Summary
Membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC) is een nieuwe methode om de cultuur volwassen menselijke adipocyten. Hier beschrijven we hoe adipocyten te isoleren van menselijke veten en hoe maac op te zetten.
Abstract
Witte vetweefsel (WAT) dysregulatie speelt een centrale rol in de ontwikkeling van insulineresistentie en type 2 diabetes (T2D). Om nieuwe behandelingen voor T2D te ontwikkelen, zijn meer fysiologisch relevante in vitro adipocyte modellen nodig. Deze studie beschrijft een nieuwe techniek om volwassen menselijke adipocyten te isoleren en te kweken. Deze methode is getiteld MAAC (membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur), en in vergelijking met andere adipocyte in vitro modellen, MAAC bezit een adipogene gen handtekening die het dichtst bij vers geïsoleerde volwassen adipocyten. Met behulp van MAAC, adipocyten kunnen worden gekweekt van magere en zwaarlijvige patiënten, verschillende vetbakken depots, co-gekweekt met verschillende celtypes, en belangrijker nog, kan worden gehouden in de cultuur voor 2 weken. Functionele experimenten kunnen ook worden uitgevoerd op MAAC met inbegrip van glucose opname, lipogenese, en lipolyse. Bovendien reageert MAAC robuust op divers farmacologische agonisme en kan het worden gebruikt om adipocyte fenotypische veranderingen te bestuderen, waaronder de transdifferentiatie van witte adipocyten in bruinachtige vetcellen.
Introduction
De wereldwijde toename van obesitas en obesitas-gerelateerde co-morbiditeiten vereist de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Wit vetweefsel (WAT) is een belangrijke regulator van het metabolisme van het hele lichaam, energie homeostase, en is een centrale speler in de ontwikkeling van insulineresistentie en type 2 diabetes (T2D)1,2. Tijdens chronisch overmatig calorieverbruik vergroten adipocyten om het overschot aan energie aan te kunnen. De opslagcapaciteit van adipocytelipiden kan echter worden overschreden, wat resulteert in een verhoging van de circulerende niveaus van vetzuren en een verhoogde opslag in perifere niet-vetweefsel en leidt tot lipotoxiciteit3,4.
Het ontbreken van adipocyte in vitro modellen met een hoge translationele relevantie is een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor obesitas en T2D. Het ex vivo explantmodel, waarbij kleine stukjes vetweefsel worden gekweekt, wordt geassocieerd met snelle veranderingen in adipogene genexpressie gedreven door hypoxie en ontsteking5,6. Plafondculturen (CC's) waar volwassen adipocyten zweven en zich aan de bovenkant van met media gevulde kolven hechten, maken zich snel onderscheid in fibroblastachtige cellen zonder lipide7,8,9,10. Het meest gebruikte model is adipocyten onderscheiden in vitro van toegewijde precursoren. De gedifferentieerde cellen zijn echter morfologisch onderscheiden van volwassen adipocyten in vivo, omdat ze veel kleiner in omvang en gebrek aan een unilocular lipide druppel. Andere beperkingen met dit model zijn de onfysiologische behoefte aan een chemische cocktail om differentiatie te stimuleren, evenals variabiliteit in differentiatie-efficiëntie die kan worden beïnvloed door een aantal factoren11,12,13,14.
We hebben onlangs ontwikkeld membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC), een methode voor de lange termijn cultuur van vers geïsoleerde volwassen adipocyten, waar adipocyten worden gekweekt onder doorlaatbare membranen10. Onbevooroordeelde analyse van RNA-sequencing-gegevens heeft aangetoond dat ten opzichte van vetweefselexplants en in vitro-gedifferentieerde adipocyten, MAAC het meest lijkt op vers geïsoleerde adipocyten. MAAC kan worden gebruikt om de cultuur volwassen adipocyten geïsoleerd van zowel onderhuids ei- en viscerale vetweefsel, evenals adipocyten van zowel zwaarlijvige en magere onderwerpen. Deze methodologie maakt de studie van de lange termijn adipocyte fenotypische veranderingen en vergemakkelijkt co-cultuur van adipocyten met andere celtypes. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van volwassen adipocyten van menselijk vetweefsel en hoe het MAAC-systeem op te zetten.
