Summary
Пролиферация кардиомиоцитов после травмы является динамичным процессом, который требует симфонии внеклеточных сигналов от немиоцитных клеточных популяций. Используя отслеживание линий, пассивный CLARITY и трехмерные методы полной монтажной конфокальной микроскопии, мы можем анализировать влияние различных типов клеток на восстановление и регенерацию сердца.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания превосходит все другие причины смерти и несет ответственность за ошеломляющие 31% смертей во всем мире. Это заболевание проявляется при сердечной травме, в первую очередь в виде острого инфаркта миокарда. С небольшой устойчивостью после травмы, когда-то здоровая сердечная ткань будет заменена волокнистой, неконтрактной рубцовой ткани и часто будет прелюдией к сердечной недостаточности. Чтобы определить новые варианты лечения в регенеративной медицине, исследования были сосредоточены на позвоночных с врожденными регенеративными возможностями. Одним из таких образцов организм неонатального мышки, которая реагирует на сердечную травму с надежной регенерацией миокарда. Для того, чтобы вызвать травму неонатальной мыши, которая является клинически актуальной, мы разработали операцию по окклюзии левой передней нисходящей артерии (LAD), отражая инфаркт миокарда, вызванный атеросклерозом в сердце человека. В сочетании с технологией отслеживания изменений как в кардиомиоцитах, так и в популяциях, не связанных с миоцитами, эта модель предоставляет нам платформу для определения механизмов, которые направляют регенерацию сердца. Получение информации об изменениях в популяциях сердечно-клеточных клеток после травмы когда-то в значительной степени опиралось на такие методы, как секция тканей и гистологическое обследование, которые ограничиваются двумерным анализом и часто повреждают ткани в процессе. Кроме того, эти методы не имеют возможности отслеживать изменения в клеточных линиях, вместо этого предоставляя лишь снимок ответа травмы. Здесь мы описываем, как технологически передовые методы в модели отслеживания линий, очистка всего органа, и трехмерной (3D) полной монтажной микроскопии могут быть использованы для выяснения механизмов восстановления сердца. С нашим протоколом для неонатальной мыши хирургии инфаркта миокарда, очистки тканей, и 3D всего органа изображения, сложные пути, которые вызывают пролиферацию кардиомиоцитов могут быть разгачены, выявление новых терапевтических целей для регенерации сердца.
Introduction
Сердце уже давно считается пост-митотическим органом, но последние данные свидетельствуют о том, что обновление кардиомиоцитов происходит во взрослом сердце человека примерно на 1% в год1. Тем не менее, эти низкие показатели кардиомиоцитов текучести являются недостаточными для пополнения массовой потери ткани, что происходит после травмы. Сердце, которое перенес инфаркт миокарда потеряет около одного миллиарда кардиомиоцитов, часто выступающей в качестве прелюдии к сердечной недостаточности и внезапной сердечной смерти2,3. С более чем 26 миллионов людей, пострадавших от сердечной недостаточности во всем мире, есть неудовлетворенная потребность в терапии, которые могут обратить вспять ущерб, причиненный сердечно-сосудистых заболеваний4.
Для того, чтобы преодолеть этот разрыв в терапии, ученые начали исследовать эволюционно сохраненные механизмы, которые лежат в основе эндогенной регенерации после травмы. Одной из моделей для изучения регенерации сердца млекопитающих является неонатальная мышь. В течение недели после рождения, неонатальный мышей имеют надежный регенеративный ответ после повреждения сердца5. Мы ранее показали, что неонатальные мыши могут регенерировать свое сердце через пролиферацию кардиомиоцитов после апического резекции5. Хотя этот метод может вызвать регенерацию сердца у новорожденных, операция не имеет клинического отношения к травмам сердца человека. Для того, чтобы имитировать травмы человека в модели неонатальной мыши, мы разработали метод, чтобы вызвать инфаркт миокарда через окклюзию коронарной артерии6. Этот метод требует хирургической перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD), которая отвечает за доставку 40%-50% крови в левый желудочный миокард6,7. Таким образом, операция приводит к инфаркту, который воздействует на значительную часть левой стенки желудочка. Это повреждение миокарда будет стимулировать пролиферацию кардиомиоцитов и регенерацию сердца у новорожденных5.
