Summary
膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)は、成熟したヒトアディポサイトを培養する新しい方法である。ここでは、脂肪細胞をヒト脂肪から分離する方法とMAACを設定する方法について詳しく説明します。
Abstract
白色脂肪組織(WAT)調節不調は、インスリン抵抗性および2型糖尿病(T2D)の開発において中心的な役割を果たす。T2Dの新しい治療法を開発するには、より生理学的に関連するインビトロのアディポサイトモデルが必要です。本研究は、成熟したヒトの分離細胞を分離し、培養するための新しい技術を記述する。この方法は、MAAC(膜成熟性アディポサイト凝集培養)と題され、他の体外モデルと比較して、MAACは新たに分離された成熟したジポサイトに最も近いアディポ形成遺伝子シグネチャを有する。MAACを使用して、脂肪細胞は、赤身および肥満患者、異なる脂肪食貯蔵所、異なる細胞タイプとの共培養、および重要なことに、2週間培養することができる。機能実験は、グルコース取り込み、脂肪形成、脂肪分解を含むMAACでも行うことができる。さらに、MAACは多様な薬理学的作用に対して強固に反応し、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化を含む脂肪細胞表現型変化を研究するために使用することができる。
Introduction
肥満と肥満関連の併存疾患の世界的な増加は、新しい治療法の開発を必要とします。白色脂肪組織(WAT)は、全身代謝の重要な調節因子であり、エネルギー恒常性、およびインスリン抵抗性および2型糖尿病(T2D)1、2の開発における中心的な役割を果たしている。慢性的な過剰なカロリー消費の間に, アディポサイトは、エネルギーの余剰を処理するために拡大します。しかし、脂肪細胞の脂質貯蔵能力を超えることができ、脂肪酸の循環レベルの上昇および末梢非脂肪組織における貯蔵の増加を生じ、3、4の脂肪毒性をもたらす。
高い翻訳関連性を有する体外モデルのアディポサイトの欠如は、肥満およびT2Dのための新しい治療法の開発における重要な課題である。この元生体外出モデルは、脂肪組織の小片が培養されるところ、低酸素症および炎症によって駆動される脂肪形成遺伝子発現における急速な変化と関連している5、6。成熟した脂肪細胞が浮遊し、培地で満たされたフラスコの上に付着する天井培養物(CC)は、脂質7、8、9、10を欠く線維芽細胞様細胞に急速に脱分化する。最も一般的に使用されるモデルは、コミットされた前駆体からインビトロで区別されたアディポサイトです。しかし、分化した細胞は、サイズが非常に小さく、単軌跡性の脂質滴がないため、生体内の成熟脂肪細胞とは形態的に異なる。このモデルの他の制限は、分化を促進するための化学カクテルの非生理学的必要性、ならびに多数の因子11、12、13、14の影響を受け得る分化効率の変動を含む。
我々は最近、膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を開発し、その経時的に分離した成熟した単量体細胞の長期培養のための方法であり、そこで、透過性膜下でアディポサイトが培養される10。RNA配列決定データの公平な分析は、脂肪組織外植体およびインビトロ分化脂肪細胞に対して、MAACが新たに単離された脂肪細胞に最も類似していることを示している。MAACは、皮下脂肪組織と内臓脂肪組織の両方から単離された成熟した脂肪細胞、ならびに肥満および赤身の被験者の両方からの脂肪細胞を培養するために使用することができる。この方法論は、長期の自己細胞のフェノチピック変化の研究を可能にし、他の細胞型との間のアディポサイトの共培養を容易にする。ここでは、ヒト脂肪組織から成熟した脂肪細胞を分離するための詳細なプロトコルとMAACシステムの設定方法を提供します。
Protocol
スウェーデンのヨーテボリにあるサルグレンスカ大学病院で選択的手術を受けている女性患者の腹部から脂肪組織の匿名サンプルを採取した。すべての研究対象者は、組織の使用に関する書面によるインフォームド・コンセントを与える前に、書面および口頭情報を受け取った。研究は、ヨーテボリの地域倫理審査委員会によって承認されました, スウェーデン.
