Summary
פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.
Abstract
לכידת לייזר (LCM) היא כלי רב עוצמה לבידוד סוגי תאים ספציפיים או אזורים מעניינים מרקמות הטרוגניות. המורכבות התאית והמולקולרית של יסודות השלד גדלה בפיתוח. טרוגניות רקמות, כגון בממשק של הסחוס ואלמנטים osseous אחד עם השני או עם הרקמות הסובבות, הוא אחד מכשול למחקר של פיתוח סחוס ועצם. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מהירה של עיבוד רקמות ובידוד של סחוס ועצם התשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח ביטוי גנים. הרקמות הקפואות טרי של עוברי העכבר הם מנות ומכתים קצר cresyl סגול משמש להמחיש סחוס ועצם עם צבעים נפרדים מרקמות המקיפים. השקופיות מיובשות אז במהירות, והסחוס והעצמות מבודדים לאחר מכן על ידי LCM. מזעור החשיפה לפתרונות מימית במהלך תהליך זה שומר על שלמות RNA. הסחוס ועצם הלסת של העכבר על E 16.5 היו נאספים בהצלחה וניתוח ביטוי גנטי הראה ביטוי דיפרנציאלי של גנים סמן עבור אוסטאופתי, אוסטאופציטים, אוסטאופםנמשך, ו כונדרוציטים. באיכות גבוהה RNA היה גם מבודד מתוך מגוון של רקמות וגילאים עובריים. פרוטוקול זה הכנה לדוגמה של LCM כולל קריוהטבעה, הפחתה, כתמים והסרת לחות של רקמות קפואות טריות, ובידוד מדויק של סחוס ועצם על ידי LCM וכתוצאה מכך באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח transcript.
Introduction
מערכת השלד והשרירים היא מערכת מרובת רכיבים המורכבת שריר, רקמת חיבור, גיד, רצועה, סחוס, ועצם, innervated על ידי עצבים ובאמצעות כלי דם1. רקמות השלד להתפתח עם הגדלת טרוגניות הסלולר והמורכבות המבנית. סחוס ועצם להתפתח מאותו השושלת האוסטכונדרוקדמון, הם קשורים מאוד. הסחוס ועצם עובריים להתפתח בשיתוף עם השרירים, העצבים, כלי הדם, מובחן mesenchyme. הסחוס עשוי גם להיות מוקף עצם, כגון הסחוס של מקל הסחוס condylar בתוך עצם הלסת. רקמות אלה משויכים מבחינה אנטומית ומתקשרים אחד עם השני באמצעות אותות משוונים במהלך הפיתוח. במחקר של ביטוי גנים בהתפתחות של סחוס ועצם, מכשול אחד הוא הטרוגניות של מבנים השלד מורכב מסוגים מרובים של רקמות. בידוד מדויק של רקמת העניין הספציפית הוא המפתח לניתוח מוצלח של הטרנססקריפט.
לכידת לייזר (LCM) הוא כלי רב עוצמה כדי לבודד את סוגי התאים או אזורים המעניינים בתוך רקמות הטרוגניות, והוא הינו רגיש לרמה תא בודדת2. זה יכול בדיוק למקד וללכוד את התאים של עניין עבור מגוון רחב של במורד הזרם בחני אמר ב transcript, גנומיקה, ו פרוטאומניקס3,4. האיכות של ה-RNA המבודד, ה-DNA או החלבון יכול להיות מוערך עם הפלטפורמה bioanalyzer או שווה ערך. לדוגמה, איכות ה-RNA מצוינת על-ידי מספר התקינות של RNA (RIN)5.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול לצביעת ובידוד מהירה של סחוס ועצם על ידי LCM מרקמות קפואות טריות. אנו משתמשים העובר העכבר כדי להדגים כי פרוטוקול זה תשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח הטרנססקריפט הבאים, כגון רצפי RNA (RNA-seq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות מעכברים הושגו בהתאם למכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, ופרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים בבית הספר Icahn לרפואה בהר סיני.
1. הכנת הדגימה קפואים טריים
- . מנתח את העובר או את רקמת הריבית הטמע את המדגם בתבנית הטבעה חד פעמית עם מתחם החיתוך האופטימלי (OCT). להתאים את כיוון הדגימה עם טיפ או מחט.
