Summary
Denne protokol beskriver laser opsamling microdissection til isolering af brusk og knogler fra friske frosne sektioner af muse embryonet. Brusk og knogler kan hurtigt visualiseres ved cresylacetat violet farvning og indsamles netop for at give høj kvalitet RNA for transcriptomic analyse.
Abstract
Laser opsamling microdissection (LCM) er et kraftfuldt værktøj til at isolere specifikke celletyper eller regioner af interesse fra heterogene væv. Den cellulære og molekylære kompleksitet af skelet elementer stiger med udvikling. Vævs heterogenitet, såsom ved grænsefladen af brusk og osseøse elementer med hinanden eller med omgivende væv, er en hindring for studiet af at udvikle brusk og knogler. Vores protokol indeholder en hurtig metode til vævs behandling og isolering af brusk og knogler, der giver høj kvalitet RNA for genekspressions analyse. Friske frosne væv af muse embryoner er sektioneret og korte cresylacetat violet farvning bruges til at visualisere brusk og knogler med farver adskiller sig fra omgivende væv. Glider derefter hurtigt dehydreret, og brusk og knogler er isoleret efterfølgende af LCM. Minimering af eksponering for vandige opløsninger under denne proces bevarer RNA-integriteten. Mus Meckels brusk og mandibulær knogle ved E 16.5 blev indsamlet med succes, og analyse af genekspression viste differens ekspression af markørgener for osteoblaster, osteocytter, osteoklaster og chondrocytter. Høj kvalitet RNA blev også isoleret fra en række væv og embryonale aldre. Denne protokol beskriver prøveforberedelse til LCM, herunder kryoindlejring, skæring, farvning og tørring af fersk frosset væv, og præcis isolering af brusk og knogler med LCM, hvilket resulterer i høj kvalitet RNA til transkriptomic analyse.
Introduction
Bevægeapparatet er et multikomponentsystem bestående af muskler, bindevæv, sener, ligament, brusk, og knogle, innerveret af nerver og vaskulariseret af blodkarrene1. Skelet vævet udvikler sig med stigende cellulær heterogenitet og strukturel kompleksitet. Brusk og knogle udvikle sig fra den samme osteochondroprogenitorafstamning og er meget beslægtede. Embryonale brusk og knogler udvikler sig i forbindelse med muskler, nerver, blodkar, og udifferentieret mesenchyme. Brusk kan også være omgivet af knogler, såsom Meckels brusk og kondylar brusk i mandibulær knogle. Disse væv er anatomisk forbundet og interagere med hinanden gennem ekstracellulære signaler under udvikling. I studiet af genekspression i udviklingen af brusk og knogler er en forhindring den heterogenitet af skeletstrukturer, der består af flere vævstyper. Præcis isolering af det specifikke væv af interesse er nøglen til en vellykket transkriptional analyse.
Laser opsamling microdissection (LCM) er et kraftfuldt værktøj til at isolere celletyper eller regioner af interesse inden for heterogene væv, og er reproducerbar og er følsom over for enkelt celleniveau2. Det kan præcist målrette og fange celler af interesse for en bred vifte af downstream-analyser i transkriptomics, Genomics, og proteomics3,4. Kvaliteten af det isolerede RNA, DNA eller protein kan vurderes med en bioanalysator eller en tilsvarende platform. For eksempel er RNA-kvalitet indikeret med RNA-integritets nummeret (RIN)5.
Her giver vi en protokol til hurtig farvning og isolering af brusk og knogler af LCM fra fersk frosset væv. Vi bruger musen embryo til at påvise, at denne protokol giver høj kvalitet RNA til efterfølgende transcriptomic analyse, såsom RNA sekventering (RNA-SEQ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Væv fra mus blev opnået i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr, og studie protokoller blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. tilberedning af frisk frosset prøve
- Dissekere embryo eller væv af interesse. Integrer prøven i en engangs indlejring skimmel med optimal skære temperatur (OCT) sammensatte. Justér objekternes retning med et tip eller en nål.