Операция окклюзии коронарной артерии обеспечивает высоко воспроизводимый и непосредственно переводческий метод, чтобы раскрыть внутреннюю работу сердечной регенерации. Неонатальная хирургия параллели коронарного атеросклероза артерии в сердце человека, где накопление бляшек во внутренних стенках артерий может вызвать окклюзию и последующий инфаркт миокарда8. Из-за пустоты в терапевтических лечения для пациентов с сердечной недостаточностью, окклюзия в LAD связано с смертностью достигает до 26% в течение года после травмы9, и, следовательно, был назван "вдова Maker". Достижения в области терапии требуют модели, которая точно отражает сложные физиологические и патологические последствия сердечной травмы. Наш хирургический протокол для неонатальной мыши сердечной травмы обеспечивает платформу, которая позволяет исследователям исследовать молекулярные и клеточные сигналы, которые сигнализируют регенерации сердца млекопитающих после травмы.
Недавние исследования подчеркивают динамическую взаимосвязь между внеклеточной средой и пролиферирующими кардиомиоцитами. Например, послеродовое регенеративное окно может быть расширено за счет уменьшения жесткости внеклеточной матрицы, окружающей сердце10. Биоматериалы из неонатальной внеклеточной матрицы могут также способствовать регенерации сердца у взрослых млекопитающих сердца после сердечной травмы11. Также сопровождающим пролиферацией кардиомиоцитов является ангиогенный ответ12,,13; было показано, что образование побочных артерий, уникальное для регенерирующего сердца неонатальной мыши, имеет важное значение для стимуляции регенерации сердца12. Кроме того, наша лаборатория показала, что сигнализация нерва регулирует пролиферацию кардиомиоцитов и регенерацию сердца через модуляцию уровней фактора роста, а также воспалительный ответ после травмы14. Эти выводы подчеркивают необходимость отслеживания не миоцитных клеточных популяций в ответ на сердечную травму. Для достижения этой цели мы воспользовались системой рекомбинации Cre-lox в трансгенных линиях мышей, чтобы включить составные или условные выражения флуоресцентных белков репортера для отслеживания родословной. Кроме того, мы можем использовать передовые методы для определения клонального расширения шаблона с линией мыши Радуга, которая опирается на стохасическое выражение Cre-зависимых, многоцветных флуоресцентных репортеров, чтобы определить клональное расширение целевых популяций клеток15. Использование линии отслеживания с неонатальной коронарной артерии окклюзии хирургии является мощным инструментом для вскрытия сложных клеточных механизмов сердечной регенерации.
Отслеживание линии флуоресцентно маркированных клеток с трехмерной (3D) визуализацией всего органа трудно достичь с помощью традиционной секционной и восстановительных методов , особенно когда популяции клеток хрупкие, такие как нервные волокна или кровеносные сосуды. В то время как прямое изображение цельногорного органа оптическим сечением может захватывать поверхностные популяции клеток, структуры, которые находятся глубоко внутри ткани, остаются недоступными. Чтобы обойти эти барьеры, методы очистки тканей были разработаны, чтобы уменьшить непрозрачность целых тканей органов. В последнее время, значительные успехи были сделаны для ясной Липид-обменянный Акриламид-гибридизированные Rigid Imaging совместимых Ткань hYdrogel (CLARITY) на основе методов, которые очистить фиксированной ткани через липидной экстракции16. Также предпринимаются шаги по гомогенизации рефракционного индекса и последующему уменьшению рассеяния света во время визуализации17. Одним из таких методов является активный CLARITY, который ускоряет разложение липидов с помощью электрофореза, чтобы проникнуть в моющее средство по всей ткани18. Хотя этот метод очистки тканей требует дорогостоящего оборудования и может привести к повреждению тканей, что делает подход несовместимым с хрупкими популяциями клеток, такими как сердечные нервы19. Таким образом, мы используем пассивный подход CLARITY, который опирается на тепло, чтобы мягко облегчить проникновение моющего средства, тем самым помогая в сохранении сложных клеточных структур20,21.
Пассивный CLARITY, как правило, считается менее эффективным, чем активные CLARITY18, как техника часто сопровождается двумя основными препятствиями: неспособность очистить всю глубину органа и большое количество времени, необходимого для очистки тканей взрослых. Наш пассивный подход CLARITY преодолевает оба этих барьера с помощью ускоренного процесса очистки, который способен полностью очистить ткани сердца новорожденных и взрослых. Наша пассивная техника очистки тканей CLARITY достигла эффективности, которая позволяет визуализировать различные популяции сердечных клеток, включая редкие популяции, распределенные по всему взрослому сердцу. Когда очищенное сердце изображено с конфокальной микроскопией, архитектура клеточного узора во время развития, болезни и регенерации может быть освещена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по использованию и уходу за лабораторными животными и в соответствии с Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Школе медицины и общественного здравоохранения Университета Висконсин-Мэдисон. Все методы были выполнены на диких типаc C57BL/6J (B6) и трансгенных линиях мыши, полученных от Jackson Laboratories.
