Summary
Descrevemos um sistema de cultura in vitro de matriz extracelular em 3D que permite a dissecação dos papéis da matriz e dos adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo.
Abstract
A matriz extracelular (ECM) desempenha um papel central na regulação da homeostase dos tecidos, envolvendo-se em crosstalk com as células e regulando múltiplos aspectos da função celular. O ECM desempenha um papel particularmente importante na função do tecido adiposo na obesidade, e alterações na deposição e composição de ECM do tecido adipoto estão associadas à doença metabólica em camundongos e humanos. Modelos in vitro tratáveis que permitem a dissecação dos papéis do ECM e células em contribuir para o fenótipo global de tecidos são escassos. Descrevemos um novo modelo 3D in vitro da cultura humana ECM-adipócito que permite o estudo dos papéis específicos do ECM e adipócitos na regulação do fenótipo metabólico do tecido adiposo. O tecido adiposo humano é decelularizado para isolar o ECM, que é posteriormente repovoado com preadipócitos que são então diferenciados dentro do ECM em adipócitos maduros. Este método cria construções de ECM-adipócitoque são metabolicamente ativas e retêm características dos tecidos e pacientes dos quais são derivados. Usamos este sistema para demonstrar o crosstalk ecm-adipócito específico da doença no tecido adiposo humano. Este modelo de cultura fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo global e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase do tecido adiposo.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) não só fornece um andaime mecânico para os tecidos, mas também se envolve em crosstalk complexo com células que residem dentro dela, regulando diversos processos necessários para a homeostase de tecidos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, sinalização e metabolismo1. Enquanto ECM saudável desempenha um papel essencial na manutenção da função normal do tecido, ECM disfuncional tem sido implicado em múltiplas doenças2.
O tecido adiposo desempenha um papel importante na patogênese da doença metabólica. A obesidade está associada à hipertrofia adipócito excessiva e hipóxia celular, defeitos no metabolismo celular adipócito e reticulum endoplasmico do tecido adiposco e estresse oxidativo e inflamação. Embora mal compreendidos, esses processos complexos conspiram para prejudicar a capacidade de amortecimento de nutrientes do tecido adiposo, levando ao transbordamento de nutrientes do tecido adiposo, toxicidade em vários tecidos e doença metabólica sistêmica3,4 5. A seqüência de eventos e mecanismos específicos subjacentes à falha do tecido adiposo são mal compreendidas, mas alterações no tecido adipolado foram implicadas. A composição de ECM é alterada dentro do tecido adiposo na obesidade humana e murina, com maior deposição de proteína ECM, juntamente com diferenças bioquímicas qualitativas e estruturais no tecido adipoado associado à doença metabólica humana, incluindo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia6,7,8,9,10,11.
Apesar dessas observações, o papel do tecido adipoto na mediação da disfunção do tecido adiposo não é bem definido. Isto é em parte devido à falta de modelos experimentais tratáveis que permitem a dissecação dos papéis específicos da ECM e adipócitos na regulação da função final do tecido adiposo. A cultura ECM-adipócito simula melhor o ambiente in vivo do tecido adiposo nativo em pelo menos dois aspectos. Em primeiro lugar, a cultura ECM fornece um ambiente molecular semelhante ao tecido adiposo nativo, incluindo collagens nativas, elastinas e outras proteínas matrias ausentes na cultura 2D padrão. Em segundo lugar, a cultura em plástico 2D tem sido mostrado para alterar o metabolismo adipócito através de efeitos mecânicos devido à diminuição da elasticidade do substrato plástico12, que ECM-cultura elimina.
Métodos para engendrar andaimes biológicos por isolamento de ECM de adiposo descelularizado e outros tecidos têm sido estudados no contexto da medicina regenerativa e reconstrutiva e engenharia de tecidos13,14, 15,16,17,18. Publicamos anteriormente uma metodologia na qual adaptamos esses métodos para desenvolver um modelo 3D in vitro da cultura humana de ECM-adipócito, usando células-tronco ecm e adipócitos (preadipócitos) derivadas de tecidos adiposos viscerais humanos11. No presente artigo, descrevemos esses métodos em detalhes. O procedimento de descelularização para o tecido adiposo humano é um processo de quatro dias que envolve tratamentos mecânicos e enzimáticos para remover células e lipídios, deixando um andaime biológico que mantém características do tecido a partir do qual é derivado. O ECM descelularizado suporta a diferenciação adipogênica de preadipócitos humanos, e quando reconstituído com adipócitos, mantém microarquitetura e características bioquímicas e específicas da doença do tecido adiposo intacto e se envolve em funções características do tecido adiposo nativo. Esta matriz pode ser estudada isoladamente ou resemada com células, permitindo o estudo das interações e a transação cruzada entre os componentes celulares e extracelulares do tecido adiposo.
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Protocol
Os tecidos adiposos são adquiridos de seres humanos submetidos a cirurgia bariátrica eletiva aprovação do conselho de revisão institucional.
1. Isolamento preadipocito e preparação de reagente cultural
- Prepare 2% de albumina séxo bovina (BSA) em solução soro sino-amortecida de fosfato 1x (PBS). Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
- Prepare a colagem tipo II: 2 mg/mL em 2% BSA em 1x PBS. Prepare-se imediatamente antes de usar.