- Hurtigt fryse prøverne i en tør is/methyl-2-butan bad. Fortsæt til næste trin eller Opbevar ved-80 °C.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
2. cryosectioning til laser opsamling Microdissection
- Afrimning kryostat og rengør indvendige overflader med 70% ethanol. Behandl Anti-Roll pladen og et par pincet med Rnasedekontaminerings middel. Indstil kryostaten til den ønskede skære temperatur (-18 til-22 °C). Forbered en beholder med låg med tøris, og sæt et ark aluminiumsfolie på den tørre is til midlertidig opbevaring af de sektionerede prøve slides under kryosectioning.
Forsigtig: Tøris er ekstremt kold. Håndtér altid tøris med omhu, og bær isolerede handsker, når du håndterer den. - Den ferske frosne prøve overføres til en spand tøris. Anbring et lag OLT-forbindelse på en kryostat-prøveholder, og Placer straks prøven på toppen af OLT med forsigtigt tryk. Når OCT er helt frosset, Fastgør holderen med prøven i kryostat skære armen.
- Prøven skal efterlades i kryostaten i 15 minutter, så den er ækvibreret til skære temperaturen.
- Afsnittet væv og indsamle skiver på polyethylen naphthalat (PEN) membran glider i en tykkelse på 12 μm. Juster fortløbende sektioner på membranen. Når et dias er færdigt, skal du lade sektioner tørre i et par minutter og overføre diaset til folien i den tørre isbeholder, indtil alle de påkrævede slides er indsamlet.
- Opbevar diasene ved-80 °C i en slide boks.
Bemærk: Sektions tykkelse er valgt for at maksimere mængden af væv indsamlet samtidig giver effektiv skæring af vævet, og kan variere afhængigt af væv af interesse. Protokollen kan sættes på pause her. Hold slides fri for RNase-kontaminering. Undgå temperaturændringer. Selvom RINs af RNA fra slides gemt i op til 6 måneder stadig kan indikere høj kvalitet af RNA, anbefaler vi at bruge slides så hurtigt som muligt.
3. prøveforberedelse til laser opsamling Microdissection
- Forbered opløsninger til farvning og dehydrering.
- 45 mL 80% ethanol i hver af de 3 50 mL centrifugerør på is. Mærk dem som #1, #2 og #3. Fortyndet ethanol med RNase/DNase frit vand.
- 45 mL 95% ethanol placeres i et 50 mL centrifugeglas på is.
- 45 mL 100% ethanol placeres i et 50 mL centrifugeglas på is.
- 45 mL xylen placeres i et 50 mL centrifugeglas ved stuetemperatur.
Forsigtig: Xylen skal anvendes i en stinkhætte.
- Tø en PEN membran glide kort ved at placere den mod en dykket hånd, derefter vaskes to gange for 30 s hver i 45 mL 80% ethanol (#1 og #2) med agitation i 50 mL centrifugeglas til at fjerne OLT.
Bemærk: Det er vigtigt at fjerne OCT før farvning, for at forhindre, at OLT løsnes under farvning fra at sløre afsnittene. Pincet kan bruges til at lette fjernelse af OLT, der ikke vaskes af agitation. - Læg slide på et ark aluminiumsfolie. Pipetten 0,8 mL 0,1% cresylacetat violet i 50% ethanol på sliden og pletten i 30 s. vask sliden i 45 mL 80% ethanol (#3) i 30 s, og dehydrat derefter ved passage i 30 s hver gennem 45 mL 95% ethanol, 100% ethanol og xylen i 50 mL centrifugeglas.
- Stå slides på en delikat opgave visker i 5 min at dræne xylen og tørre sektioner.
Bemærk: Slides skal tørres helt før LCM.