Protocol
Anonieme monsters van vetweefsel werden verzameld uit de buikstreek van vrouwelijke patiënten die een electieve operatie ondergingen in het Sahlgrenska University Hospital in Göteborg, Zweden. Alle proefpersonen ontvingen schriftelijke en mondelinge informatie alvorens schriftelijke geïnformeerde toestemming te geven voor het gebruik van het weefsel. De studies werden goedgekeurd door de Regionale Ethische Toetsingsraad in Göteborg, Zweden.
OPMERKING: Een overzicht van de methode is opgenomen in figuur 1.
1. Voorbereiding van buffers, weefselcultuurmedia en cultuurplaten
- Bereid een 5x Krebbs Ringer (KR) voorraad door het oplossen van 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4,en 1,48 g mgso4·7H2O in 900 mL water. Voeg 1,84 g CaCl2·2H2O toe en pas het volume aan op 1 L door water toe te voegen. Steriel filter door een 0,22 μm-filter en bewaar bij 4 °C.
- Bereid uit de 5x KR-voorraad 1 L buffer voor met 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM glucose en 2% runderserumalbumine (BSA) (hierna "wasbuffer" genoemd). Pas de pH aan op 7,4.
- Bereid 500 mL collageenase buffer met 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2,2% BSA, en 450 mL water (hierna aangeduid als vergistingsbuffer).
OPMERKING: De collageen mag pas aan de vergistingsbuffer worden toegevoegd nadat het vetweefsel in stap 2.2 is gewogen. - Pas de pH van Medium 199 aan op 7,4.
- Steriel filter zowel buffers als medium 199 door middel van een filterkolf van 0,22 μm en warm tot 37 °C.
OPMERKING: Om tijd te besparen, kunnen de weefselkweekmedia worden voorbereid en aan platen worden toegevoegd voordat het vetweefsel wordt verwerkt. Gebruik voor een 24-well plaatformaat (figuur 1A), 0,5−1 mL/put van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium/Ham's voedingsmengsel F12 (DMEM/F12), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine (penn/strep) en 20 nM insuline. Kleine moleculen en andere stabiele farmacologische middelen kunnen op dit moment ook in de gewenste lay-out aan de media worden toegevoegd. Plaats de platen in een weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
2. Dissectie van menselijk onderhuids vetweefsel
OPMERKING: Werk binnen een biologische veiligheidskast en gebruik steriele techniek gedurende het isolatieproces, evenals exclusief gebruik van autoclaved en steriele apparatuur.
- Plaats het menselijke vetweefsel in een petrischaal van 15 cm en voeg een klein volume medium 199 toe om het gehydrateerd te houden tijdens de dissectie.
- Werken met stukken vet ongeveer de grootte van een golfbal, pak grote vezelachtige vaten met pincet en laat de adipocyten voorzichtig los door de vetmaag te schrapen met de achterkant van de gesloten schaar. Gooi de grote stukken vezelig weefsel weg. Weeg het bijgesneden vet.
3. Collagenase Behandeling
- Voeg collageen ase toe aan de spijsverteringsbuffer (zie stap 1.3) bij een concentratie van 1 mg/mL. Steriel filter de oplossing met behulp van een 0,22 μm steriel filter.
OPMERKING: Drie mL vergistingsbuffer per gram vet wordt aanbevolen (d.w.z. voor 100 g vet, bereid 300 mL vergistingsbuffer voor met 300 mg collageen van type 2).
LET OP: Type 2 Collagenase is gevaarlijk voor ogen, huid en kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Draag handschoenen, oogbescherming, en werk in een geventileerde kap bij het hanteren van de collageenase. - Beweeg ongeveer 10 g vetweefsel naar een petrischaal van 15 cm en hak het vet voorzichtig af met behulp van een gebogen schaar totdat het een glad homogeen mengsel wordt en er geen grote stukken vet meer over zijn. Herhaal het proces totdat al het vet is verwerkt.
