazione del cuore nei cuori dei mammiferi adulti dopo lesioni cardiache11. Anche la proliferazione cardiomiocite di accompagnamento è una risposta angiogenica12,13; formazione arteria collaterale unica per il cuore rigenerante del topo neonatale ha dimostrato di essere essenziale per stimolare la rigenerazione cardiaca12. Inoltre, il nostro laboratorio ha dimostrato che la segnalazione del nervo regola la proliferazione cardiomiocita e la rigenerazione del cuore attraverso la modulazione dei livelli dei fattori di crescita, così come la risposta infiammatoria a seguito di lesioni14. Questi risultati sottolineano la necessità di tracciare le popolazioni di cellule non miocite in risposta a lesioni cardiache. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sfruttato il sistema di ricombinazione Cre-lox in linee di topi transgenici per incorporare l'espressione coniugale o condizionale di proteine reporterfluescenti per la tracciatura del lignaggio. Inoltre, possiamo usare metodi avanzati per determinare il pattern di espansione clonale con la linea del mouse Arcobaleno, che si basa sull'espressione stocastica dei reporter fluorescenti multicolore dipendenti da Cre per determinare l'espansione clonale delle popolazioni di cellule mirate15. L'utilizzo del tracciamento del lignaggio con la chirurgia occlusione coronaria neonatale è un potente strumento per sezionare gli intricati meccanismi cellulari della rigenerazione cardiaca.
Monitorare il lignaggio delle cellule etichettate fluorescentmente con immagini di organi interi tridimensionali (3D) è difficile da ottenere utilizzando la tecnica tradizionale di sezionamento e ricostruzione, soprattutto quando le popolazioni di cellule sono fragili, come le fibre nervose o i vasi sanguigni. Mentre l'imaging diretto dell'intero montaggio dell'organo mediante sezionamento ottico può catturare le popolazioni di cellule superficiali, le strutture che risiedono in profondità all'interno del tessuto rimangono inaccessibili. Per aggirare queste barriere, sono state sviluppate tecniche di compensazione dei tessuti per ridurre l'opacità di interi tessuti dell'organo. Recentemente, sono stati fatti progressi significativi per i metodi basati su acdovesione compatibile con Acrylamide- Rigid Imaging compatibile Con Privo HYdrogel (CLARITY), che cancellano il tessuto fisso tramite estrazione lipidica16. Vengono inoltre adottate misure per omogeneizzare l'indice di rifrazione e successivamente ridurre la dispersione della luce durante l'imaging17. Uno di questi metodi è CLARITY attivo, che accelera la decomposizione dei lipidi utilizzando l'elettroforesi per penetrare il detersivo in tutto il tessuto18. Anche se efficace, questo metodo di compensazione dei tessuti richiede attrezzature costose e può causare danni ai tessuti, rendendo l'approccio incompatibile con le popolazioni cellulari fragili come i nervi cardiaci19. Così, impieghiamo l'approccio passivo CLARITY, che si basa sul calore per facilitare delicatamente la penetrazione del detergente, aiutando quindi nella conservazione di strutture cellulari intricate20,21.
Il CLARITY passivo è tipicamente pensato per essere meno efficiente di QUELLO attivo CLARITY18, in quanto la tecnica è spesso accompagnata da due ostacoli principali: l'incapacità di cancellare l'intera profondità dell'organo e l'ampia quantità di tempo necessaria per cancellare i tessuti adulti. Il nostro approccio passivo CLARITY supera entrambe queste barriere con un processo di compensazione accelerato che è in grado di eliminare completamente il tessuto cardiaco neooatale e adulto. La nostra tecnica passiva di compensazione dei tessuti CLARITY ha raggiunto un'efficienza che permette la visualizzazione di una varietà di popolazioni di cellule cardiache, tra cui popolazioni rare distribuite in tutto il cuore adulto. Quando il cuore sgomberato è immaginato con microscopia confocale, l'architettura di patterning specifici delle cellule durante lo sviluppo, la malattia e la rigenerazione può essere illuminata.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per l'uso e la cura degli animali da laboratorio e in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee presso la School of Medicine and Public Health dell'Università del Wisconsin-Madison. Tutti i metodi sono stati eseguiti su wild tipo C57BL/6J (B6) e linee di mouse transgenici ottenute da Jackson Laboratories.