- הקפאת במהירות את הדגימות באמבט קרח יבש/מתיל-בוטאן 2. המשך לשלב או לחנות הבאים ב--80 ° c.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
2. הקפאה ללכידת בלייזר
- להפשיר את הקריוסטט ומשטחים פנימיים נקיים עם 70% אתנול. לטפל לוחית נגד רול וזוג מלקחיים עם סוכן הטיהור RNase. הגדר את הקריוסטט לטמפרטורת החיתוך הרצויה (-18 עד 22 ° c). הכינו מיכל כימי עם קרח יבש, הצבת גיליון נייר אלומיניום על הקרח היבש לאחסון זמני של שקופיות המדגם במהלך ההקפאה.
זהירות: . קרח יבש קר מאוד תמיד לטפל בקרח יבש עם טיפול וללבוש כפפות מבודדות בכל פעם שהוא מטפל בו. - העבר את הדגימה הקפואה הטרייה. לתוך דלי של קרח יבש מניחים שכבה של מתחם OCT על בעל הדגימה קריוסטט ומיד מקום הדגימה על גבי OCT עם לחץ עדין. כאשר OCT קפוא לחלוטין, להדק את המחזיק עם הדגימה לתוך הזרוע החותכת קריוסטט.
- השאר את הדגימה בקריוסטט במשך 15 דקות עד לטמפרטורה החיתוך.
- מדור את הרקמה ולאסוף את הפרוסות על מחליק פוליאתילן (עט) ממברנה בעובי של 12 μm. יישר מקטעים עוקבים על הקרום. לאחר השלמת שקופית אחת, אפשר למקטעים להתייבש למשך מספר דקות ולהעביר את השקופית לנייר הכסף במיכל הקרח היבש עד לאיסוף כל השקופיות הנדרשות.
- אחסן את השקופיות ב--80 ° c בתיבת שקופיות.
הערה: עובי המקטע נבחר כדי למקסם את כמות הרקמה שנאסף תוך מתן אפשרות חיתוך יעיל של הרקמה, והוא עשוי להשתנות בהתאם לרקמת הריבית. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. שמרו על שקופיות חופשיות מזיהום RNase. הימנע משינויי טמפרטורה. למרות RINs של RNA משקופיות המאוחסנות עד 6 חודשים עשויים עדיין להצביע על איכות גבוהה של RNA, אנו ממליצים להשתמש בשקופיות בהקדם האפשרי.
3. הכנה לדוגמא ללכידת לכידת לייזר
- הכינו פתרונות לצביעת והתייבשות.
- מקום 45 mL של 80% אתנול בכל אחד מ-3 50 שפופרות צנטריפוגה mL על קרח. תייג אותם כ#1, #2 ו#3. לדלל אתנול עם RNase/DNase מים חופשיים.
- מקום 45 mL של 95% אתנול בשפופרת הצנטריפוגה 50 mL על קרח.
- מקום 45 mL של 100% אתנול בשפופרת הצנטריפוגה 50 mL על קרח.
- מקום 45 mL של קסילן בתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL בטמפרטורת החדר.
זהירות: . קסילין צריכה לשמש בתוך מכסה המנוע
- הפשרת שקופית ממברנה של עט בקצרה על ידי הצבת אותו על יד כפולה, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עבור 30 כל אחד ב 45 mL של 80% אתנול (#1 ו#2) עם עצבנות ב 50 שפופרת צנטריפוגה mL כדי להסיר את OCT.
הערה: חשוב להסיר את OCT לפני הצביעת, כדי למנוע מאוקטובר התיר במהלך הצביעת לטשטש את הסעיפים. מלקחיים ניתן להשתמש כדי להקל על ההסרה של OCT כי הוא לא נשטף על ידי עצבנות. - הנח שקופית על גיליון של רדיד אלומיניום. פיפטה 0.8 mL של 0.1% cresyl סגול ב 50% אתנול על השקופית וכתם עבור 30 s. לשטוף את השקופית ב 45 mL של 80% אתנול (#3) עבור 30 s, ולאחר מכן מייבשים במעבר עבור 30 כל אחד דרך 45 mL של 95% אתנול, 100% אתנול, ו קסילן בתוך 50 לצינורות צנטריפוגה mL.