OPMERKING: Elke ronde moet ongeveer 2 min duren en de vetstukken moeten klein genoeg zijn, zodat ze kunnen worden gepipettteerd met behulp van een breed-boring pipet tip. Deze stap is cruciaal voor het opleveren van hoge kwaliteit adipocyten. Als de stukken te groot zijn, zullen de verteringstijden moeten worden verlengd, waardoor de celviabilty in gevaar komt. - Breng het gehaktvet met een lepel in 50 mL conische buizen. Voeg 10 mL gehakt weefsel en 30 mL spijsverteringsbuffer toe aan elke buis. Schaal naar de juiste volumes als er minder dan 10 mL gehakt vet beschikbaar is.
- Vermeer het weefsel bij 37 °C in een schuddende couveuse met constante agitatie bij 150 rpm gedurende 30−45 min. Controleer na 30 min het proces om de 5 min om oververte ring te voorkomen.
LET OP: De spijsvertering is compleet wanneer de vetoplossing homogeen is zonder grote stukken en een abrikozenkleur heeft.
4. Filtratie van de celsuspensie en zuivering van de volwassen adipocyten
- Plaats een trechter bovenop een steriele kolf van 1 L en plaats een steriel 250 μm meshfilter in de trechter. Giet de verteerde vetoplossing in het filter om het onverteerd weefsel te verwijderen.
- Wanneer alle adipocyte nuspensie door het filter is gegaan, knijp je voorzichtig in het mesh-filter om de opbrengst van adipocyten te verhogen. Giet ongeveer 50−100 mL wasbuffer in het filter om het te spoelen en knijp het filter opnieuw.
- Giet de geïsoleerde adipocyte suspensie uit de kolf in een scheidingstrechter en voeg wasbuffer toe totdat de trechter bijna volledig gevuld is. Keer de trechter een paar keer voorzichtig om de adipocyte suspensie met de buffer te mengen.
- Laat de suspensie 2−3 min staan tot er een duidelijke scheiding van 2 lagen(figuur 1B),met een bovenste gele laag met de volwassen adipocyten en vrije lipide en een onderste laag met de buffer en de vetlijn stroma vasculaire fractie (SVF).
- Open het mondstuk op de scheidingstrechter en elute de bodemoplossing langzaam in een steriele kolf (cellen uit de SVF kunnen na centrifugatie worden gepelleteerd en verzameld op 200 x g voor 7 min). Houd de bovenste laag met de volwassen adipocyten in de scheidingstrechter.
- Herhaal het wasproces in stappen 4.3−4.5 drie keer om de volwassen adipocyten grondig te wassen en alle collageen te verwijderen.
5. Verpakking van de volwassen adipocyten
- Open het mondstuk en verzamel de gezuiverde volwassen adipocyte suspensie in 50 mL conische buizen.
- Pak de volwassen adipocyten licht in door de buizen 3 min op 50 x g te draaien.
- Gebruik een naald van 18 G en een spuit om de resterende wasbuffer onder de adipocytessussus te verwijderen.
- Verwijder de vrije lipidelaag (olie uit het kleine gedeelte van adipocyten die tijdens de isolatieprocedure brak) drijvend bovenop de rijpe adipocyten met behulp van een pipet.
OPMERKING: Om het risico te verminderen dat de adipocyten in stap 6.5 van de membranen zullen druppelen, is het belangrijk dat de lipidelaag en alle wasbuffer zijn verwijderd wanneer de volwassen adipocyten op membranen worden gezaaid. Om deze reden verzamelen de adipocyten in 3 buizen. De monsters die als laatste worden verzameld, hebben de meeste overdrachtslipiden en zijn daarom van de laagste kwaliteit. Echter, met zorgvuldige pipetteren deze monsters kunnen worden gebruikt.
6. Zaaien van volwassen adipocyten
- Open de verpakking met de doorlatende membraaninserts(Tabel met materialen)en haal de membraancomponent eruit. Draai het ondersteboven en plaats op een steriel oppervlak, zodat de membranen het plafond onder ogen zien.
- Pipetteer 30 μL verpakte volwassen adipocyten op elk van de membranen (figuur 1C). Raak het membraan niet aan met de punt. Gebruik breed-boring pipet tips om de cellen zaad, of gebruik schaar af te snijden een klein stukje van een pipet tip om het breder te maken.