1. Occlusione coronaria Arteria (Infarzione miocardiale) Indotta tramite la legatura dell'Arteria Discendente Anteriore Sinistra (LAD) in Topi Neonatale di 1 giorno6
- Separare i cuccioli neonatale di 1 giorno dalla madre mettendoli in una gabbia pulita insieme ad alcuni dei materiali di nidificazione originali.
- Posizionare metà della gabbia su un pad di riscaldamento impostato a fuoco medio. I cuccioli devono rimanere sul lato non riscaldato della gabbia, essendo collocati solo sul lato riscaldato dopo l'intervento chirurgico.
- Creare un'area chirurgica sterile al microscopio operativo. Raccogliere apparecchiature chirurgiche sterilizzate (Tabella 1).
- Anestesizzare il cucciolo tramite ipotermia: avvolgere il cucciolo in garza per evitare il contatto diretto della pelle con il ghiaccio e seppellirlo in un letto di ghiaccio per circa 3-4 min. Controllare periodicamente l'ipotermia dei topi eseguendo un pizzico di punta. I neonati tollerano bene l'ipotermia, tuttavia, l'esposizione prolungata all'ipotermia può provocare congelamento e mortalità successiva.
- Una volta anetizzato, posizionare il mouse sull'area chirurgica in posizione supina, fissando le braccia e le gambe con del nastro adesivo. Sterilizzare l'area chirurgica del topo con una soluzione antisettica.
- Individuare la regione inferiore del torace e fare un'incisione trasversale nella pelle con piccole forbici dissettive. Per allargare la vista chirurgica delle costole, separare la pelle dal muscolo sollevando delicatamente la pelle con un paio di pinze spogliatoie e premere delicatamente contro i muscoli intercostali con le piccole forbici in posizione chiusa.
- Individuare il quarto spazio intercostale (Figura 1A) e fare una piccola puntura superficiale utilizzando pinze affilate, facendo attenzione a non forare gli organi interni. Eseguire una dissezione smussata allargando l'area tra i muscoli intercostali con le pinze di vestire. Un corretto posizionamento anatomico dell'incisione è essenziale per un adeguato accesso al cuore.
- Guidare delicatamente il cuore dalla cavità toracica posizionando un dito e applicando una pressione crescente sul lato sinistro dell'addome tenendo lo spazio intercostale aperto con pinze da spogliatoio (Figura 1B). Una volta che il cuore è fuori dal petto, rimuovere le pressioni medicazione, alleviare la pressione, e lasciare riposare il cuore sui muscoli intercostali.
- Individuare il LAD come l'area del cuore che ha meno sangue raggruppato ed è nella posizione anatomica corretta (Figura 1C). Il LAD può essere visto solo al microscopio se il cuore è accessibile entro pochi minuti dall'inizio dell'intervento chirurgico.
- Eseguire la legatura LAD suturando il LAD con una sutura 6-0 (Figura 1D). Legare due volte un nodo quadrato per indurre l'infarto miocardico (Figura 1E). La profondità della sutura nel miocardio può variare, tuttavia, il corretto posizionamento anatomico della legatura LAD è fondamentale per la riproducibilità. Quando si lega il LAD, la sutura deve essere tirata con attenzione ma con attenzione in modo da non recidere il LAD. Sbiancamento all'apice del cuore sarà visto immediatamente (Figura 1E)
- Lasciare che il cuore scivoli di nuovo nella cavità toracica; questo processo può essere facilitato delicatamente con pinze di medicazione. Suturare le costole insieme a un nodo del chirurgo seguito da un nodo quadrato, utilizzando pinze smussate per sollevare l'insieme superiore delle costole mentre si passa una sutura 6-0 attraverso la parte superiore e inferiore di costole.
- Rimuovere il nastro che è stato utilizzato per fissare le zampe posteriori del cucciolo.
- Aderire la pelle insieme mettendo una piccola quantità di colla della pelle sull'addome superiore. Quindi, afferrare la pelle dell'addome inferiore con pinze sottili e coprire la regione del torace esposta. Limitare la quantità di colla in eccesso che rimane sui cuccioli, in quanto questo può aumentare la probabilità di rigetto e cannibalismo da parte della madre.
- Facilitare immediatamente il recupero dall'anestesia posizionando il cucciolo su un pad di riscaldamento impostato a calore medio. Periodicamente cambiare il posizionamento dei neonati per riscaldare uniformemente tutte le parti del corpo.