注 : この方法の概要を図 1に示します。
1. バッファー、組織培養培地、および培養プレートの調製
- NaClの35.1 g、KClの1.75 g、KH2PO4の0.82 g、MgSO47H2Oの1.48 gを900 mLの水に溶解して、5xクレブスリンガー(KR)ストックを準備します。CaCl 2・2H2Oの1.84gを加え、水を加えて1Lに調整します。0.22 μm フィルターを通して滅菌フィルターを使用し、4 °C で保管します。
- 5x KRストックから、1X KR、25 mM HEPES、2 mMグルコース、および2%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む1Lのバッファーを準備する(後に洗浄緩衝液と称する)。pHを7.4に調整します。
- 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2、2% BSA、および450 mLの水(以下、消化緩衝液と称される)を含むコラゲターゼ緩衝液500mLを調製する。
注:コラゲターゼは、脂肪組織がステップ2.2で計量されるまで消化緩衝液に添加すべきではありません。 - ミディアム199のpHを7.4に調整します。
- 滅菌フィルターは、0.22 μm フィルターフラスコを介してバッファーおよび媒体 199 の両方をフィルターし、37 °C に暖めます。
注:時間を節約するために、脂肪組織を処理する前に、組織培養培地を準備し、プレートに添加することができます。24ウェルプレートフォーマット(図1A)では、ダルベッコの改良イーグル培地/ハムの栄養混合物F12(DMEM/F12)、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)、20nMインスリンの0.5-1 mL/ウェルを使用します。低分子および他の安定な薬理学的薬剤もまた、所望のレイアウトで培地にこの時点で添加することができる。プレートを組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。
2. ヒト皮下脂肪組織の解剖
注:生物学的安全キャビネット内で作業し、隔離プロセス全体を通して滅菌技術を使用するだけでなく、オートクレーブおよび無菌装置の排他的な使用。
- 15cmのシャーレにヒト脂肪組織を入れ、解剖中に保湿状態に保つために少量の媒体199を加える。
- ゴルフボールとほぼ同じ大きさの脂肪のピースを扱い、ピンセットで大きな線維性血管をつかみ、閉じたはさみで脂肪を掻き取って脂肪細胞をそっと放します。線維組織の大きな部分を捨てます。トリミングされた脂肪の重量を量る。
3. コラゲナーゼ治療
- コラゲターゼを1mg/mLの濃度で消化バッファーに加えます(ステップ1.3を参照)。滅菌は0.22 μmの滅菌フィルターを使用して溶液をフィルターします。
注:脂肪グラム当たり3mLの消化バッファーが推奨されます(すなわち、100gの脂肪の場合、300mgの2型コラゲナーゼを用いて300mLの消化バッファーを準備します)。
注意:タイプ2コラゲナーゼは、目、皮膚に危険であり、呼吸器刺激を引き起こす可能性があります。手袋、目の保護を着用し、コラゲアーゼを扱う際に換気されたフードで作業してください。 - 約10gの脂肪組織を15cmのシャーレに移動させ、滑らかな均質な混合物になり、大きな脂肪が残らないまで、湾曲したはさみを使用して脂肪を慎重にミンチします。すべての脂肪が処理されるまで、このプロセスを繰り返します。
注:各ラウンドは約2分を取る必要があり、脂肪片は、彼らが広いボアピペットチップを使用してピペットすることができるように十分に小さくする必要があります。このステップは、高品質のアディポサイトを生み出すために重要です。破片が大きすぎる場合は、消化時間を延長する必要があり、細胞の介振性を損なう。 - スプーンを使用して50 mL円錐形のチューブにミンチ脂肪を転送します。各チューブに10mLの組織を10mL、消化緩衝液30mLを加えます。10 mL未満のミンチ脂肪が利用可能な場合は、適切な量にスケールダウンします。
- 30-45分間150rpmで一定の撹拌を用いて、37°Cで組織を消化します。30分後、過剰消化を避けるために5分ごとにプロセスをチェックしてください。
注:脂肪溶液が大きな部分を持たずに均質で、アプリコット色を持っているとき、消化は完了します。
4. 細胞懸濁液の濾過と成熟性の薄膜細胞の精製
- 1L滅菌フラスコの上に漏斗を置き、漏斗の中に無菌250 μmのメッシュフィルターを置きます。消化されていない組織を除去するために、フィルターに消化脂肪溶液を注ぎます。
- すべての透視細胞懸濁液がフィルターを通過したら、メッシュフィルターを静かに絞って、アディポサイトの収率を上げます。約50~100mLの洗浄バッファーをフィルターに注ぎ、洗浄し、フィルターを再度絞ります。