- Prepare o Glóbulo Vermelho (RBC) Solução de resquação: 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3,10 mM disodium EDTA em água desionizada (DI/H2O). Guarde a 4°C. Prepare a solução de lysing 1x RBC a partir da solução de ações 10x em DI/H2O imediatamente antes do uso.
- Prepare a Growth Media: 15% de soro bovino fetal (FBS), 1% de solução antimicotica antibiótico (ABAM) no Modificado Meio águia de Dulbecco: Mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
- Prepare a solução de congelamento de preadipocito: 10% de Dimetil Sulfoxide, 15% FBS na mídia DMEM/F12. Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
- Prepare a Mídia de Diferenciação: 10 mg/L transferrina, 33 μM biotina, 0,5 μM solução de insulina humana, 17 μM D-pantotênico ácido hemicálcio sal, 100 nM dexametasona, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tionina sal de sódio (T3), 1 μM ciglitizona, 54μM 3- Isobutyl-1-metilxantina (IBMX), 1% ABAM no DMEM/F12. Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
2. Preparação do reagente de ECM
- Prepare a solução de tampão de congelamento: base de 10 mM Tris, 5 mM EDTA, 1% Bam, 1% flúor fenilmetilsulfonil (PMSF) na solução DI/H2O. Stir para dissolver a EDTA. Ajuste o pH para 8,0 com HCl ou NaOH.Store em 4 °C por até 3 meses.
- Prepare a #1 enzimática da solução: 1% ABAM em 0,25% de tripsina-EDTA. Guarde a 4°C por até 3 meses.
- Prepare a solução tampão de enxaguamento: 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4,1.5 mM KH2PO4,1% ABAM, 1% PMSF em DI/H2O. Esterilizado Mexa para dissolver sais. Ajuste o pH para 8,0 com HCl ou NaOH. Guarde a 4°C por até 3 meses.
- Prepare #2 enzimática solução: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO4º7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF em DI/H2O. Store 4 °C por até 3 meses. Mexa para dissolver os sais. Imediatamente antes do uso, adicione 80 u/mL lipase do pâncreas suíno, tipo VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I do pâncreas bovino, tipo II-S; e 100 μg/mL ribonuclease A do pâncreas bovino, tipo III-A.
- Prepare a solução de extração de solvente polar: 1% ABAM, 1% PMSF em isopropanol.
CUIDADO: Isopropanol é inflamável; armazenar em um armário inflamável em 25 °C e dispor em resíduos inflamáveis. - Prepare 70% de etanol, 1% ABAM, 1% pmsf em DI/H2O. Adicionar Bam e PMSF pouco antes do uso.
CUIDADO: O etanol é inflamável; armazenar em um armário inflamável em 25 °C e dispor em resíduos inflamáveis. - Prepare a solução de armazenamento: 1% ABAM, 1% PMSF em 1x PBS. Guarde a 4°C por até 3 meses.
3. Preparação metabólica do reagente da faisão
- Captação de glicose
- Prepare sero Starvation Media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrar esterilizar e armazenar a 4 °C
- Prepare 200 nM solução de insulina humana em 1x PBS imediatamente antes do uso.
- Prepare 200 nM insulina humana, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glicose, 1 μCi/bem Deoxy-D-glicose, 2-[1,[1,[1,2-3H (N)]-, em 1x PBS. Prepare-se imediatamente antes de usar.
- Lipólise
- Prepare isoproterenol diluído em PBS: 3 mM solução de ações. Diluir a concentração de trabalho de 3 μM para ensaio.
- Óleo Red-O Mancha
- Prepare 4% formalina na loja DI/H2O. à temperatura ambiente.
- Prepare óleo red-o solução de trabalho. Solução óleo diluído red-o (ORO) com DI/H2O em uma proporção de 3:2 (ORO:DI/H2O). Prepare-se imediatamente antes de usar. Filtrar através de papel de filtro(Mesa de Materiais).
4. Aquisição de tecidos adiposos
NOTA: O tecido adiposo visceral (IVA) é coletado do maior omento no início da operação pelo cirurgião e transportado de volta para o laboratório no gelo para processamento imediato. As precauções universais devem ser usadas ao segurar todos os tecidos humanos e reagents cáusticos, incluindo executar todo o trabalho em uma capa de fluxo laminar, usando o desgaste completo da segurança do laboratório, e nenhum recapping das agulhas.
- Adicione 5-10 g de IVA intacto a 15-25 mL de solução de tampão de congelamento em um tubo cônico de 50 mL para mergulhar a amostra de tecido. Armazenar amostras em -80 °C até a descelularização, por até 1 mês.
- Use uma amostra fresca separada do VAT para a isolação do preadipocyte como descrito na seção 5.
5. Isolamento preadipocito
- Coloque 2 g de IVA intacto em 20 mL da solução de colagem, tipo II, em um tubo cônico de 50 mL. Em seguida, pique bem, inserindo tesouras estéreis no tubo cônico e picar o tecido dentro do tubo. Uma vez totalmente picada a uma pasta fina, incubar o tecido na solução de colagem em uma coqueteleira orbital em 130 rpm e 37 °C para 60 min.
- Filtre o digestate resultante através de uma malha de nylon de 100 μm em um tubo cônico fresco de 50 mL derramando o digestate de um tubo cônico através de um pedaço de malha dobrado por cima de um tubo cônico fresco. O digestate neste momento deve ser um líquido amarelo-alaranjado com viscosidade moderada, com pequenas quantidades de costas residuais do tecido fibroso não digerido. A malha deve capturar pedaços maiores de tecido não digerido, que são descartados.