- Lasciare che il neonato rimanga direttamente sul pad di riscaldamento per 10-15 min. In genere, il movimento viene riacquistato entro 5 minuti dall'essere messo a fuoco.
- Pulire il sangue residuo e incollare con una salvietta alcolica.
- Coprire i profumi stranieri sui neonati strofinando l'intero corpo con biancheria da letto dalla gabbia originale. Posizionare il cucciolo nella gabbia sul lato riscaldato mentre vengono eseguiti altri interventi chirurgici.
- Una volta completati tutti gli interventi chirurgici e i cuccioli sono caldi e mobili, trasferisci la lettiera insieme al materiale di nidificazione originale nella gabbia della madre.
- Monitorare i topi per 30-60 min dopo l'intervento chirurgico e guardare per l'accettazione della madre dei cuccioli da nidificazione e/o toelettatura.
- Controllare i topi la mattina dopo l'intervento chirurgico. Se la madre è in difficoltà e non ha annidato i cuccioli, prendere in considerazione una madre affidataria per i cuccioli.
2. Cancellazione del cuore del mouse con CLARITY passivo21,22,23
- Anestesizzare il topo con isoflurane. Eseguire un pizzico di punta per assicurarsi che il mouse sia completamente sedato.
- Posizionare il mouse su un'area pulita e chirurgica in posizione supina, fissando le braccia e le gambe con del nastro adesivo.
- Mantenere la sedazione isoflurano sul mouse utilizzando un cono naso fino a quando il cuore viene estratto.
- Aprire il torace inferiore tenendo la pelliccia appena sotto il processo xifoide con pinze tissutali e fare un'incisione che si estende la larghezza della gabbia toracica utilizzando le grandi forbici dissettive.
- Tagliare a fianco delle porzioni distale della gabbia toracica con forbici chirurgiche.
- Esporre il muscolo del diaframma afferrando il processo xifoide con pinze tissutali. Staccare il diaframma utilizzando pinze curve.
- Pur mantenendo una presa del processo xifoideo, tirare il tessuto cranicamente fino a quando il cuore pulsante è accessibile.
- Afferra il cuore alla base con pinze curve e seziona il cuore dalla cavità toracica tagliando l'aorta e la vena cava superiore con forbici iridectomia.
- Mentre il cuore batte ancora, posiziona il cuore in un piatto Petri pieno di PBS in modo che il cuore pompa il sangue all'interno mentre continua a battere. L'infarto miocardico può essere confermato controllando che il posizionamento della sutura sia nella giusta posizione anatomica per la legatura LAD.
- Stringere delicatamente il cuore con le pinze per consentire al cuore di espellere il sangue residuo.
- Trasferire il cuore del mouse in una fiala di vetro usa e getta da 2,5 mL con 2 mL di PBS. Lavare via il sangue residuo incubando il cuore su uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) più volte. Modificare la soluzione PBS ogni volta fino a quando PBS rimane chiaro.
- Scartare il PBS e riempire la fiala con 2 mL di freddo 4% paraformaldeide (PFA). Incubare per 4 ore a RT (Figura 2A).
- Dopo l'incubazione, scartare il PFA e la fiala con 2 mL di PBS. Lavare il cuore su uno shaker per 10 minuti a RT. Ripetere due volte il passaggio di lavaggio, drenando e riempiendo la fiala con nuova PBS ogni volta per lavare completamente via l'eccesso di PFA.
- Scartare PBS e riempire la fiala con 2 mL del 4% acrilammide e 0,5% della soluzione VA-044. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
- Il giorno successivo, eseguire la polimerizzazione trasferendo la fiala in un blocco di calore fissato a 37 gradi centigradi per 3 ore.
- Trasferire il cuore in una nuova fiala di guscio di vetro e ripetere il passaggio 2.12 (ciclo di lavaggio PBS).
- Scartare PBS e riempire la fiala con 2 mL di Soluzione di compensazione (Tabella 2). Incubare a 37 gradi centigradi fino a quando il cuore non viene eliminato. Cambia la soluzione e ricaricala con una soluzione di compensazione fresca ogni 2-3 giorni. Il processo di cancellazione potrebbe richiedere diverse settimane (Figura 2B-C).
NOTA: i cuori P1 in genere richiedono circa 3-5 giorni, mentre i cuori P21 possono richiedere quasi un mese prima che l'incubazione della soluzione di compensazione sia completa. - Scartare PBS e riempire la fiala con 2 mL di PBS e ripetere il passaggio 2.12 (ciclo di lavaggio PBS). Riempire la fiala con PBS fresco e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi.