4. Mikrodissektion til laser optagelse
Bemærk: Brug pudderfri nitrilhandsker, mens du udfører LCM.
- Tænd for LCM-mikroskop, laser og computer. Log på computeren, og start softwaren. Drej nøglen til positionen "on" for at starte laseren. Når det grønne lys (laser) er tændt, skal du trykke på den røde knap for at aktivere laseren, og derefter lyser lampen (laser) rødt, der indikerer, at laseren er klar til brug.
Bemærk: Laseren har brug for ca. 10 min til at varme op. - Indstil opsamlings rørene.
- Sæt hætten på en 0,5 mL polymerase-kædereaktion (PCR) i kollektoren.
Bemærk: Vælg den matchende samler til de ønskede PCR-rør (0,2 eller 0,5 mL). - Der afpipetteres 50 μL ekstraktions buffer (leveres af RNA-isolations sættet, der er anført i tabellen over materialer) i hætten på 0,5 ml-opsamlingsrøret.
- Indsæt samlings enheden i mikroskopet.
- I vinduet Skift samler enhed skal du klikke på knappen Flyt til referencepunkt for at flytte kollektoren til referencepunktet (RP). Juster fokus for klart at se RP. Klik på pilene for at flytte RP til midten af visningen.
- Sæt hætten på en 0,5 mL polymerase-kædereaktion (PCR) i kollektoren.
- Indlæs objektglassene.
- Klik på den venstre losse knap på værktøjslinjen for at sænke slide holderen.
- Placer diaset i holderen, så vævs delen vender nedad.
Bemærk: Denne orientering sikrer, at de tilfangetagne vævs sektioner falder ind i hætten af opsamlingsrøret ved tyngdekraft. - Sæt holderen tilbage i scenen.
- Indstil laser parametrene.
- Vælg kontrol muligheden for laser menuen eller klik på laser ikonet.
- Juster disse parametre som ønsket: magt, laserens kraft; Blænde, bredden af laseren; og hastighed, hastigheden af skæring i Draw og cut mode.
Bemærk: Test laseren i et område af interesse. Højere effekt eller større blænde gør det nemmere at klippe, men forårsager mere skade på cellerne. Juster kombinationen af effekt, blænde og hastighed for at opnå effektiv skæring og minimal beskadigelse af vævet. For eksempel, Power = 40, blænde = 5, og hastighed = 7 for brusk væv på en 12 μm sektion.
- Vælg og skær områder af interesse.
- Start med 5x mål og finde de områder af interesse, og derefter skifte til den målsætning (5x, 10x, eller 40x), der bedst viser det område af interesse.
Bemærk: Efter cresylacetat violet farvning, brusk er farvede magenta og mineraliseret væv vises brun eller sort, adskiller sig fra andre væv. Billeder kan gemmes ved hjælp af Gem billede som i menuen filer . - Vælg røret til indsamling (A, B, C, D) ved at klikke på mærket på kollektoren.
- Vælg Flyt og klip eller tegn og skær. I Move-og cut -tilstand skæres præparatet manuelt ved hjælp af musen eller touchskærmpennen for at tegne figurer frihånds. I Draw-og cut -tilstand kan figurer trækkes frihånds med musen eller berøringsskærmen til efterfølgende skæring. Klik på knappen Start cut for at starte laserskæring.
- Når snittet er afsluttet, falder målvævet med PEN membran ind i hætten af samlingen røret af tyngdekraften. Gentag 4,5 for at samle flere områder af interesse, hvis det er nødvendigt.
Bemærk: Gentagne nedskæringer eller stigende effekt eller blænde kan være nødvendig, hvis vævet ikke falder ind i hætten af opsamlingsrøret på grund af ufuldstændig skæring. Mineraliseret knogle (brun eller sort) kan ikke skæres direkte med laser.
- Start med 5x mål og finde de områder af interesse, og derefter skifte til den målsætning (5x, 10x, eller 40x), der bedst viser det område af interesse.