- Centrífuga a amostra em 270 x g por 10 min. Retire o supernatant e resuspender a pelota de célula em 2 mL de 1x RBC Lysing Solution com uma pipeta.
- Incubar por 1 min a 25 °C e, em seguida, adicione 10 mL de 15% FBS-DMEM/F12. Centrífuga a 270 x g por 10 min.
- Retire o supernatant e resuspender a pelota celular em 10 mL de 15% FBS-DMEM/F12 com uma pipeta. Transfira a suspensão celular para 100 mm de placa de Petri com uma pipeta e incubar a 37 °C e 5% CO2, até que as células atinjam 80-100% de confluência, normalmente 2-6 dias. Mude a mídia a cada 2 a 3 dias.
- Separar e lavar as células.
- Remover a mídia com uma pipeta e aplicar 4 mL de 0,25% trypsin-EDTA para células aderentes. Incubar a 37 °C por 10 min, periodicamente rodando a placa suavemente para separar as células.
- Adicione 20 mL de 15% FBS-DMEM/F12 e resuspenda as células destacadas nesta mídia com uma pipeta. Em seguida, transfira para um tubo cônico fresco de 50 mL e centrífuga 270 x g por 10 min.
- Retire o supernatant e descarte. Lave a pelota de célulauma vez em 1x PBS, e depois resuspender a pelota celular em 20 mL de 15% fresco FBS-DMEM/F12 com uma pipeta. Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura T-150.
- Células culturais a 37 °C e 5% DE CO2. Dividir e expandir as células a cada 2-3 dias como eles atingem 80-100% de confluência, aplicando 7 mL de 0,25% trypsin-EDTA, expandindo-se de um frasco para 8 frascos.
NOTA: Isso normalmente requer 3-4 passagens, o que permite a expansão adequada e mantém o potencial adipogênico e fenótipos metabólicos celulares específicos do paciente e do depósito. Preadipocitos passantes superiores a 4-5 passagens leva à perda de potencial adipogênico. - Desaque as células em 8 frascos com 7 mL de 0,25% de trippsina-EDTA por frasco, conforme descrito acima, e incubam a 37 °C por 10 min.
- Adicione 8 mL de 15% FBS-DMEM/F12 por frasco e resuspenda as células destacadas com uma pipeta. Transfira toda a suspensão celular dividida uniformemente em três tubos cônicos de 50 mL e centrífuga a 270 x g por 10 minutos.
- Resuspenda as pelotas de células resultantes em 5 mL de 15% FBS-DMEM/F12 em um tubo cônico de 15 mL e células de contagem usando contador de células e trypan azul.
- Centrífuga a suspensão celular em 270 x g por 10 min. Em seguida, resuspender a pelota celular em Preadipocito Freezing Solution para uma concentração de células finais de 1 x 106/mL, e alíquota 1 mL de suspensão celular por tubo criovial 1.5 mL.
- Armazenar células em crioviais por 1 dias a -80 °C. Em seguida, transfira crioviais para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo por 3-6 meses.
- Quando estiver pronto para uso, descongele um criovial em um banho de água de 37 °C por 3-5 min. Resuspende as células em 20 mL de 15% FBS-DMEM/F12, e centrífuga a 270 x g por 10 min.
- Resuspender a pelota celular em 20 mL de 15% FBS-DMEM/F12, pipeta em um único frasco T-150, e depois crescer para 80% de confluência ao longo de 2-3 dias em 37 ° C e 5% CO2.
- Desaque as células com 7 mL de 0,25% de trippsina-EDTA por frasco, conforme descrito acima na etapa 5.6. Resuspenda em 3 milhões de células por mL (ou seja, 6 x 104 células por 20 μL) em 15% FBS-DMEM/F12, e use conforme descrito abaixo (seção 7, passo 7,4).
6. Preparação do eCM do tecido adipoto
- Dia 1: Congelamento-degelo e digestão enzimática #1
- Amostras de IVA congeladas anteriormente congeladas (passo 4,2) armazenadas na Solução de Tampão de Congelamento em tubos cônicos de 50 mL de -80 °C a 37 °C em um banho de água pré-aquecido, incubando 20 min com agitação manual periódica suave. Uma vez descongelado, transfira de volta para -80 °C e incubar 20 min. Repita o congelamento-descongele 3x, terminando descongelando amostras em um banho de água de 37 °C.
- Usando fórceps estéreis, transfira as amostras de IVA para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de #1 enzimáticas da Solução, garantindo que as amostras de IVA estejam totalmente imersas. Em seguida, incubar durante a noite em um shaker orbital (130 rpm, 37 °C).
- Dia 2: Digestão enzimática #2
- Lave amostras 3x com 15-25 mL de enxaguamento buffer solução em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem). Despeje a solução de enxaguamento tampão após cada lavagem.
- Transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de solução enzimática #2 e incubar em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, durante a noite).
- Dia 3: Delipiação
- Lave amostras 3x com 15-25 mL de enxaguamento buffer solução em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem). Despeje a solução de enxaguamento tampão após cada lavagem.
- Transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de Solução de Extração de Solvente Polar e incubar em uma coqueteleira orbital (130 rpm, 25 °C, durante a noite). Após esta etapa, a maioria do lipídio deve ser removida, e as amostras devem ser brancas ou translúcidas na cor.
CUIDADO: A solução de extração de solvente polar é inflamável e deve ser armazenada e usada a 25 °C.
- Dia 4: Lavagem e armazenamento
- Transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de Solução tampão de lavagem. Lave amostras 3x em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
- Lave amostras 3x com 15-25 mL de 70% de etanol em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem) derramando a solução de etanol de 70% após cada lavagem.
- Lave amostras uma vez com solução de armazenamento em uma coqueteleira orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
- Usando fórceps estéreis, transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de Solução de Armazenamento. Certifique-se de que a solução de armazenamento suficiente é usada para mergulhar totalmente as amostras. Guarde a 4 °C por até 1 mês.
7. Preparação ECM-adipócito
- Transfira fragmentos armazenados de ECM para poços individuais de placa de 24 poços usando fórceps estéreis. Adicione tantos fragmentos de ECM em tantos poços quanto necessário para o ensaio a jusante planejado (por exemplo, captação de glicose ou lipólise, veja abaixo), incluindo duplicatas ou triplicados. Lave com 500 μL de 70% etanol 3x em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
- Reidratar ECM lavando 3x em estéril 1x PBS em um shaker orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
- Usando tesoura sérstéril, corte e pese ECM em fragmentos de 100 mg. Usando fórceps estéreis, coloque um fragmento de 100 mg em cada poço de uma placa de 24 poços. Incubar a 25 °C por 15 min para permitir que o excesso de PBS para extrude de fragmentos. Retire cuidadosamente qualquer excesso de PBS com uma pipeta.
- Semente cada fragmento de ECM de 100 mg com 20 μL de suspensão celular pré-adipócito (3 milhões de células por mL, 6 x 104 células por 20 μL, em 15% FBS-DMEM/F12, a partir do passo 5.10). Pipetas as células diretamente para o ECM, colocando a ponta da pipeta no ECM e gentilmente expelindo a suspensão celular no centro da matriz, tomando cuidado para que a suspensão celular não transborde e acabar na parte inferior do poço.
- Se a suspensão celular estiver transbordando do ECM, onde a ponta da pipeta foi colocada, retire a ponta desse local e insira em outro lugar no ECM. Incubate ecm semeado por 40 min a 37 °C.
NOTA: Para a extração de RNA para qrtPCR, sementes de cada 500 mg fragmentos de ECM com 3 x 105 células em 100 μL (3 milhões de células por mL, ou seja, 3 x 105 células por 100 μL, em 15% FBS-DMEM/F12).
- Se a suspensão celular estiver transbordando do ECM, onde a ponta da pipeta foi colocada, retire a ponta desse local e insira em outro lugar no ECM. Incubate ecm semeado por 40 min a 37 °C.
- Preencha cada poço da placa de 24 poços com 500 μL de mídia de crescimento para cobrir os fragmentos de ECM semeados. Cultura a 37 °C e 5% CO2 para 72 h.
- Após 72 h, cuidadosamente aspirar 15% FBS-DMEM/F12, inclinando a placa ligeiramente para permitir que a mídia para piscina abaixo fragmento, e colocando a ponta pipette apenas ao lado do fragmento ECM sem perturbá-lo. Após o aspiramento, adicione 500 μL de Meios de Diferenciação, mudando a mídia a cada 2-3 dias usando uma técnica semelhante, por um período cultural total de 14 dias.
- Verifique se há diferenciação usando microscopia de luz: as células acumularão lipídios, ficarão de cor marrom-amarela e mais esféricas em forma.
NOTA: Matrizes sem eoutras podem ser usadas para testes metabólicos (por exemplo, ensaio de captação de glicose, ensaio de lipólise, ORO), histologia ou imunohistoquímica (IHC) ou imagens de tecido padrão. Para coloração e imagem oro de tecido fixo, congele amostras de ECM-adipócito em nitrogênio líquido.
- Verifique se há diferenciação usando microscopia de luz: as células acumularão lipídios, ficarão de cor marrom-amarela e mais esféricas em forma.
8. Faisão metabólica
- Microscopia eletrônica de varredura
- Corrigir amostras em 2,5% de glutaraldeído no tampão de fosfato de Sorensen em 25 °C por 12 h. Postfix em 1% de tetróxido de osmium no tampão de fosfato de Sorensen em 4 °C por 1 h.
- Amostras de desidratação em série em etanol. Lave em hexatildisalizane, e secar o ar. Em seguida, monte em um coto de microscopia eletrônica de varredura com grafite coloidal. Seco, e sputter-coat com ouro.
- Capturar imagens com um microscópio eletrônico de varredura.
- Óleo Red-O Mancha
- Tecido vivo: Solução de óleo vermelho-o
- Cuidadosamente aspirar mídia de poços com uma pipeta. Em seguida, lave amostras uma vez com 500 μL de 1x PBS por poço.
- Corrigir amostras com 200 μL de 4% formalina em H2O deionizado estéril a 25 °C por 15 min. Formalin aspirata com uma pipeta, lave amostras duas vezes com 1x PBS (500 μL cada lavagem).
- Adicione 200 μL de 60% amostras de isopropanol a 25 °C por 5 min. Aspirate 60% isopropanol com uma pipeta.