1. Окклюзия коронарной артерии (инфаркт миокарда) индуцирована с помощью лигиции левой передней спусковой артерии (LAD) в 1-дневном неонатальных мышах6
- Отделите 1-дневных неонатального щенка от матери, поместив их в чистую клетку вместе с некоторыми из оригинального материала гнездования.
- Поместите половину клетки на грелку, установленную на среднем огне. Щенки должны оставаться на неотапливаемой стороне клетки, только помещается на нагретую сторону после операции.
- Создайте стерильную хирургическую область под операционным микроскопом. Собрать стерилизованное хирургическое оборудование(таблица 1).
- Анестезируйте щенка с помощью переохлаждения: заверните щенка в марлю, чтобы избежать прямого контакта кожи со льдом, и закопать его в ледяной ложе в течение примерно 3-4 мин. Проверьте переохлаждение мышей периодически, выполняя щепотку ног. Неонаты хорошо переносят переохлаждение, однако длительное воздействие переохлаждения может привести к обморожению и последующей смертности.
- После анестезии, поместите мышь на хирургической области в положении на спине, обеспечивая руки и ноги с лентой. Стерилизовать хирургическую область мыши антисептическим раствором.
- Найдите нижнюю часть грудной клетки и сделайте поперечный разрез в коже с помощью небольших рассекающих ножниц. Чтобы расширить хирургический вид ребер, отделить кожу от мышц, подняв кожу осторожно с парой одевания щипцы и осторожно нажмите на межреберные мышцы с небольшими ножницами в закрытом положении.
- Найдите четвертое межреберное пространство(рисунок 1А)и сделайте небольшой, поверхностный прокол с помощью острых щипц, стараясь не проколоть внутренние органы. Выполните тупой вскрытия путем расширения области между межреберных мышц с заправкой щипцы. Правильное анатомическое позиционирование разреза имеет важное значение для соответствующего доступа к сердцу.
- Аккуратно направлять сердце из грудной полости, поместив палец и применяя растущее давление на левой стороне живота, удерживая межреберное пространство открытым с перевязочными щипками(рисунок 1B). После того, как сердце находится за пределами груди, удалить повязку щипцы, облегчить давление, и дать сердцу отдохнуть на межреберных мышц.
- Найдите LAD как область сердца, которая имеет меньше объединенной крови и находится в правильном анатомическом положении(рисунок 1C). LAD можно увидеть только под микроскопом, если сердце доступно в течение нескольких минут после начала операции.
- Выполните LAD перевязки, зашивая LAD с 6-0 шов(Рисунок 1D). Свяжите квадратный узел дважды, чтобы вызвать инфаркт миокарда(рисунок 1E). Глубина шва в миокард может варьироваться, однако правильное анатомическое позиционирование перевязки LAD имеет решающее значение для воспроизводства. При переплетении LAD шов следует тянуть плотно, но осторожно, чтобы не разорвать LAD. Бланширование на вершине сердца будет видно сразу(Рисунок 1E)
- Разрешить сердце скользить обратно в грудную полость; этот процесс можно мягко облегчить с перевязочными щипками. Шов ребра вместе с узел хирурга следуют квадратный узел, используя тупые щипцы, чтобы поднять верхний набор ребер при прохождении 6-0 шов через верхний и нижний набор ребер.
- Удалите ленту, которая была использована для обеспечения задних ног щенка.
- Придерживайтесь кожи вместе, поместив небольшое количество клей кожи на верхней части живота. Затем возьмите кожу нижней части живота с тонкими щипками и покрыть открытые области груди. Ограничьте количество избыточного клея, который остается на щенков, так как это может увеличить вероятность отторжения и каннибализма со стороны матери.
- Немедленно облегчить восстановление после анестезии, поместив щенка на грелку, установленную на среднем огне. Периодически переключайте размещение новорожденных, чтобы равномерно согреть все части тела.
- Разрешить новорожденный оставаться непосредственно на грелке в течение 10-15 мин. Как правило, движение восстанавливается в течение 5 минут после того, как помещается на тепло.
- Очистите остаточную кровь и клей с алкоголем протрите.
- Обложка иностранных ароматов на новорожденных, протирая все тело постельными принадлежностями из оригинальной клетки. Поместите щенка в клетку на подогревом стороне в то время как другие операции выполняются.
- После того, как все операции завершены и щенки теплые и мобильные, передача помета вместе с оригинальным материалом гнездования в клетку матери.
- Мониторинг мышей в течение 30-60 минут после операции и следить за принятием матери щенков путем гнездования и / или ухода.
- Проверьте мышей на следующее утро после операции. Если мать расстроена и не вложена щенки, рассмотреть приемную мать для щенков.