- לעמוד שקופיות על מגב משימה עדין עבור 5 דקות כדי לנקז מחלקים יבשים.
הערה: יש לייבש שקופיות לגמרי לפני LCM.
4. לכידת לייזר מיקרודיסקציה
הערה: ללבוש אבקת כפפות מניטריל חינם בעת ביצוע LCM.
- הפעל את מיקרוסקופ LCM, לייזר ומחשב. היכנס למחשב והפעל את התוכנה. להפוך את המפתח "On" מיקום להפעיל את הלייזר. כאשר אור ירוק (לייזר) הוא על, לחץ על הכפתור האדום כדי להפעיל את הלייזר, ולאחר מכן את האור (לייזר) הופך אדום המציין לייזר הוא מוכן לשימוש.
הערה: הלייזר צריך כ 10 דקות כדי להתחמם. - הגדר את צינורות הגבייה.
- הכנס את הכובע של 0.5 mL פולימראז תגובת שרשרת (PCR) צינור לתוך האספן.
הערה: בחר את האספן המתאים לצינורות ה-PCR הרצויים (0.2 או 0.5 mL). - פיפטה 50 μL של מאגר החילוץ (מסופק על ידי ערכת בידוד RNA המפורטים בטבלת החומרים) לתוך הכובע של שפופרת אוסף mL 0.5.
- הכנס את התקן האיסוף למיקרוסקופ.
- בחלון ' שינוי התקן מלקט ', לחצו על הלחצן ' העבר לנקודת התייחסות ' כדי להעביר את האספן לנקודת ההתייחסות (RP). כוונן את המוקד כדי להציג בבהירות את ה-RP. לחץ על החיצים כדי להזיז את ה-RP למרכז התצוגה.
- הכנס את הכובע של 0.5 mL פולימראז תגובת שרשרת (PCR) צינור לתוך האספן.
- טען שקופיות דגימה.
- לחץ על לחצן ' בטל טעינה ' שמאלי בסרגל הכלים כדי להקטין את מחזיק השקופיות.
- מניחים את השקופית לתוך המחזיק, כשחתך הרקמה פונה כלפי מטה.
הערה: התמצאות זו מבטיחה שמקטעי הרקמה השבויים יפלו לתוך המכסה של צינור הכבידה. - הכנס את המחזיק חזרה לבמה.
- . הגדר את פרמטרי הלייזר
- בחר באפשרות הפקד של תפריט הלייזר או לחץ על סמל הלייזר .
- כוונן פרמטרים אלה כרצונך: כוח, כוח הלייזר; צמצם, רוחב הלייזר; ומהירות, את המהירות של חיתוך במצב לצייר ולחתוך .
הערה: בדוק את הלייזר באזור מחוץ לעניין. כוח גבוה יותר או צמצם גדול יותר מקל לגזור אך גורם נזק נוסף לתאים. להתאים את השילוב של כוח, צמצם, ומהירות כדי להשיג גזירה יעילה ונזק מינימלי של הרקמה. לדוגמה, Power = 40, צמצם = 5, ומהירות = 7 עבור רקמת הסחוס בסעיף 12 יקרומטר.
- בחר וגזור תחומי עניין.
- התחל עם המטרה 5x ולמצוא את תחומי העניין, ולאחר מכן לעבור את המטרה (5x, 10x, או 40x) המראה הטוב ביותר את אזור הריבית.
הערה: לאחר כתמים קרסיל סגול, הסחוס מוכתם מגנטה ורקמות מינרליזציה מופיעות חום או שחור, להבדיל מרקמות אחרות. ניתן לשמור תמונות באמצעות ' שמור תמונה בשם ' מתפריט הקובץ . - בחר את הצינור עבור אוסף (A, B, C, D) על ידי לחיצה על הסימון על האספן.
- בחר באפשרות הזז וגזור או צייר וגזור. במצב מעבר וחיתוך , הדגימה נחתכת באופן ידני, באמצעות העכבר או העט של מסך המגע כדי לצייר צורות ביד חופשית. במצב ציור וחיתוך , צורות עשויות להיות מצוירות ביד חופשית עם העכבר או העט של מסך המגע לחיתוך העוקב. לחץ על לחצן התחל גזור כדי ליזום חיתוך לייזר.