- Se verrà eseguita l'immunostaining, saltare i passaggi 2.21–2.22 e passare alla Sezione 3 per l'immunostaining. Se si basa esclusivamente sulla fluorescenza endogena, procedere con i passaggi 2.21–2.22 e saltare la Sezione 3.
- Eliminare PBS e modificare la soluzione in Refractive Index Matching Solution (RIMS)(Tabella 3). Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Dopo l'incubazione, il tessuto sgomberato può essere conservato nella soluzione RIMS a RT. Tessuto può sembrare bianco e opaco al centro quando viene trasferito per la prima volta in RIMS; tessuto dovrebbe diventare trasparente dopo essere stato incubato in RIMS a temperatura ambiente per diverse settimane(Figura 2D).
3. Facoltativo: Colorazione immunostochimica del cuore del topo di tutto il monte
- Rimuovere il cuore eliminato dalla soluzione RIMS e mettere in una fiala di vetro pulita da 2,5 mL con 2 mL di PBST (PBS con 0,1% Triton-X 100)
- Lavare il cuore in PBST 3 volte su un rotatore orbitale con 30 incubazioni min a RT.
- Bloccare il legame anticorpale non specifico immergendo il cuore in 2 mL del buffer di blocco del 20% (diluito in PBST) e incubare con rotazione per 3 ore a 0R. Trasferire a 4 gradi centigradi per macchiare con rotazione durante la notte.
NOTA: il buffer di blocco è costituito da un siero normale corrispondente alle specie in cui è stato allevato l'anticorpo secondario. - Lavare il cuore in PBST 3 volte con rotazione per 5 incubazioni min a RT.
- Immergere il cuore nell'anticorpo primario (diluito nel buffer di blocco del 2% con PBST) e prevenire l'esposizione alla luce avvolgendo la fiala di vetro in un foglio di alluminio. Incubare con rotazione durante la notte a RT.
NOTA: Da questo punto in avanti, la lamina di alluminio deve essere continuamente utilizzata per proteggere il secondario dall'esposizione alla luce ambientale. - Incubare per altre 24 ore con rotazione a 4 gradi centigradi.
- Dopo la colorazione primaria, ripetere il passaggio 3.2 (lungo ciclo di lavaggio PBST) per rimuovere l'anticorpo primario non associato dal tessuto. Estendere il lavaggio con un'incubazione notturna con rotazione a RT.
- Lavorando in un'area con illuminazione limitata per prevenire l'esposizione alla luce dell'anticorpo secondario, immergere il cuore in anticorpi secondari (diluiti nel buffer di blocco del 2% con PBST) e incubare con rotazione per 3 ore a RT. Trasferire a 4 gradi centigradi per macchiare con rotazione durante la notte.
- Il giorno successivo, ripetere il passaggio 3.2 (ciclo di lavaggio PBST lungo) per rimuovere l'anticorpo secondario non associato.
- Sostituire la soluzione con buffer di blocco del 2% (diluito in PBST). Rimuovere l'anticorpo residuo non legato lavando si è durante la notte con la rotazione a RT.
- Il giorno successivo, controllare che l'anticorpo secondario in eccesso sia stato rimosso utilizzando la microscopia confocale. Estendere il lavaggio in base alle esigenze, sostituendo la soluzione di buffer di blocco del 2% ogni giorno. Procedere una volta poco o nessun secondario non specifico è presente.
- Conservare il cuore immunocolorato in PBS a 4 gradi centigradi.
- Direttamente prima della microscopia a montaggio completo, incubare il cuore nella soluzione RIMS durante la notte a 37 gradi centigradi. Estendere l'incubazione di altre 24 ore se il tessuto non è ancora completamente eliminato.
- Conservare il cuore completamente eliminato e immunostained in RIMS presso RT.
4. Visualizzazione delle popolazioni non miocite in 3D con l'imaging di microscopia confocale monofotonico del cuore del topo eliminato
NOTA: Se i cuori dei topi vengono raccolti embrionalmente, continuare con la sezione 4.1. Per i cuori di topo raccolti postnatally, continuare con la sezione 4.2.
- Imaging del cuore del topo embrionale cancellato
- Riempire il vetrino di depressione del microscopio con la soluzione PBS.