- Aflæs opsamleren og luk PCR-røret forsigtigt. Placer det mikrodissekeret væv i tøris. Fortsæt til næste trin eller Opbevar ved-80 °C.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Gentag 4,2 til 4,6 for den næste prøve.
5. lysis af Mikrodissekeret væv og RNA-isolation
- Tø det microdissected væv ved stuetemperatur. Centrifugeres kortvarigt, og prøverne inkubates i 30 minutter ved 42 °C.
- Efter inkubation, drej lysis-bufferen ned i 0,5 mL PCR-røret. Udfør DNase-behandling og RNA-ekstraktion ved hjælp af et RNA-isolations sæt (Se tabellen over materialer) efter producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Coronal sektioner af fersk frosset mus væv på e 16.5 blev brugt til at påvise isolation og opsamling af Meckel brusk (MC), kondulær brusk, og mandibulær knogle af LCM. Mus embryoner på E 16.5 blev dissekeret og indlejret i kryogene forme med OCT sammensatte. Prøver i forme blev hurtigt frosset i en tøris og methyl-2-butan bad og opbevares ved-80 °C.
For at påvise cresylacetat violet farvning af brusk og knogler, blev cryosectioning i det koronale plan udført og prøver blev indsamlet på mikroskop slides. Sektioner blev vasket, plettet og dehydreret efter ovenstående protokol (trin 3.2 – 3.4). Slides var lufttørret og monteret med permanent monterings medium. Alle brusk undersøgte var farvede magenta (MC, kondulær brusk, nasal septum brusk, Costal brusk, brusk primordium af presphenoid knogle, brusk primordia af radius og ulna) og alle mineraliserede væv blev farvet brun eller sort (figur 1A – E). Både brusk og knogler blev let skelnes fra andre væv på flere anatomiske steder.
For LCM'S vedkommende blev lederne af embryoer på E 16.5 opdelt i koronal plan på PENNEMEMBRAN skred med en tykkelse på 12 μm, og 6 – 8 på hinanden følgende sektioner blev indsamlet pr. slide og opbevaret ved-80 °C. OLT blev fjernet, og sektioner blev plettet med cresylacetat violet og dehydreret efter den ovenfor beskrevne protokol (trin 3.2-3.4). MC, kondulær brusk, og mandibulære knogle områder blev udvalgt og isoleret af LCM (figur 2). De udvalgte regioner faldt ind i lyse bufferen i hætten på opsamlingsrøret. For at opnå tilstrækkelig RNA til sekvensering, samlede vi 10 områder af MC, 10 regioner af kondulær brusk eller 4 regioner af mandibulær knogle i hver opsamlings slange som en prøve, hhv.
RNA blev ekstraheret ved hjælp af et RNA-isolations sæt efter producentens anvisninger. Total RNA blev analyseret ved hjælp af en bioanalysator (figur 3a – B). For at teste effekten af cresylacetat violet farvning på kvaliteten af RNA, vi sammenlignede RNA fra mandibulære knogle prøver farvet med cresylacetat violet og prøver uden farvning (mineraliseret væv er synlig uden farvning, men cresylacetat violet farvning øger synligheden for at skelne knogle fra omgivende væv). Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i RNA-integriteten mellem farvede prøver (n = 4) og prøver uden farvning (n = 4), hvilket indikerer, at den hurtige cresylacetat violet farvning i denne protokol har ubetydelig effekt på RNA-kvaliteten (P = 0,858, to-sidet welchs t-test, figur 3C). Vi brugte vores protokol til LCM af forskellige væv på forskellige udviklingsmæssige stadier og RINs blev målt, hvilket indikerer høj RNA-kvalitet (figur 3D). De gennemsnitlige udbytter af RNA fra MC, kondulær brusk og mandibulær knogle var 7,50 ± 1,45 ng, 12,55 ± 2,75 ng og 33,02 ± 7,63 ng (figur 3E), og udbyttet/arealet var 19,73 ± 3,82 ng/mm2, 26,70 ± 5,84 ng/mm2og 17,23 ± 3,98 ng/mm2(figur 3F) uden signifikant forskel mellem væv (MC versus kondylar brusk, p = 0,383; kondylar brusk versus mandibulær knogle, p = 0,260; MC versus mandibulær knogle, P = 0,674).