2. Очистка мыши сердце с пассивной CLARITY21,22,23
- Анестезируйка мыши с изофлюраном. Выполните щепотку, чтобы убедиться, что мышь полностью успокоительно.
- Поместите мышь на чистую, хирургическую область в положении на спине, обеспечивая руки и ноги с помощью ленты.
- Поддерживайте седацию изофруран на мышке с помощью носового конуса до тех пор, пока сердце не будет извлечено.
- Откройте нижнюю часть груди, удерживая мех чуть ниже процесса xiphoid с тканью щипцы и сделать разрез, охватывающий ширину грудной клетки с помощью больших рассечения ножницы.
- Вырезать рядом дистальных частей грудной клетки с хирургическими ножницами.
- Разоблачить мышцы диафрагмы, схватив процесс сифоид с тканью щипцев. Отсоедините диафрагму с помощью изогнутых щипц.
- Сохраняя понимание процесса xiphoid, потяните ткани черепно, пока бьющееся сердце не будет доступно.
- Возьмитесь за сердце у основания изогнутыми щипками и всколыхните сердце из грудной полости, разрезая аорту и превосходную полину вены ножницами.
- В то время как сердце все еще бьется, поместите сердце в чашку Петри, наполненную PBS, так что сердце выкачивает кровь внутри, как он продолжает биться. Инфаркт миокарда может быть подтвержден, проверяя, что размещение шва находится в надлежащем анатомическом положении для перевязки LAD.
- Аккуратно сжать сердце с щипками, чтобы сердце изгнать остаточной крови.
- Перенесите сердце мыши в одноразовый флакон стеклянной оболочки 2,5 мл с 2 мл PBS. Смойте остаточную кровь путем инкубации сердца на шейкер е в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) несколько раз. Изменяйте решение PBS каждый раз, пока PBS не останется ясным.
- Откажитесь от PBS и заполните флакон с 2 мл холодного 4% параформальдегида (PFA). Инкубировать в течение 4 часов на RT(Рисунок 2A).
- После инкубации отбросьте PFA и флакон с 2 мл PBS. Вымойте сердце на шейкер в течение 10 минут на RT. Повторите шаг стирки в два раза, слива и заполнения флакона с новым PBS каждый раз, чтобы полностью смыть избыток PFA.
- Отбросьте PBS и заполните флакон 2 мл 4% акриламида и 0,5% раствора VA-044. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- На следующий день выполните полимеризацию, переведя флакон в теплоблок, установленный при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 3 часов.
- Перенесите сердце в новый флакон стеклянной оболочки и повторите шаг 2.12 (цикл мытья PBS).
- Отбросьте PBS и заполните флакон 2 мл клирингового решения(таблица 2). Инкубировать при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока сердце не очистится. Изменяйте решение и пополните свежим клиринговым решением каждые 2-3 дня. Процесс расчистки может занять до нескольких недель(рисунок 2B-C).
ПРИМЕЧАНИЕ: P1 сердца обычно занимают около 3-5 дней, в то время как P21 сердца могут занять почти месяц, прежде чем очистка решение инкубации завершена. - Отбросьте PBS и заполните флакон 2 мл PBS и повторите шаг 2.12 (цикл мытья PBS). Пополнить флакон со свежим PBS и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
- Если иммуностоирование будет выполнено, пропустите шаги 2.21-2.22 и перейдите в раздел 3 для иммуно-стоицина. Если полагаться исключительно на эндогенную флуоресценцию, продолжайте шаги 2.21-2.22 и пропустите раздел 3.
- Откажитесь от PBS и измените решение для решения для соответствия рефракционным индексам (RIMS)(таблица 3). Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- После инкубации очищенная ткань может храниться в растворе RIMS на RT. Ткань может показаться белой и непрозрачной в центре при первом переводе в RIMS; ткань должна стать прозрачной после инкубации в RIMS при комнатной температуре в течение нескольких недель(рисунок 2D).
3. Необязательный: Иммуногистохимия Окрашивание сердца всей мыши
- Удалите очищенное сердце от раствора RIMS и поместите в чистый стеклянный флакон 2,5 мл с 2 мл PBST (PBS с 0,1% Triton-X 100)
- Вымойте сердце в PBST 3 раза на орбитальной ротатор с 30 мин инкубаций на RT.
- Блок неспецифических связывания антител путем погружения сердца в 2 мл 20% блокирующий буфер (разбавленный в PBST) и инкубировать с вращением в течение 3 часов на RT. Передача до 4 градусов по Цельсию, чтобы пятно с вращением на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий буфер производится из обычной сыворотки, соответствующей видам, в которых было поднято вторичное антитело. - Вымойте сердце в PBST 3 раза с вращением в течение 5 мин инкубаций на RT.