- Raccogliere con attenzione il cuore sgomberato con pinze curve e posizionare il tessuto sul vetrino.
- Montare lo scivolo con una vetrina di vetro. Il tessuto può ora essere immaginato al microscopio confocale.
- Immaginare il cuore del topo postnatale cancellato
- Riempire metà della camera dello scivolo depressione con soluzione PBS. Al fine di creare una camera abbastanza grande da adattarsi a un cuore di topo adulto, una diapositiva di depressione in polipropilene stampata in 3D è stata realizzata su misura (Figura 4).
- Raccogliere con attenzione il cuore sgomberato con pinze curve e posizionare il tessuto nella camera. Riempire il volume rimanente della camera con PBS.
- Riempire la camera con PBS in modo che la superficie del liquido formi una cupola sopra la parte superiore della camera. Montare lo scivolo di copertura. Il tessuto può ora essere immaginato al microscopio confocale verticale.
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Representative Results
Spesso i due passi più impegnativi sono guidare il cuore fuori dalla cavità toracica e legare il LAD. Per risolvere questi passaggi, possono essere effettuate regolazioni nel posizionamento della puntura iniziale tra i quattro muscoli intercostali; se la puntura e la dissezione contundente sono troppo vicine in prossimità dello sterno, il cuore potrebbe non essere in grado di uscire dalla cavità toracica (Figura 1A).
Inoltre, potrebbe essere necessaria una maggiore pressione sull'addome sinistro per facilitare questo processo (Figura 1B). Le complicazioni possono verificarsi anche quando si appoggia il cuore sui muscoli intercostali. Abbiamo scoperto che il cuore rimarrà al di fuori della cavità senza ritirarsi quando la dissezione smussata viene mantenuta a una dimensione minima ed eseguita principalmente in direzione orizzontale. Questo orientamento consente inoltre una visualizzazione chiara e l'accessibilità al LAD (Figura 1C).
Quando si posiziona l'ago di sutura dietro il LAD, si consiglia di penetrare in profondità nella parete anteriore del ventricolo sinistro, poiché una legatura superficiale ha meno spazio per la regolazione nel posizionamento finale della sutura (Figura 1D). Legare la sutura intorno al LAD deve essere eseguita con movimenti controllati e costanti, poiché il LAD è fragile e recidendo questa arteria coronaria e la parete anteriore causerà mortalità (Figura 1E). Entro 5-10 minuti dopo il completamento dell'intervento chirurgico, il neonato dovrebbe essere vivace e respirare normalmente.
Quando si procede al protocollo passivo CLARITY, i cuori raccolti da una linea di mouse che incorpora un reporter fluorescente endogeno per il tracciamento del lignaggio cellulare devono essere protetti dalla luce(Figura 2),che può essere eseguita avvolgendo la fiala di vetro in un foglio di alluminio. Durante la fase di compensazione, il tempo di incubazione in Clearing Solution è variabile a seconda dell'età del topo quando il cuore è stato raccolto. Questo passaggio è completo quando l'intero tessuto è costantemente opaco, senza scolorimento al centro (Figura 2B-C). I cuori diventeranno sempre più trasparenti dopo lo stoccaggio in soluzione RIMS a temperatura ambiente per un paio di giorni (Figura 2D). Va notato che l'espansione dei tessuti può verificarsi durante il processo di compensazione.
Il nostro protocollo CLARITY passivo consente un'efficace penetrazione degli anticorpi ed è quindi compatibile con i metodi di immunohistochimica per etichettare le proteine di interesse. Questo è stato convalidato in Actl6bCre; Rosa26tdT micidi transgenici, che etichettano i neuroni maturi con la proteina reporter tdTomato (tdT). I nervi cardiaci sono principalmente superficiali, con alcune popolazioni che risiedono nello strato epicardico, quindi abbiamo usato questa popolazione cellulare come modello proof-of-principal per la riproducibilità del segnale endogeno del reporter (Figura 3A), così come la conservazione della conformazione proteica del reporter prima e dopo LA CLARITY (Figura 3B-C). I risultati del nostro rappresentante di Actl6bCre; I topi Rosa26tdT mostrano che il segnale endogeno della proteina tdT visto nei nervi di un cuore P7 non chiarito è stato fedelmente ricapitolato nei nervi dei cuori P7 tdT non chiariti e cancellati (Figura 3). Per immunoetichettare i nervi tdT-positivi, un anticorpo primario di proteina fluorescente rossa (RFP) (policlonal del coniglio; diluizione 1:200; Rockland #600-401-379) è stato utilizzato insieme ad un anticorpo secondario Alexa Fluor 488 (policlonal di capra; 1:1000 diluizione; Invitrogeno #A-11008). Per visualizzare il cuore eliminato per occhio durante i passaggi di immunostaining e imaging, una torcia ultravioletta può essere brevemente utilizzata per illuminare il cuore.