- Voorzichtig omkeren van de 50 mL buizen met verpakt adipocyten meerdere malen tijdens het zaaiproces om een gelijkmatige verdeling van adipocyten met verschillende maten te garanderen.
- Breng de geprepareerde multiwell platen met de media van de couveuse naar de bioveiligheidskast en verwijder de deksels. Pak de membranen gezaaid met adipocyten en pak het van de bodem, zodat het kan worden omgekeerd in stap 6.5.
- In een vloeiende beweging omkeren van de membranen met de adipocyten op de top, zodat de gezaaide adipocyten zijn nu naar beneden (Figuur 1D). Laat de plaat met adipocyten zakken in de putten met media (figuur 1E).
- Leg het deksel op de plaat en breng de plaat voorzichtig over in een weefselkweekincubator. Vermijd een snelle beweging van de plaat, omdat adipocyten gemakkelijk kunnen worden losgemaakt in eerste instantie.
OPMERKING: Het duurt een paar dagen voor de cellen om steviger hechten aan het membraan.
7. Onderhoud van Adipocyten en oogsten voor analyse
- Verander de media ten minste om de 7 dagen. Verwijder en voeg media toe via het uitsparingsgat in elke membraanwisselplaat. Om de media te verwijderen, gebruik een spuit en een naald, een aspirating wand, of een pipet met een p200 tip. Om media toe te voegen, gebruik maken van een pipet en langzaam pipet nieuwe media in de putten langs de zijkant van de muur om te voorkomen dat het verstoren van de adipocyten.
LET OP: Adipocyten zijn gekweekt voor 2 weken met een media-verandering na 7 dagen. Verschillende adipose oorsprong en experimentele vragen kunnen echter baat hebben bij toegenomen veranderingen in de media. - Om RNA te oogsten, verwijdert u de media zoals beschreven in stap 7.1 en voegt u 500 μL lysisbuffer(Tabel met materialen)direct toe in de putten om de cellen te lyseren. Om de cellen voor beeldvorming te repareren, voeg formaldehyde direct toe aan de put bij een eindconcentratie van 1%.
LET OP: De cellen kunnen vervolgens bij 4 °C worden opgeslagen.
Representative Results
Volwassen adipocyten gekweekt als MAAC behoudt hun functie, fenotype, en kan worden gebruikt om adipocyte reacties op verschillende farmacologische behandelingen te bestuderen. Na 1 week van cultuur MAAC geïsoleerd van onderhuids vetweefsel handhaven van de karakteristieke unilocaire lipide druppel die alleen gevonden in volwassen adipocyten (Figuur 2A). MAAC werd gedurende 1 week gekweekt terwijl ze werd behandeld met de PPARγ agonisten rosiglitazone (Rosi) en pioglitazone (Pio), of de glucocorticoïde receptor (GR) agonist dexamethason (Dex) om te bepalen of verschillende nucleaire hormoonreceptor (NHR) agonisten voorspelde veranderingen in downstream doelgenen in MAAC drijven. Rosi en Pio verhoogden de expressie van de PPARγ responsieve genen FABP4 en LPL met respectievelijk 4 en 2−3 keer, terwijl dexamethason geen effect had (figuur 2B). Op dezelfde manier dreef dexamethason de genexpressie van de GR-doelgenen APOD en FKBP5 met respectievelijk 13- en 55-voudige, terwijl de PPARγ-agonisten geen significante effecten hadden. We hebben eerder aangetoond dat vers geïsoleerde menselijke volwassen witte adipocyten kunnen transdifferentdifferentiëren in een bruin-achtig fenotype in MAAC wanneer behandeld met Rosi10. Een 7-daagse behandeling met Rosi of Pio zorgde voor een robuuste expressie van het bruine vetspecifieke gen UCP1 met 44-65 keer, evenals verhoogde de expressie van de bruine vetmarker PDK4 12-18 maal (figuur 2C).