- לאחר הגזירה הושלמה, רקמת היעד עם קרום העט נופל לתוך כובע של צינור האוסף על ידי כוח הכבידה. חזור על 4.5 כדי לאגר תחומי עניין מרובים במידת הצורך.
הערה: חתכים חוזרים או הגדלת כוח או צמצם עשוי להיות הכרחי אם הרקמה לא ירידה לתוך כובע של צינור האוסף עקב חיתוך שלם. עצם מינרליזציה (חום או שחור) לא ניתן לגזור ישירות על ידי לייזר.
- התחל עם המטרה 5x ולמצוא את תחומי העניין, ולאחר מכן לעבור את המטרה (5x, 10x, או 40x) המראה הטוב ביותר את אזור הריבית.
- פרוק את האספן וסגור בזהירות את צינור ה-PCR. מניחים את רקמות המיקרוגזור בקרח יבש. המשך לשלב או לחנות הבאים ב--80 ° c.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. חזור על 4.2 ל-4.6 עבור המדגם הבא.
5. הליזה של רקמות מיקרו ובידוד RNA
- הפשרת רקמות המיקרוגזור בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בקצרה את הדגימות במשך 30 דקות ב 42 ° c.
- לאחר הדגירה, לסובב את מאגר הליזה למטה לתוך הצינור 0.5 mL PCR. בצע טיפול DNase וחילוץ RNA באמצעות ערכת בידוד RNA (ראה טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קטעים coronal של רקמות העכבר הקפוא קפואים ב-E 16.5 שימשו כדי להדגים את הבידוד ואת האוסף של הסחוס של Meckel (MC), סחוס condylar, ועצם הלסת על ידי LCM. עוברי עכבר על E 16.5 היו גזור מוטבע בתבניות קריוגניים עם מתחם OCT. דגימות בתבניות היו קפואות במהירות בקרח יבש ובמרחץ מתיל-2-בוטאן ואוחסנו ב-80 ° c.
כדי להפגין כתמים קרסיל סגול של סחוס ועצם, הקפאה במטוס ילתית בוצע ודגימות נאספו על שקופיות מיקרוסקופ. מקטעים נשטפו, ויטראז והתייבשות בעקבות הפרוטוקול לעיל (שלב 3.2 – 3.4). השקופיות היו יבשות מיובשות וממוזגות עם מדיום הרכבה קבוע. כל הסחוסים נבדק היו מוכתמים מגנטה (MC, סחוס condylar, סחוס האף מחיצת, סחוס הקוסטל, הסחוס הפרידיום של העצם presphenoid, הסחוס הפרידייה של רדיוס ו ulna) וכל הרקמות מינרליזציה היו חומים או שחור (איור 1A – E). שני הסחוס והעצם היו מכובדים בקלות מרקמות אחרות באתרים אנטומיים מרובים.
עבור LCM, ראשי העוברים ב-E 16.5 הועברו במישור הקורילי על שקופיות קרום העט בעובי של 12 μm, ו-6-8 מקטעים רצופים נאספו בכל שקופית ואוחסנו ב-80 ° c. OCT הוסר ומקטעים היו מוכתמים בקרסיל סגול ומיובש בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל (שלב 3.2 – 3.4). MC, סחוס condylar, ואת האזורים עצם הלסת נבחרו מבודדים על ידי LCM (איור 2). האזורים שנבחרו ירדו לתוך מאגר הליזה במכסה של צינור הגבייה. כדי להשיג RNA מספיק עבור רצף, אנו מאגר 10 אזורים של MC, 10 אזורים של סחוס condylar או 4 אזורים של עצם הלסת לתוך צינור כל אוסף כמו דוגמה אחת, בהתאמה.