- Погрузите сердце в первичное антитело (разбавленное 2% блокирующим буфером с PBST) и предотвратите воздействие света, завернув стеклянный флакон в алюминиевую фольгу. Инкубировать с вращением на ночь на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента алюминиевая фольга должна постоянно использоваться для защиты вторичного от воздействия окружающего света. - Инкубировать в течение дополнительных 24 часов с вращением при 4 градусах Цельсия.
- После первичного окрашивания, повторить шаг 3.2 (длинный цикл мытья PBST), чтобы удалить несвязанные первичные антитела из ткани. Расширьте стирку с помощью ночной инкубации с вращением на RT.
- Работая в области с ограниченным освещением, чтобы предотвратить вторичное воздействие света антитела, погрузить сердце в вторичное антитела (разбавленное в 2% блокирующий буфер с PBST) и инкубировать с вращением в течение 3 часов на RT. Передача до 4 градусов по Цельсию, чтобы пятно с вращением на ночь.
- На следующий день повторите шаг 3.2 (длинный цикл мытья PBST), чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.
- Замените раствор 2% блокирующим буфером (разбавленным в PBST). Удалите остаточные несвязанные антитела, смыв на ночь с вращением на RT.
- На следующий день, убедитесь, что избыток вторичных антител был удален с помощью конфокальной микроскопии. Расширяйте мыть по мере необходимости, заменяя 2% блокирующий буферный раствор ежедневно. Продолжить один раз практически не является неспецифическим вторичным присутствует.
- Храните иммунозапятнанное сердце в PBS при 4 градусах Цельсия.
- Непосредственно перед микроскопией цельного монтажа, инкубировать сердце в растворе RIMS на ночь при 37 градусах Цельсия. Продлить инкубацию еще на 24 часа, если ткань еще не полностью очищена.
- Храните полностью очищенное и иммуноокрашенное сердце в RIMS на RT.
4. Визуализация немиоцитов населения в 3D с однофотон Конфокальная микроскопия Imaging очищенного сердца мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердца мыши собирают эмбрионально, продолжайте раздел 4.1. Для сердца мышей, собранных послеродового, продолжайте раздел 4.2.
- Изображение очищенного сердца эмбриональной мыши
- Заполните слайд депрессии микроскопа с помощью решения PBS.
- Аккуратно подберите очищенное сердце с помощью изогнутых щипков и поместите ткань на горку.
- Смонтировать горку со стеклянным покрытием. Ткань теперь может быть изображена под конфопальный микроскоп.
- Изображение очищенного послеродового сердца мыши
- Заполните половину камеры депрессии слайд с решением PBS. Для того, чтобы создать камеру достаточно большой, чтобы соответствовать сердце взрослой мыши, 3D-печать полипропилена депрессии слайд был изготовлен на заказ(Рисунок 4).
- Аккуратно подберите очищенное сердце с изогнутыми щипками и поместите ткань в камеру. Заполните оставшийся объем камеры PBS.
- Заполните камеру PBS, чтобы поверхность жидкости образовыла купол над верхней частью камеры. Установите крышку слайда. Ткань теперь может быть изображена под вертикально конфокальный микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Часто два самых сложных шага направляют сердце из грудной полости и ligating LAD. Для устранения неполадок эти шаги могут быть внесены коррективы при размещении первоначального прокола между четвертыми межреберными мышцами; если прокол и тупое вскрытие находятся слишком близко в непосредственной близости от грудины, сердце может быть не в состоянии выйти из грудной полости(рисунок 1А).
Кроме того, для облегчения этого процесса может потребоваться повышенное давление на левый живот(рисунок 1B). Осложнения могут также возникнуть при отдыхе сердца на межреберных мышцах. Мы обнаружили, что сердце останется за пределами полости, не снимая, когда тупой рассечение сохраняется до минимального размера и выполняется в основном в горизонтальном направлении. Эта ориентация также позволяет четко визуализировать и доступность LAD(Рисунок 1C).
При размещении шовной иглы за LAD, предлагается проникнуть глубоко в переднюю стенку левого желудочка, так как поверхностная перевязка имеет меньше места для регулировки в окончательном размещении шва(рисунок 1D). Связывание шва вокруг LAD должно быть выполнено с контролируемыми, устойчивыми движениями, так как LAD является хрупким и разрыв этой коронарной артерии и передней стены вызовет смертность (Рисунок 1E). В течение 5-10 минут после завершения операции новорожденный должен быть живым и дышать нормально.