Figuur 1: Visueel diagram van MAAC-installatie. (A) Bereiding van medium. (B) Isolatie en verpakking van volwassen adipocyten. (C) Zaaien volwassen adipocyten op membranen. (D) Het omkeren van membranen terwijl adipocyten verbonden blijven. (E) Het verlagen van de membranen in het medium en het veranderen van het medium. Dit cijfer is gewijzigd van Harms et al.10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: MAAC behoudt eeneens verschijnen gedurende een week en reageert op divers farmacologische agonisme. (A) Vertegenwoordiger 4x en 10x heldere veld beelden van MAAC na een week van cultuur. Adipocyten met een gemiddelde diameter van 100 μm met grote unilocaire lipidedruppels zijn gemakkelijk waarneembaar. (B) mRNA-niveaus van PPARγ-doelgenen en glucocorticoïdereceptor (GR) richten zich op genen in MAAC na 7 dagen behandeling met voertuig (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) of dexamethason (Dex). Rosi, Pio en Dex werden allemaal gebruikt bij een eindconcentratie van 10 μM. (C) mRNA niveaus van bruin vet verrijkte genen in MAAC na 7 dagen behandeling met voertuig (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio), of dexamethason (Dex). Rosi, Pio en Dex werden allemaal gebruikt bij een eindconcentratie van 10 μM. Voor alle genexpressiegegevens werd TATA-bindend eiwit (TBP) gebruikt als interne normalisatiecontrole. Statistieken werden berekend aan de hand van eenrichtingsanova met de meerdere vergelijkingenvan Tukey. (gemiddelde ± SD, n = 3, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC) is een nieuwe methode voor de lange termijn cultuur van vers geïsoleerde volwassen adipocyten. Bij het opzetten van MAAC zijn er een paar kritische stappen in het protocol die een grote impact hebben op de opbrengst, kwaliteit en levensvatbaarheid van de volwassen adipocyten. Veel inspanning moet worden gestoken in het snijden van het vet in stap 3.2, omdat deze stap direct van invloed op de hoeveelheid tijd de adipocyten worden blootgesteld aan de collageenase. Als de stukken vet te groot zijn, zal de verteringstijd moeten worden verlengd, wat een negatieve invloed heeft op de levensvatbaarheid van de cellen. Omgekeerd, als het weefsel te fijn wordt verwerkt met een schaar, kan de levensvatbaarheid ook worden beïnvloed. Voor een succesvolle cultuur van volwassen adipocyten als MAAC, moet men speciale aandacht besteden aan de volgende stappen: voor het succesvol zaaien van de adipocyten op de membranen, is het van cruciaal belang dat gratis lipide en carryover wasbuffer wordt verwijderd uit de volwassen adipocyten in de stappen 5.3 en 5.4. Resterende lipide of wasbuffer vermindert de oppervlaktespanning van de adipocyten en verhoogt het risico op adipocyten die van de membranen druipen wanneer ze worden omgedraaid. Wanneer de adipocyten worden gezaaid en in de media, blijven de cellen in contact met het membraan voornamelijk door drijfvermogen, dus een langzame en zachte techniek wordt aanbevolen bij het veranderen van media om geen cellen te verliezen. Verwijder media van de onderkant van de putten zoals beschreven in stap 7.1 en voeg media toe door langzaam media langs de zijkanten van de muren te besmeifen. Ten slotte is een tijdbesparende suggestie om de platen voor te bereiden met media en behandelingen vóór het adipocyte isolatieproces. Met name voor complexe experimentele ontwerpen kan het voorbereiden van de platen veel tijd besparen en zorgt ervoor dat de adipocyten met hun behandelingen in de media worden geplaatst zodra ze geïsoleerd zijn.
Een voordeel van het gebruik van MAAC in vergelijking met het onderscheiden van preadipocyten is dat de GEBRUIKTE MAAC-media is zeer eenvoudig en vereist geen onfysiologischhormoon cocktail. Hier hebben we gekweekt MAAC in glucose-rijke media (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn / strep, en 20 nM insuline. Belangrijk is dat we hebben geconstateerd dat insuline absoluut nodig is voor de rosiglitazone /pioglitazone gedreven inductie van UCP110. Insuline is echter niet nodig om het adipogene fenotype van de cellen te behouden. Dus, afhankelijk van de experimentele vraag, insuline kan worden opgenomen of weggelaten.