Bibliotekerne blev forberedt og sekventeret som tidligere beskrevet6,7. En repræsentativ cDNA-størrelse var ca. 500 BP (figur 4A). RNA-SEQ-data blev analyseret med MultiQC8. Vi analyserede RNA-SEQ-data fra 18 LCM-prøver (MC1-6, Meckels brusk; C1-6, kondylar brusk; M1-6, mandibulær knogle). De gennemsnitlige kvalitetsværdier på tværs af hver base position i læsninger blev genereret af FastQC, hvilket indikerer meget god kvalitet opkald (figur 4B). Læse justering blev analyseret med Picard (figur 4C). Aflæsninger viste høje justerede procenter og den gennemsnitlige procentdel af justerede læsninger var 75%. Gendækningen blev analyseret med Picard (figur 4D), som indikerede en god repræsentation langs afskriften fra 5 ' til 3 ' enden.
Differentialgenekspression analyse blev udført6,7. Der var 4.006 gener signifikant differentieret (P < 0,05) mellem mandibulær knogle og MC (figur 5A). Gener, der er specifikke for osteoblaster eller osteocytter (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, dstn13, Runx214, Sp715og SPARC16), var mere højt udtrykt i mandibulær knogle sammenlignet med MC, mens chondrocyte-specifikke gener (acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, comp22, Lect123og Sox524) var mere højt udtrykt i MC sammenlignet med mandibulær knoglen (figur 5B og tabel 1). Desuden blev osteoklast markører såsom Acp525, Csf1r26, ctsk27, Itgb328og Oscar29 også identificeret som mere højt udtrykt i mandibulær knogle sammenlignet med MC (figur 5B og tabel 1), hvilket indikerer vellykket isolering af målrettede væv.
Figur 1: repræsentativ cresylacetat violet farvning af brusk og knogler i koronale dele af muse embryonet på e 16.5. A) meckels brusk og hemimandible. B) meckels brusk, kondylar brusk og hemimandible. C) næse-septum og maxillae. D) brusk primordium af præsphenoid knogle og Palatin knogle. E) brusk primordium af radius, brusk primordium af ulna og Costal brusken. C = kondylar brusk; CC = Costal brusken; CP = brusk primordium af presphenoid knogle; M = hemimandible; MC = Meckels brusk; MX = maxilla; NS = nasal septum; PL = Palatin knogle; R = brusk primordium af radius; U = brusk primordium af ulna. Scale bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative regioner isoleret med LCM og indsamlet til RNA-SEQ. (A – C) Repræsentativ bejdset MC (A), kondulær brusk (B), og hemimandible med MC allerede isoleret (C) i cryosection før LCM. (D – F) Regionerne i A, B og C efter målrettede væv blev isoleret af LCM. Scale bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: RNA-kvalitet og-mængde af LCM-prøver. (A – B) Repræsentativt elektro pherogram (A) og det tilhørende gel-billede (B) fra en bioanalysator til en mandibulær knogle prøve. C) rins af totalt RNA fra mandibulære knogle prøver, som er farvet med cresylacetat violet (n = 4) eller uden farvning (n = 4). D) rins af totalt RNA fra forskellige væv, som er isoleret med LCM. Meckels brusk ved E 16.5 (n = 6); Kondylar brusk ved E 16.5 (n = 6); Mandibulær knogle ved E 16.5 (n = 6); Nasal septum brusk ved E 14.5 (n = 6); Hjernen ved E 14.5 (n = 6); Hjernen ved E 16.5 (n = 7); Hjernen ved E 18.5 (n = 4). E) udbyttet af det totale RNA fra tre væv. Hver MC eller kondulær bruskprøve var en pulje af 10 microdissekted områder af brusk og hver prøve af mandibulær knogle var en pulje af 4 microdissekted regioner af hemimandible. F) udbyttet pr. arealenhed (ng/mm2) i hvert væv. Data er betyde ± s.e.m. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvaliteten af biblioteker og RNA-SEQ-data genereret fra LCM-prøver. A) repræsentative cDNA-størrelser for et bibliotek fra en mandibulær knogle prøve bestemt af en bioanalysator. (B – D) Kvalitetskontrol analyse af RNA-SEQ fra 18 LCM-prøver (MC1-6, Meckels brusk; C1-6, kondylar brusk; M1-6, mandibulær knogle) af MultiQC. B) de gennemsnitlige kvalitetsværdier på tværs af hver base position i aflæsninger blev genereret af fastqc. Baggrunden af grafen opdeler y-aksen i meget god kvalitet opkald (grøn), opkald af rimelig kvalitet (orange), og opkald af dårlig kvalitet (rød). (C) tilpasningen af læsninger blev analyseret af Picard. Resuméet vises som procentdelen af justerede læsninger. (D) normaliseret gendækning analyseret med Picard. Plottet angiver den relative gennemsnitlige dækning langs afskriften fra 5 ' end (venstre) til 3 ' end (højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: analyse af Differentialekspression af RNA-SEQ-data fra mandibulær knogle og MC isoleret med LCM. A) hierarkisk klyngedannelse på 4.006 gener, der er signifikant differentieret (P < 0,05) mellem mandibulær knogle og MC. Der blev anvendt tre biologiske replikater til hvert væv. M1-3, mandibulær knogle; MC1-3, MC. (B) vulkan plot, der viser fold ændringer og P-værdier af differentielt udtrykte gener mellem mandibulær knogle og MC. eksempler på meget differentielt udtrykte celle specifikke gener vises: osteobel og osteocyt markører i blå, osteoklast markører i grøn, og af markører i rødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen | Celletype | log2FoldChange | Gennemsnitligt udtryk | Justeret P-værdi |
| Col1a1 | Osteoblast/Osteocyte | 2,64 | 12,94 | 2.22 e-05 |
| Col1a2 | Osteoblast/Osteocyte | 3,41 | 12,87 | 8.27 e-07 |
| Dkk1 | Osteoblast/Osteocyte | 7,59 | 2,01 | 5.21 e-03 |
| Dmp1 | Osteoblast/Osteocyte | 9,73 | 3,42 | 3.19 e-04 |
| Dstn | Osteoblast/Osteocyte | 2,51 | 6,87 | 5.73 e-07 |
| Runx2 | Osteoblast/Osteocyte | 1,24 | 8,62 | 4.08 e-02 |
| Sp7 | Osteoblast/Osteocyte | 2,24 | 6,95 | 5.81 e-03 |
| Sparc | Osteoblast/Osteocyte | 3,40 | 12,26 | 5.56 e-09 |
| Acp5 | Osteoklastaktiviteten | 3,38 | 5,74 | 6.46 e-06 |
| Csf1r | Osteoklastaktiviteten | 2,01 | 5,80 | 1.17 e-04 |
| Ctsk | Osteoklastaktiviteten | 3,19 | 7,56 | 5.73 e-07 |
| Itgb3 | Osteoklastaktiviteten | 2,88 | 5,37 | 2.43 e-04 |
| Oscar | Osteoklastaktiviteten | 3,41 | 2,67 | 1.63 e-04 |
| Acan | Af | -5,23 | 5,01 | 2.76 e-04 |
| Col2a1 | Af | -3,61 | 9,47 | 3.29 e-03 |
| Col9a1 | Af | -7,01 | 3,58 | 5.51 e-03 |
| Col9a2 | Af | -5,40 | 3,76 | 2.60 e-03 |
| Col9a3 | Af | -6,63 | 3,80 | 2.90 e-02 |
