Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato

Sommario

La proliferazione cardiomiocite a seguito di lesioni è un processo dinamico che richiede una sinfonia di segnali extracellulari da popolazioni di cellule non miociti. Utilizzando il tracciamento del lignaggio, il CLARITY passivo e le tecniche di microscopia confocale a cavalcatura integrale tridimensionale, possiamo analizzare l'influenza di una varietà di tipi di cellule sulla riparazione e rigenerazione cardiaca.

Abstract

La malattia cardiovascolare supera tutte le altre cause di morte ed è responsabile di uno sconcertante 31% dei mortali in tutto il mondo. Questa malattia si manifesta in lesioni cardiache, principalmente sotto forma di un infarto miocardico acuto. Con poca resilienza dopo un infortunio, il tessuto cardiaco una volta sano sarà sostituito da tessuto cicatriziale fibroso e non contrattuale e spesso sarà un preludio all'insufficienza cardiaca. Per identificare nuove opzioni di trattamento nella medicina rigenerativa, la ricerca si è concentrata sui vertebrati con capacità rigenerative innate. Uno di questi organismi modello è il topo neonato, che risponde alle lesioni cardiache con robusta rigenerazione miocardiale. Al fine di indurre una lesione nel topo neonatale che è clinicamente rilevante, abbiamo sviluppato un intervento chirurgico per occludono l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), rispecchiando un'infarzione miocardiale innescata dall'aterosclerosi nel cuore umano. Se abbinato alla tecnologia per monitorare i cambiamenti sia all'interno di cardiomiociti che di popolazioni non miociti, questo modello ci fornisce una piattaforma per identificare i meccanismi che guidano la rigenerazione del cuore. Ottenere informazioni sui cambiamenti nelle popolazioni di cellule cardiache a seguito di lesioni una volta si è basato pesantemente su metodi come il sezionamento dei tessuti e l'esame istologico, che sono limitati all'analisi bidimensionale e spesso danneggiano il tessuto nel processo. Inoltre, questi metodi non sono in grado di tracciare i cambiamenti nei lignaggi cellulari, fornendo invece semplicemente un'istantanea della risposta alle lesioni. Qui, descriviamo come i metodi tecnologicamente avanzati nei modelli di tracciamento del lignaggio, nella cancellazione di organi interi e nella microscopia tridimensionale (3D) a montaggio intero possono essere utilizzati per chiarire i meccanismi di riparazione cardiaca. Con il nostro protocollo per la chirurgia dell'infarto miocardico del topo neocardico, la compensazione dei tessuti e l'imaging dell'intero organo 3D, i percorsi complessi che inducono la proliferazione cardiomiocita possono essere svelati, rivelando nuovi obiettivi terapeutici per la rigenerazione cardiaca.

Introduzione

Il cuore è stato a lungo considerato un organo post-mitotico, ma prove recenti dimostrano che il rinnovamento cardiomiocito si verifica nel cuore umano adulto a circa 1% all'anno¹. Tuttavia, questi bassi tassi di avvicendamento cardiomiocito sono insufficienti per ricostituire la massiccia perdita di tessuto che si verifica dopo lesioni. Un cuore che ha subito un infarto miocardico perderà circa un miliardo di cardiomiociti, spesso servendo come preludio all'insufficienza cardiaca e morte cardiaca improvvisa^2,3. Con oltre 26 milioni di persone affette da insufficienza cardiaca in tutto ....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per l'uso e la cura degli animali da laboratorio e in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee presso la School of Medicine and Public Health dell'Università del Wisconsin-Madison. Tutti i metodi sono stati eseguiti su wild tipo C57BL/6J (B6) e linee di mouse transgenici ottenute da Jackson Laboratories.

1. Occlusione coronaria Arteria (Infarzione miocardiale) Indotta tramite la legatura dell'Arteria Discendente Anteriore Sinistra (LAD) in Topi Neonatale di 1 giorno⁶

1. Separare i cuccioli neonatale di 1 giorno dalla madre....

Risultati

Spesso i due passi più impegnativi sono guidare il cuore fuori dalla cavità toracica e legare il LAD. Per risolvere questi passaggi, possono essere effettuate regolazioni nel posizionamento della puntura iniziale tra i quattro muscoli intercostali; se la puntura e la dissezione contundente sono troppo vicine in prossimità dello sterno, il cuore potrebbe non essere in grado di uscire dalla cavità toracica (Figura 1A).

Inoltre, potrebbe essere neces.......

Discussione

Le interazioni cellule-cellule tra cardiomiociti e popolazioni non miociti sono un fattore determinante se il cuore subirà fibrosi o riparazione a seguito di lesioni. Sono state fatte scoperte dimostrando che una varietà di tipi di cellule, tra cui nervi¹⁴, cellule epicardiche²⁴, macrofagi peritoneali²⁵, arteriole^{s 12,13}, e cellule endoteliali linfatiche²⁶, tutti svolg.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-tioglicerolo
6-0 suture in prolene	Ethicon	8889H	Suture in polipropilene
acrilammide
acido
Pinze curve	Excelta	16-050-146	semicurve, seghettate, 4 in
pinze per medicazione	Fisherbrand	13-812-39	Fiala da dissezione, 4,5 pollici in
vetro	Fisherbrand	03-339-26A	Fiala da 12 x 35 mm con tappo
Histodenz	Sigma-Aldrich		Forbici per iridectomia con gradiente di densità media
	Strumenti per scienze fini	15000-03
Forbici da dissezione grandi	Fisherbrand	08-951-20	Dritte, porta
aghi	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldeide
Fosfato Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Punta fine, Dritto, 4.25 in
Small Dissecting Forbice	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Tagliente
Sodio Azide
Sodio Dodecil Solfato (SDS)
Pinze per tessuti Excelta		16050133	Tessuto medio, 1X2 denti
VA-044	Wako Chemicals Iniziatore		azoico solubile in acqua

borico da 2 mm da 6 pollici