Figura 1: Induzione dell'infarto miocardico nel topo neonatale attraverso l'occlusione coronaria dell'Arteria Discendente Anteriore Sinistra (LAD). (A) Si trova il quarto spazio intercostale, indicato da un singolo asterisco, e viene eseguita una dissezione smussata. (B) La pressione viene applicata sull'addome sinistro per guidare il cuore fuori dalla cavità toracica. (C) Il LAD, contrassegnato da un doppio asterisco, è identificato come l'arteria predominante e dalla posizione anatomica. (D, E) Una sutura viene quindi passata dietro il LAD e un nodo quadrato è legato intorno al LAD per indurre un'occlusione coronarica e un successivo infarto. (E) Una volta completato, sbiancamento può essere visto sotto la sutura, all'apice del cuore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Progressione del metodo CLARITY passivo su un cuore di topo P14. I cuori sono stati raccolti da topi P14, (A) fissi e (B-D) hanno subito il protocollo clarity passivo. Per i cuori presi in un timepoint P14, Clearing Solution fase di incubazione è (B) incompleto quando lo scolorimento al centro del cuore è evidente, visto dopo 6 giorni, e (C) completo quando il cuore appare uniformemente opaco, visto dopo 10 giorni. (D) Dopo che il cuore è stato conservato in RIMS, il tessuto viene completamente eliminato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging 3D interamente montato di cuori di mouse P7 con microscopia confocale. Rappresentativo immagini 3D montaggio da P7 Actl6bCre; I cuori dei topi transgenici Rosa26tdT sono mostrati come proiezioni di intensità massima di immagini con stack z. I cuori sono stati immaginati per mostrare (A) fluorescenza tdTomato (tdT) direttamente dopo la raccolta (rosso) (B) immunostaining dei nervi tdT-positivi in un cuore non chiarito (Alexa Fluor 488; verde) e (C) immunolabeling immunoproduceibile di nervi tdT-positivi in un cuore sgomberato (Alexa Fluor 488). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diapositive di depressione del polipropilene stampato in 3D. Per immaginare i campioni di cuore postnatale, diapositive depressione personalizzate sono stati stampati in 3D su polipropilene. Le dimensioni della diapositiva sono 25 mm x 75 mm x 1 mm, con una depressione di scorrimento ben 13 mm di diametro e sia (A) 6,5 mm o (B) 17 mm di profondità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tipo di attrezzatura | Descrizione | Azienda | Numero catalogo |
| Fiala di vetro | 12 x 35mm Fiala con tappo | Fisherbrand | 03-339-26A |
| 6-0 Suture Prolene | Suture in polipropilene | Ethicon | 8889H |
| Forza affilata | Punta fine, dritta, 4,25 in | Sigma-Adrich | N. 168777 |
| Pinze di vestire | Dissecting, 4,5 in | Fisherbrand | 13-812-39 |
| Porta ago | Mayo-Hegar, 6 pollici | Fisherbrand | 08-966 |
| Piccola Foratrice Dissecting | Bordo di taglio 30 mm | Walter Stern Inc | 25870-002 |
| Pinze per tessuti | Tessuto medio, 1X2 Denti | Eexcelta | 16050133 |
| Grandi Forbici Dissecting | Dritto, 6 in | Fisherbrand | 08-951-20 |
| Forbici iridectomia | Bordo di taglio 2 mm | Strumenti di scienza fine | 15000-03 |
| Pinze curve | Metà curva, seghettata, 4 in | Eexcelta | 16-050-146 |
Tabella 1: Attrezzature chirurgiche.