- Mancha amostras com óleo Red-O solução de trabalho em 25 °C para 5 min. Óleo Aspirate Red-O com uma pipeta e, em seguida, lavar amostras 3x com 1x PBS (500 μL cada lavagem). Em seguida, imagem com um microscópio óptico.
- Tecido fixo: Óleo Vermelho-O Kit mancha
- Amostras de ECM-adipócito de congelamento flash em um composto e seção de temperatura de corte ideal (OCT) em um criostat.
- Coloque o slide em 85% de propilenoglicol em DI/H2O para 2 min. Coloque o slide na mancha ORO a 60 °C por 6 min. Coloque o lide steh em 85% de propilenoglicol em DI/H2O por 1 min. Enxaguar o slide duas vezes com DI/H2O.
- Coloque o slide na Hematoxilina de Mayer Modificado do kit de coloração Oil Red-O por 1 min. Enxague o escorregador duas vezes com água da torneira. Enxágue slide duas vezes com DI/H2O.
- Monte o coverslip usando o meio de montagem aquoso e a imagem em um microscópio.
- Extração de RNA de ECM para qrtPCR
NOTA: Para maximizar o rendimento de RNA, use fragmentos de ECM de 500 mg semeados com 3 x 105 preadipócitos em 100 μL e diferencie como acima em placas de 6 poços em 3 mL de mídia de diferenciação por poço.- Uma vez diferenciada, transfira cada amostra individual de ECM-adipócito para um tubo cônico de 50 mL no gelo usando fórceps estéreis.
- Lave bem vazio com 500 μL de Buffer RLT. Adicione O Buffer RLT a 50 mL tubo cônico com a amostra de ecm-adipócito correspondente.
- Usando tesoura sértica, pique finamente cada amostra de ecm-adipócito dentro do tubo cônico de 50 mL, enquanto segura o tubo no gelo, inserindo a tesoura no tubo cônico para picar o tecido.
- Congele e descongele completamente os tubos cônicos de -80 °C a 37 °C 3x.
- Tubos cônicos centrífugas a 500 x g e 4 °C por 10 min.
- Retire cuidadosamente o supernatant com uma pipeta e uso para extração de RNA com um kit de extração de RNA de Tecido Fibroso(Mesa de Materiais).
- Tecido vivo: Solução de óleo vermelho-o
- Ensaio de captação de glicose
- Diferencie 6 x 104 preadipócitos em fragmentos de 100 mg de ECM em 0,5 mL de meio de diferenciação em placas de 24 poços, conforme descrito acima (seção 5).
- Após 14 dias de diferenciação, retire o meio e lave ECM-adipócitos uma vez com 1x PBS. Adicione 0,5 mL/bem Serum Starvation Médio e cultura em 37 °C e 5% CO2 para 12 h.
- Retire as células médias e lave duas vezes com 1x PBS. Adicione 0,5 mL/bem 2% BSA em PBS e cultura em 37 °C e 5% CO2 para 2 h.
- Lave as células uma vez com 1x PBS, adicione 0,5 mL/bem 1x PBS com ou sem insulina 200 nM, e incubar a 37 °C para 40 min.
- Aspirate 1x PBS, adicionar 0,5 mL/bem 1X PBS com 0,1 mM 2-deoxy-D-glicose, 2 μCi/mL deoxy-D-glucose, 2- [1,2-3H (N)], com ou sem 200 nM insulina, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precauções padrão para manipulação e eliminação de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precauções padrão para manuseio e descarte de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precauções padrão para manuseio e descarte de toda a manipulação e eliminação de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precaução padrão para manuseio e descarte de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precaução padrão para manuseio e descarte de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO2 para 40 min. reagentes radioativos e resíduos, como exigido pelos estatutos reguladores institucionais locais.
- Retire o meio com uma pipeta e lave as células 3x com 1x PBS. Adicione 420 μL de solução SDS de 1% em DI/H2O e células de lyse com tubulação vigorosa. Incubar 25 °C por 10 min.
- Colete 5 μL de cada poço para o ensaio proteico de Bradford. Transfira 400 μL de lysate celular restante em 2 mL de fluido de cintilação em um frasco de cintilação. Contagem 3H-2DG atividade em contador de cintilação. Analise os dados como contagens por minuto normalizadas em proteínas, mg/mL.
- Ensaio de lipólise
- Diferencie 6 x 104 preadipócitos em fragmentos de 100 mg de ECM em 0,5 mL de meio de diferenciação humana em placas de 24 poços, conforme descrito acima (seção 5).
- Após 14 dias de diferenciação, retire as células médias e lave duas vezes com 1x PBS quente. Adicione 0,5 mL de meio de fome séoro (sem insulina) com ou sem 3 μM isoproterenol, e adipócitos culturais em 37 °C e 5% CO2 para 72 h.
- Colete supernatantes culturais, que podem ser armazenados a -80 °C até que estejam prontos para ensaio. Coletar o ECM em tubos de microcentrífuga para a quantidade de DNA para normalização de dados.
- Pipet 2 μL de cada supernatant em um microplate de 96 poços. Reserve poços para espaços em branco (H2O destilados) e solução padrão de glicerol fornecida no Kit de Determinação de Triglicerídeos.
- Adicione 270 μL de reagente de glicerol livre do Kit de Determinação de Triglicerídeos a cada poço, pipeta para misturar. Placa incubada em 37 °C para 5 min.