- フラスコから分離したアジポサイト懸濁液を分離漏斗に注ぎ、漏斗がほぼ完全に満たされるまで洗浄バッファーを追加します。ファネルを数回軽く反転させ、アディポサイト懸濁液とバッファーを混ぜます。
- 2層の明確な分離(図1B)が存在するまで、2〜3分間の懸濁液を放置し、成熟脂肪細胞と遊離脂質を含むトップイエロー層と、緩衝液と脂肪質間質血管画分(SVF)を含む底層を有する。
- 分離漏斗のノズルを開き、下部溶液を滅菌フラスコにゆっくりと溶出させる(SVFの細胞は、200 x gで7分間ペレジレートして回収することができる)。分離漏斗の成熟した利細胞と最上層を保つ。
- 4.3~4.5の段階で洗浄プロセスを3回繰り返し、成熟した食状のアディポサイトを十分に洗浄し、コラゲターゼをすべて取り除きます。
5. 成熟した利状細胞のパッキング
- ノズルを開き、精製した成熟したアディポサイト懸濁液を50 mL円錐形のチューブに集め、
- 50 x gでチューブを3分間回転させることで、成熟したアディポサイトを軽く詰めます。
- 18G針と注射器を使用して、残りの洗浄バッファーをアディポサイト懸濁液の下に取り除きます。
- ピペットを用いて成熟脂肪細胞の上に浮かぶ遊離脂質層(分離手順で壊れた脂肪細胞の小さな部分から油)を除去する。
注:手順6.5で脂肪細胞が膜から滴り落ちるリスクを減らすために、成熟した脂肪細胞を膜に播種したときに脂質層とすべての洗浄バッファーが除去されたことが重要です。このため、3つのチューブでアディポサイトを収集します。最後に収集されたサンプルは、最も多くの持ち越し脂質を持ち、したがって、最も低品質になります。しかし、注意深くピペットでこれらのサンプルを使用することができます。
6. 成熟したアディポサイトの播種
- 透過性膜挿入物(材料表)を含むパッケージを開き、膜成分を取り出します。それを逆さまに反転し、膜が天井に面するように無菌表面に置きます。
- 各膜にパックされた成熟したアディポサイトのピペット30μL(図1C)。先端で膜に触れないようにしてください。広いボアピペットの先端を使用して細胞を播種するか、ハサミを使用してピペットチップの小片を切り取って広くします。
- 播種プロセス全体を通して、詰まったアディポサイトを含む50 mLチューブを数回静かに反転し、異なるサイズのアディポ細胞の均一な分布を確保します。
- インキュベーターからメディアを含む準備されたマルチウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込み、蓋を取り外します。分化した膜を取り出し、下から掴んで、ステップ6.5で反転できるようにします。
- ある滑らかな動きで、薄膜を上にして、種子化されたアディポサイトが下を向いてるようになりました(図1D)。画素を含むプレートを培地を含む井戸に下ろします(図1E)。
- プレートの上に蓋を置き、慎重に組織培養インキュベーターにプレートを転送します。アディポサイトは最初に容易に外れる可能性があるため、プレートの急速な移動を避けてください。
注:細胞が膜にしっかりと付着するまでに数日かかります。
7. 分析用の利逸細胞の維持と収穫
- メディアを少なくとも 7 日ごとに変更します。各膜インサートの切り抜き穴を通してメディアを取り出し、追加します。培地を取り除くために、注射器と針、吸引杖、またはp200チップのピペットを使用します。培地を追加するには、ピペットを使用し、アディポサイトを乱さないように、壁の側面に沿って井戸にゆっくりと新しい媒体をピペットします。
注:アディポサイトは、7日後に1つの培地変更で2週間培養されています。しかし、異なる脂肪源と実験的な質問は、増加したメディアの変化の恩恵を受ける可能性があります。 - RNAを採取するには、ステップ7.1で説明した方法で培地を取り出し、500 μLのリシスバッファー(材料表)をウェルに直接加えて細胞を除去します。イメージングのために細胞を固定するには、1%の最終濃度でウェルに直接ホルムアルデヒドを加えます。
注:細胞は4°Cで保存することができます。
Representative Results