При переходе к пассивному протоколу CLARITY, сердца, собранные из мышиной линии, которая включает в себя эндогенный флуоресцентный репортер для отслеживания клеточной линии, должны быть защищены от света(Рисунок 2),который может быть достигнут путем упаковки стеклянного флакона в алюминиевую фольгу. Во время шага очистки время инкубации в Очистке Решения изменяется в зависимости от возраста мыши, когда сердце было собрано. Этот шаг завершается, когда вся ткань постоянно непрозрачна, без обесцвечивания в центре(рисунок 2B-C). Сердца будут становиться все более прозрачными после хранения в растворе RIMS при комнатной температуре в течение нескольких дней(рисунок 2D). Следует отметить, что расширение тканей может произойти во время процесса очистки.
Наш пассивный протокол CLARITY допускает эффективное проникновение антител и, таким образом, совместим с иммуногистохимией методы для обозначения белка (ы) интерес. Это было подтверждено в Actl6bCre; Трансгенных мышей Rosa26tdT, которые маркировать зрелые нейроны с tdTomato (tdT) репортер омичей. Сердечные нервы в основном поверхностные, с некоторыми популяциями, проживающими в эпикардическом слое, поэтому мы использовали эту популяцию клеток в качестве доказательства основной модели для воспроизводимости эндогенного сигнала репортера(рисунок 3А),а также сохранение конформации белка репортера до и после CLARITY (Рисунок 3B-C). Наши репрезентативные результаты от Actl6bCre; Rosa26tdT мышей показывают, что эндогенный сигнал белка tdT видели в нервах неясных p7 сердце было добросовестно recapitulated в нервы как неясным и очищены tdT иммуномаркировки P7 сердца(Рисунок 3). Для иммуномаркировки tdT-положительных нервов, красный флуоресцентный белок (RFP) первичного антитела (кролик поликлональный; 1:200 разбавления; Рокленд #600-401-379) был использован вместе с Алекса Fluor 488 вторичных антител (коза поликлональных; 1:1000 разбавления; Инвитроген #A-11008). Для визуализации очищенного сердца на глаз во время иммуно-стигирования и визуализации шаги, ультрафиолетовый фонарик может быть кратко использоваться для освещения сердца.
Рисунок 1: Индукция инфаркта миокарда в неонатальной мыши через окклюзию коронарной артерии левой передней спусковой артерии (LAD). (A) Четвертое межреберное пространство, указанное одной звездочкой, расположено и выполняется тупое вскрытие. (B) Давление применяется на левом животе, чтобы направлять сердце из грудной полости. (C) LAD, отмеченный двойной звездочкой (яп. ) определяется как преобладающая артерия и по анатомическому положению. (D, E) Шов затем передается за LAD и квадратный узел связан вокруг LAD, чтобы вызвать окклюзии коронарной артерии и последующего инфаркта. (E) После завершения, бланширование можно увидеть ниже шва, на вершине сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Прогрессирование пассивного метода CLARITY на сердце мыши P14. Сердца были собраны из P14 мышей, (A) фиксированной, и (B-D) прошли пассивный протокол CLARITY. Для сердец, принятых в P14 timepoint, очистка решение инкубации шаг является (B) неполным, когда обесцвечивание в центре сердца очевидно, видели через 6 дней, и (C) полный, когда сердце появляется равномерно непрозрачным, видели через 10 дней. (D) После того, как сердце хранится в RIMS, ткань полностью очищается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Всего-Гора 3D изображение P7 мыши сердца с конфокальной микроскопии. Представитель всего монтировать 3D изображения из P7 Actl6bCre; Сердца трансгенных мышей Rosa26tdT показаны как проекции максимальной интенсивности z-stacked изображений. Сердца были изображены, чтобы показать (A) эндогенных tdTomato (tdT) флуоресценции непосредственно после сбора урожая (красный) (B) иммуномаркировки tdT-положительных нервов в неясных сердца (Alexa Fluor 488; зеленый) и(C ) воспроизводимый иммуномаркировки tdT-положительных нервов в очищенном сердце (Alexa Fluor 488; зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: 3D Печатные полипропиленовые депрессии Слайды. Для изображения образцов послеродового сердца, пользовательские слайды депрессии были 3D напечатаны на полипропилене. Размеры слайда 25 мм х 75 мм х 1 мм, с слайд-депрессией в диаметре 13 мм и либо (А) 6,5 мм или(B)17 мм в глубину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Тип оборудования | Описание | Компании | Номер каталога |
| Стеклянный виал | 12 x 35mm Виал с крышкой | Фишербранд | 03-339-26A |
| 6-0 Пролен скиеш | Полипропиленовые швы | Этикон | 8889H |
| Острые сила | Тонкий совет, прямой, 4.25 в | Сигма-Адрич | No168777 |
| Одевание щиптем | Вскрытие, 4,5 в | Фишербранд | 13-812-39 |
| Держатель иглы | Майо-Хегар, 6 в | Фишербранд | 08-966 |
| Малый рассекающий ножницы | 30 мм режущей кромки | Уолтер Стерн Инк | 25870-002 |
| Ткань Силовые | Средняя ткань, 1X2 Зубы | Эксельта | 16050133 |
| Большие рассекающие ножницы | Прямо, 6 в | Фишербранд | 08-951-20 |
| Ножницы-иридэктомии | 2 мм режущей кромки | Изобразительные научные инструменты | 15000-03 |
| Изогнутые силы | Половина изогнутая, Сертированный, 4 в | Эксельта | 16-050-146 |
Таблица 1: Хирургическое оборудование.