- Medir a absorção a 540 nm em um espectrômetro de microplaca.
- Calcule a concentração de glicerol e normalize com DNA do ECM:
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Representative Results
A preparação do tecido adipolado ECM, a semeade com preadipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros resultam em claras mudanças morfológicas sequenciais no tecido que permitem a avaliação visual do progresso em todo o protocolo (Figura 1) . Preadipocitos usados para semeacar o ECM são isolados usando digestão colagem de amostras separadas de IVA (Figura 2). A microscopia eletrônica de varredura de construções de ECM-adipócito em cada estágio do processamento revela a descelularização do ECM e posterior recapitulação de adipócitos contendo lipídios após resemedamento e diferenciação (Figura 3). A imunohistoquímica específica do colágeno 1 de ECM decellularized revela a manutenção da microarquitetura de colágeno, enquanto a coloração oil red-o de construções de ECM-adipócito3-adipócitos vivos e fixos/seccionados revela adipócitos contendo lipídios (Figura 4 A). qrtPCR de adipócitos diferenciados em ECM demonstra a regulação acentuada de genes adipogênicos em relação aos preadipócitos indiferenciados cultivados em ECM (Figura 4B). A denotyping metabólica de construções do ECM-adipócito que estuda todas as combinações de ECM e de adipócitos dos assuntos do diabético (DM) e do non-diabetic (NDM) revela a captação danificada da glicose e a função lipolytic em construções do ECM-adipocyte do DM relativo a NDM tecidos, recapitulando defeitos metabólicos específicos da DM que relatamos anteriormente em adipócitos humanos na cultura 2D padrão11. É importante ressaltar que o NDM ECM resgata a captação de glicose estimulada por insulina e a capacidade lipólitica em adipócitos de DM (Figura 4C)11. Juntos, esses dados demonstram regulação específica da doença do metabolismo celular de adipócito pelo ECM. Mais detalhes são relatados em Baker et al.11.
Figura 1: Fluxo de trabalho para a preparação ECM-adipócito. Dia 1: Amostras de tecido adiposo visceral inteiro passam por três ciclos de congelamento-degelo seguidos de incubação noturna com solução de digestão enzimática #1. Dia 2: Após a digestão com solução enzimática #1, as amostras são digeridas durante a noite com solução de digestão enzimática #2. Neste ponto, as amostras serão parcialmente delipidated. Dia 3: Após a digestão enzimática #2, as amostras passam por incubação durante a noite com a solução de extração de solvente polar, que completará a delipiação. Após o dia 3, as amostras devem ser totalmente delipidated e branco / translúcido na cor. As amostras são lavadas completamente com solução tampão de lavagem, em seguida, 70% etanol e armazenados em solução de armazenamento em 40 °C até que esteja pronto para resemeamento com preadipócitos. Dia 4: Os preadipócitos são semeados em IVA descelularizado seguido de diferenciação adipogênica por 14 dias. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Fluxo de trabalho para o isolamento de preadipocitos. O IVA é picado, digerido com colagem, filtrado, centrífuga e a pelota de célula sovascular resultante banhada e cultivada para expandir os preadipócitos. Veja Baker et al. 201721 para mais detalhes sobre o isolamento humano de preadipocitos e a cultura adipócito 2D. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Digitalização de imagens de microscopia eletrônica. Tecido adiposo intacto, tecido adiposo descelularizado e tecido adiposo descelularizado repovoado com pré-adipócitos e diferenciados em mídia adipogênica por 14 dias. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Caracterização de adipócitos na ECM. (A) O tecido adipdestecido descelularizado mantém a microarquitetura e suporta a diferenciação de adipócito: Top: Imunohistoquímica de colágeno 1 de iva humano inteiro antes e depois da descelularização demonstrando manutenção de microarquitetura; meio: fotomicrografias confocais 3D de adipócitos humanos vivos dentro do ECM; intacto descelularizado IVA humano manchado com óleo vermelho-o antes de reseeding com preadipocitos, 4 dias após a semeadura, e 14 dias após a semeadura com preadipocitos seguido de diferenciação adipogênica; azul: Mancha da DAPI de núcleos celulares; vermelho: Óleo de coloração Vermelho-O de lipídio intracelular; fundo: Formalin-fixo, parafina-incorporado, 5 μm seccionado, Óleo Vermelho-O-manchado de IVA humano antes da descelularização, imediatamente após a descelularização, e após a descelularização, pré-adipócito-semeadura, e 14 dias de diferenciação adipogênica, demonstrando o acúmulo citoplasmacomico de lipídios em adipócitos dentro do ECM. (B) Adipocitos em ECM regulam a expressão gênica adipogênica: análise qrtPCR comparando os níveis de transcrição de genes adipogênicos no RNA de adipócitos do IVA humano diferenciados no IVA ECM por 14 dias em relação aos preadipócitos