MAACとして培養された成熟したジポサイトは、その機能、表現型を保持し、様々な薬理学的治療に対するアディポサイト応答を研究するために使用することができる。皮下脂肪組織から単離された1週間後の培養後MAACは、成熟脂肪細胞にのみ見られる特徴的な単発脂質液滴を維持する(図2A)。MAACは、PPARγアゴニストロシグリタゾン(Rosi)およびピオグリタゾン(ピオ)、またはグルココルチコイド受容体(GR)アゴニストデキサメタゾン(Dex)のいずれかで処理しながら1週間培養し、MAACの下流標的遺伝子の変化を予測した。ロージとピオは、PPARγ応答性遺伝子FABP4およびLPLの発現をそれぞれ4倍と2-3倍ずつ増加させたが、デキサメタゾンは効果がなかった(図2B)。同様に、デキサメタゾンは、GR標的遺伝子APODおよびFKBP5の遺伝子発現をそれぞれ13倍および55倍ずつ強く駆動し、PPARγアゴニストは有意な効果を有しなかった。我々は以前、孤立したヒトの成熟した白色の色素細胞が、Rosi10で処理するとMAACの褐色様表現型に分化できることを実証した。ロージまたはピオによる7日間の治療は、褐色脂肪特異的遺伝子UCP1の遺伝子発現を44〜65倍に強く誘導し、並びに褐色脂肪マーカー PDK4 12-18倍の発現を増加させる(図2C)。
図1:MAACセットアップのビジュアルダイアグラム(A) 培地の準備(B) 成熟したアディポサイトの分離とパッキング。(C) 成熟したアディポサイトを膜に播種する。(D) アディポサイトを付けたまま膜を反転させる。(E) 培地中に膜を下げ、培地を交換する。この図は Harms らの10から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MAACは1週間を通して単色の外観を維持し、多様な薬理学的作用に応答する。(A) 1週間培養後のMAACの代表4xおよび10倍明視野画像。大きな単球脂質滴を持つ100μmの平均直径を有する脂肪細胞は容易に識別可能である。(B)PPARγ標的遺伝子およびグルココルチコイド受容体(GR)のmRNAレベルは、MAACにおいて、7日間の治療後に、ビヒクル(Vehc)、ロシグリタゾン(Rosi)、ピオグリタゾン(Pio)、またはデキサメタゾン(Dex)を標的とする。ロージ、ピオ、デックスは、7日間の治療後にMAAC(Vehc)、ロシグリタゾン(Rosi)、ピオグリタゾン(Pio)、またはデキサメタゾン(Dex)で10μM(C)の褐色脂肪濃縮遺伝子の最終濃度で使用されました。ロージ、ピオ、デックスは、すべて10μMの最終濃度で使用しました。すべての遺伝子発現データについて、TATA結合タンパク質(TBP)を内部正常化制御として用いた。統計は、Tukeyの多重比較検定を用いて一方向分散分析を使用して計算されました。(平均 ± SD, n = 3, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)は、新たに単離された成熟した単離された成熟したアディポサイトの長期培養のための新しい方法である。MAACの設定では、成熟したアディポサイトの収量、品質、生存率に大きな影響を与えるプロトコルにいくつかの重要なステップがあります。このステップは脂肪細胞がコラゲナーゼに曝される時間に直接影響を与えるので、ステップ3.2で脂肪をミンチすることに多くの努力を入れるべきである。脂肪の断片が大きすぎる場合、消化時間を延長する必要があり、細胞の生存率に悪影響を及ぼす。逆に、組織がハサミであまりにも細かく処理された場合、生存率も同様に影響を受ける可能性があります。MAACとして成熟した脂肪細胞の培養を成功させるためには、脂肪細胞を膜に播種するためには、遊離脂質と持ち越し洗浄バッファーを成熟脂肪細胞から除去することが重要です。の手順 5.3 と 5.4 で説明します。残りの脂質または洗浄バッファーは、脂肪細胞の表面張力を低下させ、脂肪細胞が反転したときに膜を滴下するリスクを高めます。アディポサイトが播種され、培地中で、細胞は主に浮力を介して膜と接触したままであるため、細胞を失わないよう培地を交換する際にはゆっくりと穏やかな技術が推奨されます。手順 7.1 で説明したように、ウェルの底からメディアを取り出し、壁の側面にゆっくりとメディアをピペットで取り込んでメディアを追加します。最後に、時間を節約する提案は、アディポサイト分離プロセスの前に媒体および治療でプレートを準備することです。特に複雑な実験計画の場合、プレートを事前に準備することで、多くの時間を節約でき、分離されるとすぐにアディポサイトが培地に入れられます。
分化前生細胞と比較してMAACを使用することの1つの利点は、使用されるMAAC培地が非常に単純であり、非生理学的ホルモンカクテルを必要としないことです。ここでは、グルコースリッチ培地(DMEM/F12)、10%FBS、1%ペン/ストレップ、および20 nMインスリンでMAACを培養しました。重要なことに、UCP110のロシグリタゾン/ピオグリタゾン駆動誘導にはインスリンが絶対に必要であることがわかりました。しかし、インスリンは、細胞のアディポゲン表現型を維持するために必要とされない。したがって、実験の質問に応じて、インスリンを含めるか省略することができる。