| Клиринговое решение | |||
| Реагента | Окончательный | Сумма | Заметки |
| Сульфат натрия додецил (SDS) | 8.0% w/v | 40 г | |
| Борная кислота | 1.25% w/v | 6,25 г | |
| 1 тиоглицерол | 0,5% ж/в | 5 л/мл | Добавлено по мере необходимости к решению |
| Добавьте 400 мл ультрачистого H20 в 1 л стакана. Смешайте в SDS и борной кислоты с магнитным перемешиванием. | |||
| Отрегулируйте рН до 8.5 с помощью 6M NaOH. Довести объем до 500 мл и Autoclave. | |||
| Храните раствор при комнатной температуре. | |||
| Другие реагенты CLARITY | |||
| Реагента | Окончательный | Фондовая | Заметки |
| Pfa | 4.0% | 16% | Разбавленный в PBS |
| Акриламида | 4.0% | 40% | Разбавленный в PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Добавлено по мере необходимости к решению |
Таблица 2: Решение для очистки и другие реагенты CLARITY.
| Реагента | Окончательный | Сумма |
| Фосфатный буфер | 0,02 м | 90 мл |
| Хистоденц | 133,3% ж/в | 120 г |
| Азид натрия | 0,05% ж/в | 45 мг |
| Добавьте 90 мл 0,02 М фосфатного буфера в 250 мл стеклянной бутылки мультимедиа, завернутые в алюминиевую фольгу. | ||
| Смешайте в реагентах, перечисленных с магнитным перемешиванием. Разрешить компоненты для растворения в одночасье. | ||
| Раствор Vortex и фильтр очищайте с помощью системы фильтрации в стерильную стеклянную бутылку 250 мл. | ||
| Заверните бутылку в алюминиевую фольгу и храните раствор при комнатной температуре. | ||
Таблица 3: Решение для соответствия рефракционному индексу (RIMS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клеточные взаимодействия между кардиомиоцитами и немиоцитов населения являются определяющим фактором ли сердце будет проходить фиброз или ремонт после травмы. Открытия были сделаны, демонстрируя, что различные типы клеток, в том числе нервы14, эпикардиальные клетки24, перитонеальные макрофаги25,артериол12,13, и лимфатические эндотелиальные клетки26, все играют важную роль в посредничестве сердечного ремонта. Эти линии клеток и другие, представляющие интерес, могут быть генетически прослежены во время развития, болезни и регенерации, применяя технологии Cre-lox и CRISPR-Cas9 у мышей. В сочетании с очисткой органов и передовыми методами микроскопии, вклад немиоцитных популяций может быть точно оценен, открывая дверь для выяснения клеточных и молекулярных целей регенерации миокарда после травмы.
Эффективность протокола зависит от последовательной и воспроизводимой перевязки LAD во время операции по окклюзии коронарной артерии. Неонатальный мышей чувствительны к длительному воздействию переохлаждения; таким образом, операция должна быть выполнена не только с точностью, но и в течение нескольких минут. От начала до конца операция по инфаркту миокарда должна занять менее 8 минут. Мы рекомендуем сначала практиковать на нескольких пометах того же фона, что и экспериментальные мыши, пока не будет достигнуто знание.
Прогрессирование сердечного ремонта можно оценить с помощью эхокардиографии для измерения сердечной функции (т.е. дробное сокращение, фракция выброса, систолический и диастолический объем) один раз в течение 3-7 дней после операции и снова незадолго до сбора сердца , предложил между 21-и 28-дневной травмы после. Сердца могут быть собраны для очистки в нескольких тайм-пойнтах после операции инфаркта миокарда.