indiferenciados no IVA ECM culto por 72 h na mídia nonadipogênica. Os dados são significam ± SEM. ACLY: ATP citrato lyase, ATGL: lipase triglicerídeo adiposo adiposo, FASN: synthase ácidos graxos, PPARg: gamma receptor proliferativo proliferativo peroxisome; ordinate: diferença dobrável no nível de transcrição em adipócitos maduros em relação ao referente preadipocito indiferenciado=1; todas as diferenças dobráveis significativas (p<0.001, t-test emparelhado); ECM de 10 indivíduos, preadipocitos/adipócitos de n=11 sujeitos. C) ECM regula o metabolismo de adipócitode de forma específica ao DM: 3D-ECM de dm ou ndm sujeitos semeados com preadipócitos de DM ou NDM indivíduos, diferenciados em adipócitos, e estudou com phenotyping metabólica. Barras de dados rotuladas com fonte de paciente (NDM, DM) de ECM e adipócitos (ECM/AD); por exemplo, o NDM/NDM denota tanto o ECM quanto os preadipócitos derivados de pacientes com NDM, enquanto o NDM/DM denota ECM de pacientes com NDM combinados com preadipócitos de pacientes com DM. Os dados são significam ± SEM. Ordinates: captação de glicose (cpm), normalizada para concentração de proteína de eCM/célula de lysate (mg/mL); lipólise: concentração de glicerol supernatant cultura (mg/mL) normalizada para concentração de DNA de ECM/célula (ng/mL); *p<0.050, **p<0.100 comparando indicado ponto de dados ao ponto de dados correspondente (basal ou insulina estimulada para captação de glicose, basal ou isoproterenol-estimulada para lipolise) no braço DM/DM, usando análise de modelo misto ajustando para repetido medidas; ECM de n=9 NDM, 8 indivíduos dm, preadipocitos de 10 NDM, 9 dm indivíduos para captação de glicose; ECM de 6 NDM, 6 indivíduos DM, preadipocitos de 6 NDM, 6 dm sujeitos para lipólise. Este número foi adaptado de O'Rourke e Lumeng11. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
O modelo de cultura ECM-adipócito fornece uma ferramenta valiosa para dissecar os papéis individuais de ECM e células na dictação fenótipo de tecido final. O protocolo de isolamento de ECM é bastante reproduzível, mas a variabilidade no processo de descelularização pode ser observada. A etapa de delipiação do Dia 3 é um ponto crítico no protocolo. Na conclusão da extração durante a noite, a delipiação da matriz deve ser evidenciada pela Solução de Solvente Polar que fica amarela, enquanto a matriz deve transitar de uma cor amarelo-laranja característica do tecido adiposo intacto para translúcido/ branco (Figura 1). Se essas alterações de cor não ocorrerem, então a delipiação provavelmente não está completa. A variabilidade interpaciente na eficiência da delipiatividade é comum, mas até o momento não observamos qualquer correlação de eficiência da delipimidação com o estado de DM sujeito, idade, IMC ou outras variáveis clínicas. Amostras grandes (superiores a 20 g) não serão submetidas a delipiação eficiente; o processamento de amostras e 20 g pode evitar esse problema. Se uma amostra não aparecer completamente delipidated após o dia 3, divida a amostra ao meio com tesouras estéreis, a seguir transfira amostras aos 15-20 mL frescos da solução de extração do solvente polar e coloc em um abanador orbital para 3-5 h. Algumas amostras podem não descellularizar totalmente depois de repetir o passo de extração de solvente polar. Se a maioria da amostra for descelularizada, é possível cortar as seções contendo lipídios antes de usar a amostra em experimentos.
A contaminação pode ocorrer se a esterilidade não for mantida diligentemente durante todo o processo. Todo o trabalho deve ser realizado em um capô de fluxo laminar usando precauções de cultura celular padrão. Nós normalmente armazenamos ECM por até 3 meses a 4 °C e preadipócitos por até 6 meses em nitrogênio líquido. A retenção de propriedades específicas de biofuncionalidade e doenças e depósitos além deste período não foi testada.
A microscopia confocal permite a visualização de adipócitos maduros dentro do ECM, que podem ser aprimorados com manchas oil red-o. A microscopia eletrônica de varredura (SEM) também fornece um método não quantitativo para visualizar adipócitos dentro do ECM. De nota, manchas SEM e Óleo Vermelho-O sugerem adipócitos uniculares nas construções ecm-adipócitos, uma morfologia que é semelhante aos adipócitos in vivo e em contraste com os adipócitos multiloculares típicos observados quando os preadipócitos sofrem adipogênicos diferenciação em plástico 2D (Figura 3, Figura 4A). Esta observação sugere que o ECM fornece um ambiente mais fisiofiário para a diferenciação adipogênica do que a cultura padrão do tecido no plástico. Fixação e secção de construções ecm-adipócito pode ser difícil, como oct-embutido construções são frágeis e não seção facilmente. Secionar tecidos embutidos imediatamente após a remoção do armazenamento do freezer -80 °C e realização de seção em uma sala fria (4 °C) em um criostat pré-refrigerado torna a secção viável.