上で詳述した手順は、ヒトの分離および培養のために最適化された。しかし、マウス、およびおそらく他の生物のアディポサイトは、MAACとして培養することもできる。マウスのジポサイトを MAAC として培養する場合は、留意すべき追加の考慮事項と注意事項があります。我々は、マウスからの成熟したアディポ細胞がヒトのものよりもはるかに脆弱であることを発見した。その結果、細胞の生存率を高めるために、消化時間を絶対的な最小値に短縮する必要があります。また、若いマウス(生後8週間以下)のアディポサイトが最も堅牢で再現性の高い結果を提供することがわかりました。最後に、マウスMAACは最大1週間培養できますが、その画素性表現型がヒトよりも安定していないように見えることを考えると(少なくとも2週間は培養することができます)、対処に必要な最小限の時間はマウスMAACを培養することをお勧めします実験的な質問。
MAACモデルは透過性膜を用いて行われているため、この技術の利点の1つは、成熟したアディポサイトを他の細胞型と共培養する可能性です。我々は以前MAAC10を使用してクロストークする成熟したアディポサイトおよびマクロファージの能力を実証した。これは、さらに肥満、インスリン抵抗性、および免疫応答15、16、17との間の結合を探求する機会を開きます。今後の実験では、肝細胞、前皮細胞、内皮細胞、膵臓細胞などの他の細胞タイプを組み込んで、MAACモデルの複雑さと翻訳関連性をさらに高め、複数の細胞タイプ間のクロストークを調査することができます。
MAACは、他の体外モデルに対する他のアディポサイトの機能性および同一性を維持する上で優れていることが示されているにもかかわらず、考慮する必要がある制限も有する。前駆細胞から分化したアディポサイトを使用するのと比較して、MAACはより手間がかかり、時間のかかるモデルです。膜を有するプレートも、通常の細胞培養プレートに比べて高価です。重要なことに、成熟したアディポサイトは播種するたびに新たに分離する必要があり、前駆細胞のようなストックに拡大または凍結することはできません。したがって、これは新鮮な白色脂肪組織サンプルへのアクセスを必要とするが、ドナーからドナーのバリエーションに起因する複雑さのレベルも追加する。
ここでは、ヒト成熟した食細胞を分離し、MAACを設定するための詳細なプロトコルを提示しました。我々は、MAACとして培養されたアディポサイトが2週間を通して生存可能であり、その有限性遺伝子シグネチャが保存され、多様な薬理学的作用に反応することを実証した。MAACを使用すると、クロストークベトウィーンのアディポサイトおよび他の細胞タイプの研究、および異なる刺激に応答して成熟したアディポサイトの長期的な表型変化の評価が可能になります。
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、資源を提供し、アディポサイトの孤立を最適化してくれたシャオ・ロン・ペンとステファン・ハレン、技術支援のためのマーティン・ウールボム、そして人間の脂肪を調整し、提供してくれたダニエル・オラウソンとマリン・レンに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved scissors | |||
| Autoclaved spoons | |||
| Autoclaved tweezers | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Conical tubes, 50 mL | |||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Needles, 18 G, 1.20 mm x 40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
| Petri dishes, 150 mm x 21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
| Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
| Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
| Shaking incubator (37 °C) | |||
| Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| Transwells, 24-well (6.5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
| Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |
References
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