| Comp | Af | -5,86 | 1,54 | 7.51 e-03 |
| Lect1 | Af | -7,37 | 1,34 | 2,35 e-02 |
| Sox5 | Af | -2,88 | 4,43 | 6.06 e-04 |
Tabel 1: differentieret ekspression af kendte gener i forskellige celletyper af knogler og brusk (mandibulær knogle versus MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCM gør det muligt at isolere beriget eller homogen cellepopulationer fra heterogene væv. Dens fordele omfatter hurtig og præcis opsamling af celler i deres in vivo kontekst, mens potentielle ulemper omfatter det at være tidskrævende, dyrt, og begrænset af behovet for brugeren at genkende særskilte delpopulationer inden for en bestemt prøve30. Denne protokol indeholder oplysninger om LCM af mus embryonale brusk og knogler, fremhæver brugen af cresylacetat violet farvning i en hurtig procedure for at visualisere brusk og knogle for præcis vævs indsamling samtidig opretholde høj RNA integritet for efterfølgende analyse af RNA-SEQ. En begrænsning af denne protokol er, at det LCM-system, der anvendes her, ikke er i stand til direkte at skære på tværs af mineraliserede væv (f. eks. mandibulært væv i sort i figur 2C); som følge heraf skal hele knogle området dissekteres. Navnlig er de mikrodissekerede ossificerede områder, der er isoleret af LCM, ikke homogene og omfatter i det mindste delpopulationer af osteoblaster, osteocytter og osteoklaster (tabel 1). Ikke desto mindre er tilsætning af LCM værdifuld, da vores tidligere undersøgelse har vist, at der stadig kan påvises transkriptionelle ændringer i specifikke delpopulationer såsom osteoklaster i det microdissekeret knoglevæv ved RNA-SEQ6.
Til analyse af genekspression har vi optimeret prøveforberedelsen og LCM-proceduren for høj RNA-kvalitet og-udbytte. Vores protokol starter med frisk frosset væv. Friske frosne vævs sektioner giver mulighed for fremragende mængde og kvalitet af udvundet RNA3, da mRNA er følsom over for standardmetoder til fiksering31. RNA nedbrydes hurtigt af RNase-kontaminering, og vedligeholdelse af et RNase-frit miljø i hele prøveforberedelsen, LCM og RNA-isolation er afgørende for vellykket anvendelse. Udsættelse for vand under sektions behandling er skadelig for RNA-kvalitet31,32. Vores protokol begrænser en sådan eksponering, med det højeste niveau af vandig eksponering er 50% under cresylacetat violet farvning. Vi har testet, at en hurtig farvning (30 s) med 0,1% cresylacetat violet i 50% ethanol giver en skelne farve til brusk og ikke sænke RNA integritet for downstream-analyse såsom lav input RNA-SEQ (figur 3C og figur 4). Udbyttet/arealet (ng/mm2) er ca. 20 ng/mm2 (figur 3F), svarende til eller højere end tidligere optimerede metoder33. Ifølge celle tætheder i MC og mandibulær knogle6, anslår vi, at med denne protokol er det gennemsnitlige udbytte fra en celle ca. 5 pg RNA pr. celle, og 1 – 5 ng af total RNA kan udvindes fra 200 – 1000 celler, som kan bruges til lav-input RNA-SEQ6,7,33. Denne ydelse effektivitet er meget højere end etablerede LCM metoder34, og også overlegen eller ligner de seneste optimerede protokoller33,35.