| Soluzione di cancellazione | |||
| Reagente | Finale | Quantità | Note |
| Solfato di Sodio Dodecyl (SDS) | 8,0% w/v | 40 g | |
| Acido borico | 1,25% w/v | 6,25 g | |
| 1-thiolicerolo | 0,5% w/v | 5 l/mL | Aggiunto in base alle esigenze alla soluzione |
| Aggiungere 400 ml di puro H20 a 1 lbecchino. Mescolare in SDS e acido borico con agitazione magnetica. | |||
| Regolare pH a 8,5 utilizzando 6M NaOH. Portare il volume a 500 ml e Autoclave. | |||
| Conservare la soluzione a temperatura ambiente. | |||
| Altri reagenti CLARITY | |||
| Reagente | Finale | Stock | Note |
| Pfa | 4.0% | 16% | Diluito in PBS |
| Acrilammide | 4.0% | 40% | Diluito in PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Aggiunto in base alle esigenze alla soluzione |
Tabella 2: Soluzione di compensazione e altri reagenti CLARITY.
| Reagente | Finale | Quantità |
| Buffer fosfato | 0,02 M | 90 mL |
| Histodenz | 133,3% w/v | 120 g |
| Azide di sodio | 0,05% w/v | 45 mg |
| Aggiungere 90 mL di 0,02 M Fosfato Buffer a 250 mL bottiglia di supporto in vetro avvolto in un foglio di alluminio. | ||
| Mescolare in reagenti elencati con agitazione magnetica. Consentire ai componenti di dissolversi durante la notte. | ||
| Soluzione Vortex e filtro purificare con sistema di filtrazione in una bottiglia sterile 250 mL di vetro. | ||
| Avvolgere la bottiglia in un foglio di alluminio e conservare la soluzione a temperatura ambiente. | ||
Tabella 3: Soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS).
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Discussion
Le interazioni cellule-cellule tra cardiomiociti e popolazioni non miociti sono un fattore determinante se il cuore subirà fibrosi o riparazione a seguito di lesioni. Sono state fatte scoperte dimostrando che una varietà di tipi di cellule, tra cui nervi14, cellule epicardiche24, macrofagi peritoneali25, arterioles 12,13, e cellule endoteliali linfatiche26, tutti svolgono un ruolo essenziale nella mediazione della riparazione cardiaca. Queste linee cellulari e altri di interesse possono essere geneticamente tracciati durante lo sviluppo, la malattia e la rigenerazione applicando le tecnologie Cre-lox e CRISPR-Cas9 nei topi. Se accoppiati con la compensazione degli organi e i metodi di microscopia avanzati, i contributi delle popolazioni non miociti possono essere valutati con precisione, aprendo la porta per chiarire i bersagli cellulari e molecolari della rigenerazione miocardiale a seguito di lesioni.
L'efficienza del protocollo dipende dalla legatura coerente e riproducibile del LAD durante la chirurgia coronarica occlusione. I topi neooatali sono sensibili all'esposizione estesa all'ipotermia; pertanto, l'intervento chirurgico deve essere eseguito non solo con precisione, ma anche in pochi minuti. Dall'inizio alla fine, l'intervento di infarto miocardico dovrebbe richiedere meno di 8 minuti. Si consiglia di praticare prima su diverse cucciolate dello stesso background come topi sperimentali fino a raggiungere la competenza.
La progressione della riparazione cardiaca può essere valutata utilizzando l'ecocardiografia per misurare la funzione cardiaca (ad esempio accorciamento frazionario, frazione di espulsione, volume sistolico e diastolico) una volta entro 3-7 giorni dall'intervento chirurgico e di nuovo poco prima della raccolta del cuore , suggerito tra 21 e 28 giorni dopo l'infortunio. I cuori possono essere raccolti per la compensazione in più momenti dopo la chirurgia di infarto miocardico.
La fase di compensazione (passaggio 2.17) è soggetta a variazioni di durata a seconda dell'età e dello sforzo del topo da cui è stato raccolto il cuore, il che può provocare differenze nelle dimensioni del cuore. Per un mouse di sfondo B6, la durata di cancellazione in base all'età è stimata come segue: P1 (7-10 giorni), P7 (14-17 giorni), P14 (21-24 giorni), P21 (28-31 giorni), P28 (35-38 giorni). Anche se l'obiettivo principale del nostro laboratorio è la cancellazione del cuore, il nostro metodo CLARITY passivo ha avuto successo per eliminare i polmoni di topi (risultati inediti) e non vediamo alcun limite sull'applicazione generale di questo ad altri organi. Nel complesso, il nostro processo di compensazione accelerato è molto apprezzato per la capacità di cancellare i tessuti in modo rapido ed efficace.