Шаг очистки (шаг 2.17) зависит от изменения продолжительности в зависимости от возраста и деформации мыши, из которой было собрано сердце, что может привести к различиям в размере сердца. Для фоновой мыши B6 продолжительность очистки в зависимости от возраста оценивается следующим образом: P1 (7-10 дней), P7 (14-17 дней), P14 (21-24 дня), P21 (28-31 дней), P28 (35-38 дней). Хотя основной фокус нашей лаборатории очистки сердца, наш пассивный метод CLARITY был успешным для очистки легких мышей (неопубликованные результаты), и мы предвидим никаких ограничений на широкое применение этого к другим органам. В целом, наш ускоренный процесс очистки высоко ценится за способность быстро и эффективно очищать ткани.
Следует отметить, что осложнения могут возникнуть при применении методов очистки тканей в органах с эндогенными репортерами в редких субпопуляциях. Сигнал репортера в плотных популяциях клеток (таких как миоциты23),кажется, более устойчивы к процессу очистки и, таким образом, сигнал обычно сохраняется; однако, другие более чувствительные популяции клеток (например, сердечные нервы) склонны к эндогенному флуоресцентному сигналу белка, утоленному после длительной фиксации или очистки. Это стало очевидным в Actl6bCre; Rosa26tdT модель мыши репортера, где сердца P7 фиксированной кратко в течение 15 минут показали сильный сигнал tdT(Рисунок 3A), однако этот флуоресцентный сигнал был угасать после фиксации в течение 1 часа или ночной инкубации в клиринговое решение (данные не показаны). В сценарии потерянного сигнала репортера, окрашивая антитела пристреливая протеин репортера совместим с прояснением ткани для того чтобы усилить сигнал(рисунок 3). Добавление иммуномаркировки шаг может быть выгодным для тканей, проходящих обширную визуализацию, как конъюгированные антитела отбеливатель устойчивостью и производить стабильное, долгосрочное выражение. С возможностью отслеживания белков эндогенно и с помощью иммуностоинга, наш протокол однозначно позволяет для точной локализации редких популяций сердечной клетки, которые находятся глубоко в сердце.
Очищенные сердца могут пройти отслеживание линии или флуоресцентный анализ экспрессии белка с помощью цельномонтажной 3D конфокальной микроскопии. Конфокальный микроскоп оснащен лазерными линиями, оптимизированными для возбуждения флорестатных репортеров (или спряженых вторичных антител), например: BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) и APC (Cy5, Alexa Fluor 647) на 405 нм, 488 нм, 561 нм и 683 нм соответственно. Для сердца образцы не в состоянии поместиться в депрессии слайд - общие, если сердце собрали послеродовой - пользовательские депрессии слайд может быть сделано путем 3D-печати на полипропилене. Пользовательские слайды следуют размеры микроскопа депрессии слайд (25 мм х 75 мм х 1 мм), изменяя глубину скважины либо 6,5 мм или 17 мм(рисунок 4).
Для того, чтобы визуализировать репортер ателье клеточные линии в 3D, конфокальный микроскоп установлен для приобретения z-сложены изображения по всему сердцу. При визуализации больших сердец, все сердце не может быть в состоянии быть захвачены в одном z-штабированных изображения даже с низким увеличением цели. В этом сценарии ряд несколько z-сложенных изображений, сделанных в различных областях сердца, могут быть сшиты вместе с помощью большой функции изображения. Это достигается путем калибровки микроскопа в соответствующую объективную линзу и определения поля для большой области сканирования изображения. Затем изображения z-stacked проходят 3D-реконструкцию с использованием программы рендеринга громкости и проекции максимальной интенсивности(рисунок 3). Полученные изображения с высоким разрешением могут быть проанализированы для определения точного трехпревосходителенного узора пространственных клеток целевых популяций клеток.
В совокупности этот протокол обеспечивает мощный молекулярный инструмент для понимания динамических клеточных изменений, которые происходят во время восстановления и регенерации сердца. Этот метод описывает шаги, чтобы вызвать инфаркт миокарда, выполнить очистку всего органа, проследить конкретные популяции клеток, и анализ 3D-клеточного узора. Вместе эти методы обеспечивают доступ к популяциям клеток, которые ранее были недоступны из-за их разреженного присутствия или расположения в тканях. Это позволит провести дальнейшее исследование вопросов, имеющих первостепенное значение для продвижения терапевтических подходов в регенеративной медицине, особенно тех, которые направлены на стимулирование эндогенной регенерации сердца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Финансирование этого проекта было предоставлено UW школа медицины и общественного здравоохранения из Висконсина партнерства программы (A.I.M.), и Американской ассоциации сердца Карьера Развития премии 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
- Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
- Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
- Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
- Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
- Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).