A cultura ECM-adipócito proporciona um ambiente fisiofisioque aproxima-se do ambiente de tecido adiposo in vivo e proporciona um ambiente sustentável para o crescimento e diferenciação de células-tronco pré-adipócitos, como evidenciado pela upregulation de genes adipogênicos na cultura 3D-ECM-adipócito. As culturas ecm-adipocito também se envolvem em funções metabólicas de adipócito, incluindo a captação de glicose e lipólise8. Relatamos a captação de glicose como cpm normalizada para proteína total extraída de culturas ECM-adipócito medida com um ensaio de Bradford, ou ao conteúdo de DNA medido com um kit de ensaio de DNA, e observaram resultados semelhantes com ambos os métodos. Da mesma forma, relatamos lipólise como mg/mL de liberação de glicerol normalizada para proteína ou DNA, também com resultados semelhantes obtidos com um método de normalização. Outros sugerem normalizar dados metabólicos adipócitos para conteúdo lipídico, mas até à data as nossas tentativas de extrair lipídicos de forma confiável das construções de ECM não tiveram sucesso. Relatórios de taxa de captação de glicose como toupeiras de glicose por unidade de tempo e lipólise como toupeiras de glicerol / ácido graxo livre por unidade de tempo pode permitir comparações mais precisas entre experimentos separados. O isolamento do RNA da ECM para análise qrtPCR é caracterizado por rendimentos mais baixos em comparação com as células da cultura 2D, mas a preparação de fragmentos maiores de ECM semeados com mais células supera esse problema, conforme descrito no passo 8.3.1. Encontramos dificuldade em isolar quantidades adequadas de proteína não degradada com fósforos intactos para a análise de borrões ocidentais, o que representa uma limitação do modelo.
Metodologia semelhante para isolar o ECM do tecido adiposo e semeadura com preadipócitos foi publicada anteriormente, com evidências sugerindo que a ECM pode promover diferenciação adipogênica ausente de mediadores adipogênicos clássicos, incluindo agonistas de AMP, insulina, e ppar-γ agonistas12,14. Nossos dados são os primeiros a demonstrar a regulação específica da doença do metabolismo celular por ECM no tecido adiposo, usando métodos em que os adipócitos são estimulados com fatores clássicos de diferenciação adipogênica11; estudos semelhantes na ausência de estímulos adipogênicos são alvo de futuras pesquisas. Outros demonstraram tala cruzada semelhante específica para a doença com células DeCm usando ECM e células isoladas do tecido pulmonar19,20. Estratégias alternativas também têm sido empregadas, incluindo a criação de matrizes misturando preparações homogeneizadas de tecido adipoto ecm em hidrogéis peptídeos12.
Embora a variabilidade interpaciente no metabolismo celular adipócito humano seja observada na cultura 2D-plástico e 3D-ECM, quando analisada em conjunto, essas células manifestam diferenças específicas de doenças, depósitos e sexo no metabolismo celular, conforme descrito nosso grupo e outros11,21,22,23,24,validando a utilidade e generalizabilidade desses modelos de cultura para o estudo do metabolismo celular adipócito. Demonstramos que os adipócitos diferenciados em ECM com correspondência de doenças (ou seja, adipócitos NDM em NDM ECM, dm adipócitos em DM ECM) recapitular fenótipos metabólicos de NDM isolado e dm adipócitos na cultura padrão 2D, apoiando a cultura ECM-adipocyte como cultura um modelo para estudar alterações específicas da doença no metabolismo celular adipócito em um ambiente mais fisiofiônico. Não observamos diferenças na magnitude ou direção das funções metabólicas, incluindo captação de glicose ou lipólise, quando eCM e adipócitos do mesmo ou diferentes doadores são estudados. Em ambos os casos, as construções de ECM-adipocito manifestam fenótipo metabólico específico da DM (por exemplo, diminuição do GU em DM/DM em relação às construções ndm/NDM), sem diferença clara ao comparar construções compostas por ECM e adipócitos dos mesmos ou diferentes doadores .
A cultura ECM-adipocito permite o estudo de combinações de ECM e preadipócitos de populações de pacientes distintos e depósitos de tecidos, permitindo a análise de contribuições específicas de doenças e depósitos de ECM e adipócitos ao tecido adiposo final Fenótipo. Demonstrando essa força do modelo de cultura ECM-adipócito, mostramos que a ECM do tecido NDM tem a capacidade de resgatar defeitos metabólicos em adipócitos dm (Figura 4C)11. Dados preliminares em tecidos adiposos viscerais e subcutâneas sugerem que a murine ECM regula o metabolismo de adipócitos de urina da mesma forma de forma específica de depósito (dados não publicados, O'Rourke RW, 2019), sugerindo que este sistema modelo pode ser usado para estudar Crosstalk ECM-adipocito em ambos os sistemas de urina e humanos. Além disso, este modelo permite o estudo da manipulação isolada do ECM como um meio de regular o fenótipo de tecido adiposo. Estudo preliminar de ECM tratado em condições que induzem glicação direcionada especificamente ao ECM, por exemplo, sugerem que essas modificações regulam o fenótipo metabólico celular de células posteriormente semeadas em ECM tratado (dados não publicados, O'Rourke RW, 2019), fornecendo um modelo para o estudo dos efeitos da manipulação direcionada do ECM no fenótipo de adipócito.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses conflitantes.
Acknowledgments
Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss pela ajuda na coordenação do estudo. O SEM foi realizado pela Universidade de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este projeto foi apoiado pelo NIH concede R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Piloto e Bolsa de Viabilidade do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), Pilot and Viabilidade Grant do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), Pilot and Viabilidade Grant do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), (RWO), Pilot and Viasibility Grant do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Piloto e Bolsa de Viabilidade do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), Piloto e Bolsa de Viabilidade do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), Pilot Administração de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia eletrônica de varredura realizada pela Universidade de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. A figura 4 deste manuscrito foi originalmente publicada em Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1;102 de março (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, e foi reproduzido com permissão da Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Para obter permissão para reutilizar este material, visite http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
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