Va notato che possono sorgere complicazioni quando si applicano tecniche di sgombero dei tessuti in organi con reporter endogeni in sottopopolazioni rare. Il segnale di reporter nelle popolazioni cellulari dense (come i miociti23) sembra essere più resistente al processo di radura e quindi il segnale viene in genere mantenuto; tuttavia, altre popolazioni cellulari più sensibili (come i nervi cardiaci) sono inclini ad avere segnale proteico fluorescente endogeno spento dopo una fissazione prolungata o una compensazione. Ciò è emerso dall'Actl6bCre; Rosa26tdT reporter modello di mouse, dove i cuori P7 fissati brevemente per 15 minuti ha mostrato forte segnale tdT (Figura 3A), tuttavia questo segnale fluorescente è stato spento dopo la fissazione per 1 ora o incubazione notturna nella soluzione di cancellazione (dati non mostrati). Nello scenario di perdita del segnale del reporter, la colorazione degli anticorpi mirata alla proteina reporter è compatibile con la compensazione dei tessuti per amplificare il segnale (Figura 3). L'aggiunta di una fase di immunoetichettatura può essere vantaggiosa per i tessuti sottoposti a un'ampia imaging, poiché gli anticorpi coniugati sono resistenti alla candeggina e producono un'espressione stabile e a lungo termine. Con la capacità di monitorare le proteine in modo endogeno e attraverso l'immunostaining, il nostro protocollo consente in modo univoco una localizzazione precisa di popolazioni di cellule cardiache rare che risiedono in profondità all'interno del cuore.
I cuori sgomberati possono essere sottoposti a tracciamento del lignaggio o all'analisi dell'espressione delle proteine fluorescenti utilizzando la microscopia confocale 3D a montaggio intero. Il microscopio confocale è dotato di linee laser ottimizzate per eccitare i giornalisti florescenti (o anticorpi secondari coniugati), ad esempio: BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) e APC (Cy5, Alexa Fluor 647) a 405 nm, 488 nm, 561 nm e 683 nm, rispettivamente. Per i campioni di cuore che non sono in grado di adattarsi a una diapositiva di depressione – comune se il cuore raccolto postnatale – una diapositiva di depressione personalizzata può essere fatta stampando 3D su polipropilene. I vetrini personalizzati seguivano le dimensioni di una diapositiva di depressione al microscopio (25 mm x 75 mm x 1 mm), variando la profondità del pozzo a 6,5 mm o 17 mm (Figura 4).
Per visualizzare le linee cellulari reporter in 3D, il microscopio confocale è impostato per acquisire immagini in pila z in tutto il cuore. Durante l'imaging di cuori più grandi, l'intero cuore potrebbe non essere in grado di essere catturato in una singola immagine con pila z anche con un obiettivo di ingrandimento basso. In questo scenario, una serie di più immagini con impilamento z scattate in diverse regioni del cuore può essere unita utilizzando una funzione di immagine di grandi dimensioni. Ciò si ottiene calibrando il microscopio all'obiettivo appropriato e specificando il campo per l'area di scansione dell'immagine di grandi dimensioni. Quindi, le immagini in pila z vengono sottoposte alla ricostruzione 3D utilizzando un programma di rendering del volume e la proiezione di intensità massima (Figura 3). Le immagini ad alta risoluzione acquisite possono essere analizzate per determinare il pattern delle cellule spaziali 3D preciso delle popolazioni di cellule mirate.
Collettivamente, questo protocollo fornisce un potente strumento molecolare per comprendere i cambiamenti cellulari dinamici che si verificano durante la riparazione e la rigenerazione cardiaca. Questo metodo descrive i passaggi per indurre un infarto miocardico, eseguire la cancellazione dell'organo intero, tracciare popolazioni specifiche delle cellule e analizzare il pattern delle cellule 3D. Insieme, queste tecniche forniscono l'accesso a popolazioni di cellule di traccia che in precedenza erano inaccessibili a causa della loro scarsa presenza o posizione all'interno del tessuto. Ciò consentirà un'ulteriore analisi delle questioni di primaria importanza per far progredire gli approcci terapeutici nella medicina rigenerativa, in particolare quelle volte a stimolare la rigenerazione endogena del cuore.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
I finanziamenti per questo progetto sono stati forniti dalla UW School of Medicine and Public Health dal Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), e da un American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
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