De hierboven beschreven procedure is geoptimaliseerd voor de isolatie en cultuur van menselijke adipocyten. Echter, muis, en eventueel adipocyten van andere organismen, kan ook worden gekweekt als MAAC. Als muis adipocyten moeten worden gekweekt als MAAC zijn er extra overwegingen en voorzorgsmaatregelen die in gedachten moeten worden gehouden. We hebben ontdekt dat volwassen adipocyten van muizen veel kwetsbaarder zijn dan die van mensen. Als gevolg hiervan moet de verteringstijd worden verkort tot een absoluut minimum om de levensvatbaarheid van de cel te verhogen. We vonden ook dat adipocyten van jonge muizen (8 weken oud en jonger) de meest robuuste en reproduceerbare resultaten boden. Ten slotte kan muis MAAC maximaal een week worden gekweekt, maar gezien het feit dat hun adipogene fenotype minder stabiel lijkt dan mensen (die gedurende ten minste twee weken kunnen worden gekweekt) raden we aan om muis MAAC te kweken voor de minimaal vereiste tijd om experimentele vragen.
Aangezien het MAAC-model is gebaseerd op het gebruik van doorlatende membranen, is een voordeel van deze techniek de mogelijkheid om volwassen adipocyten samen te kweken met andere celtypen. We hebben eerder aangetoond dat volwassen adipocyten en macrofagen door het gebruik van MAAC10kunnen crosstalken. Dit opent mogelijkheden om de koppeling tussen obesitas, insulineresistentie en immuunreacties15,16,17verder te onderzoeken. Toekomstige experimenten kunnen andere celtypen bevatten, zoals hepatocyten, preadipocyten, endotheelcellen of alvleeskliercellen om de complexiteit en de translationele relevantie van het MAAC-model verder te vergroten en crosstalk tussen meerdere celtypen te onderzoeken.
Hoewel MAAC is aangetoond superieur te zijn in het handhaven van functionaliteit en identiteit van de adipocyten ten opzichte van andere adipocyten in vitro modellen, het heeft ook beperkingen die moeten worden overwogen. In vergelijking met het gebruik van adipocyten onderscheiden van voorlopercellen, MAAC is een meer moeizaam en tijdrovend model. Platen met membranen zijn ook duurder in vergelijking met gewone celkweekplaten. Belangrijk is dat volwassen adipocyten elke keer bij het zaaien vers geïsoleerd moeten worden en niet kunnen worden uitgebreid of ingevroren in voorraden zoals voorlopercellen. Dit vereist dus toegang tot verse witte vetweefselmonsters, maar voegt ook een mate van complexiteit toe die voortvloeit uit donor- tot donorvariaties.
Hier hebben we een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het isoleren van volwassen adipocyten voor mensen en het opzetten van MAAC. We hebben aangetoond dat adipocyten gekweekt als MAAC levensvatbaar blijft door middel van twee weken, hun adipogene gen handtekening wordt bewaard, en ze reageren op diverse farmacologische agonisme. Met behulp van MAAC zorgt voor de studie van cross-talk betweeen adipocyten en andere celtypes, en de beoordeling van de lange termijn fenotypische veranderingen van volwassen adipocyten in reactie op verschillende stimuli.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Xiao-Rong Peng en Stefan Hallen voor het verstrekken van middelen en het optimaliseren van de adipocyte isolatie, Martin Uhrbom voor technische bijstand, en Daniel Olausson en Malin Lönn voor de coördinatie en het verstrekken van de menselijke adipose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved scissors | |||
| Autoclaved spoons | |||
| Autoclaved tweezers | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Conical tubes, 50 mL | |||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Needles, 18 G, 1.20 mm x 40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
| Petri dishes, 150 mm x 21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
| Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
| Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
| Shaking incubator (37 °C) | |||
| Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| Transwells, 24-well (6.5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
| Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |
References
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Lotta, L. A., et al. Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance. Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).
- Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. Insulin resistance and impaired adipogenesis. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).
- Gesta, S., et al. Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression. Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).
- Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue. Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).
- Asada, S., et al. Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).
- Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues. International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).
- Harms, M. J., et al. Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding adipocyte differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).
- Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease. The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).
- Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. An Integrated View of Immunometabolism. Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).