Evnen til at skelne forskellige celletyper i histologiske sektioner er afgørende for præcis indsamling af specifikke væv af interesse. Cresyl violet er en hydrofile, grundlæggende plet, der binder til negativt ladede nukleinsyrer36. Denne egenskab gør det nyttigt for kontra farvning med celle-type selektivitet37, og det er en standard histologisk plet for neuroner38. Cresyl violet har været anvendt i LCM til en række forskellige væv, hvilket giver god vævs morfologi og høj RNA-kvalitet33,36,39,40. Sammenlignet med andre farvningsmetoder giver cresylacetat violet farvning cytoplasmatiske og nukleare detaljer og en lav RNA-nedbrydningshastighed32. Vi demonstrerer her, at cresylacetat violet farvning er en nem og hurtig metode til at visualisere brusk og knogler, og at væv farvet med denne metode sparer høj RNA-integritet. Xylen behandling er almindeligt anvendt til dehydrering af vævet før LCM35,36,41,42. Vi bruger xylen til at forbedre visualiseringen af vævs morfologi35 , som er afgørende for at skelne målrettet væv, især på pennen membran slides, der ikke er så optisk klar som almindelige glas dias. Vi fandt ingen signifikant forekomst af sektions tabet fra PENNENS slides under farvning og vaske trin, selv med agitation for at fjerne OCT.
Mikrodroplet eller mikrofluidics-baseret enkelt celle-RNA-SEQ (scRNA-SEQ) er en metode med høj gennemløb til at analysere transkriptomer af væv med heterogene celletyper og er begyndt at blive anvendt i skelet biologi43. I modsætning til LCM involverer scRNA-SEQ enzymatisk og/eller mekanisk Disaggregering af væv i enkeltceller. De fleste protokoller for enkelt celle tilberedning kræver, at væv inkuberet ved stuetemperatur eller 37 °c i længere perioder, hvilket ændrer transkriptomet44,45. Desuden kan isolering af enkeltceller i brusk og knogler være fysisk begrænset af skelet element kompleksitet af trabecularization og mineralisering. Det er stadig en teknisk udfordring at isolere et tilstrækkeligt antal levedygtige celler fra skelet væv, der er nøjagtigt repræsentative for den cellulære mangfoldighed af væv in vivo, og ufuldstændig dissociation af cellerne kan forårsage bias i påvisning af celletyper43. Mens scrna-SEQ tillader identifikation af særskilte celletyper, er sekvensering dybden lav, og typiske sekvensering tilgange fange 3 ' afskrift ender og tillader ikke alternative splejsning analyse. Bulk RNA-SEQ af LCM-afledt væv homogenisere celle forskelle, men tillader omfattende transkriptionsdetektion og alternative splejsning analyse. LCM er derfor især nyttig for skelet væv, der ikke let kan adskilles fra omgivende væv og internt kompleks, og frisk frosset fremstilling af vævet kunne bevare både transkriptionelle profiler og RNA integritet for transkriptional analyse. En anden svaghed ved scRNA-SEQ er, at efter en enkelt celle forberedelse, er de rumlige oplysninger af cellerne tabt. En kombination af LCM og scRNA-SEQ er blevet udviklet for at gøre det muligt at studere transkriptomet af en lille prøve fra afgrænsede geografiske lokaliteter (geo-SEQ)46, hvilket er en anden metode til at udnytte LCM til at studere regionaliseret genekspression.
Sammenfattende giver denne protokol detaljer om optimeret LCM af brusk og knogler, fremhæver brugen af cresylacetat violet farvning i en hurtig procedure for at visualisere brusk og knogle for præcis vævs indsamling samtidig opretholde høj RNA integritet for efterfølgende analyse af RNA-SEQ. Denne protokol er blevet anvendt med succes for LCM af brusk og knogler på forskellige udviklingsmæssige stadier for genekspression analyse6,7, og også kan anvendes til andre væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Dental and craniofacial Research (R01DE022988) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og Human Development (P01HD078233). Forfatterne takker Biorepositoriet og patologi kerne for adgang til Leica LMD 6500-platformen på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