RNA הופק באמצעות ערכת בידוד RNA לאחר הוראות היצרן. סה כ RNA נותח באמצעות מנתח ביולוגי (איור 3a – B). כדי לבדוק את ההשפעה של מכתים cresyl סגול על איכות של RNA, אנו השוונו RNA מדגימות עצם הלסת ויטראז ' עם cresyl סגול ודגימות ללא כתמים (רקמות מינרליזציה גלוי ללא כתמים, אבל cresyl הכתמים סגול מגביר את הניראות כדי להבחין עצם מרקמות המקיפים). אין הבדל משמעותי בשלמות RNA נצפתה בין דגימות ויטראז ' (n = 4) ודוגמאות ללא כתמים (n = 4), המציין את הכתמים מהירה cresyl סגול בפרוטוקול זה יש השפעה משמעותית על איכות ה-RNA (P = 0.858, מבחן t דו-זנבית של וולש, איור 3ג). השתמשנו בפרוטוקול שלנו עבור LCM של רקמות שונות בשלבים התפתחותיים שונים RINs נמדדו, המציין איכות RNA גבוהה (איור 3ד). התשואה הממוצעת של RNA מ-MC, סחוס condylar, ואת עצם הלסת היו 7.50 ± 1.45 ng, 12.55 ± 2.75 ng, ו 33.02 ± 7.63 ng (איור 3E) ואת התשואה/אזור היה 19.73 ± 3.82 ng/mm2, 26.70 ± 5.84 ng/mm2, ו 17.23 ± 3.98 Ng/mm2, בהתאמה (איור 3F), ללא הבדל משמעותי בין רקמות (MC נגד condylar סחוס, p = 0.383; הסחוס condylar לעומת עצם הלסת, p MC נגד עצם הלסת, P = 0.674).
הספריות היו מוכנות וברצף כמתואר בעבר6,7. שינוי גודל cDNA הנציג היה כ 500 bp (איור 4א). RNA-seq נתונים נותחו עם MultiQC8. ניתחנו נתוני RNA-seq מ -18 דגימות LCM (MC1-6, הסחוס של מקל; C1-6, סחוס condylar; M1-6, עצם הלסת ערכי איכות ממוצע על פני כל מיקום בסיס בקריאות נוצרו על ידי FastQC, המציין שיחות באיכות טובה מאוד (איור 4ב). התאמת הקריאה נותחה עם פיקארד (איור 4ג). הקריאות הראו אחוזים מיושרים גבוה והאחוז הממוצע של קריאות מיושרות היה 75%. כיסוי גנטי נותח עם פיקארד (איור 4ד), אשר הצביע על ייצוג טוב לאורך התעתיק מתוך 5 עד 3 ' הקצה.
ביטוי גנים דיפרנציאלי ניתוחבוצע 6,7. היו 4,006 גנים מאוד מבוטא באופן משמעותי (P < 0.05) בין עצם הלסת ו-MC (איור 5א). גנים ספציפיים לאוסטאופתים או אוסטאופציטים (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715, ו sparc16) היו יותר מבוטא בעצם הלסת לעומת MC, בעוד גנים ספציפיים כchondrocyte (אקאן17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123, ו Sox524) היו מאוד מבוטא ב-MC בהשוואה לעצם הלסת התחתונה (איור 5ב' ושולחן 1). בנוסף, סמנים אוסטאוקלסט כגון Acp525, Csf1r26, ctsk27, Itgb328, ו אוסקר29 זוהו גם מאוד מבוטא יותר בעצם הלסת לעומת MC (איור 5B ושולחן 1), המציין בידוד מוצלח של רקמות ממוקדות.
איור 1: הנציג cresyl סגול כתמים של סחוס ועצם בסעיפים ילתית של העובר העכבר ב-e 16.5. .הסחוסוהלסת התחתונה של מקל (ב) הסחוס של מקל, סחוס הקונדילר והלסת התחתונה. (ג) מחיצת האף ומקספיליות. (ד) סחוס הפרידיום של עצם presphenoid ועצם הפאלפה. (E) הסחוס הפרידיום של רדיוס, הסחוס הפרידיום של ulna, ו סחוס הקוסטל. ג = סחוס condylar; סמ ק = סחוס הקוסטל; CP = פרידיום הסחוס של עצם presphenoid; M = הלסת התחתונה; MC = הסחוס של מקל; MX = maxilla; NS = מחיצת האף; PL = עצם הפאלפה; R = מראש הסחוס של רדיוס; U = פרידיום הסחוס של ulna. סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אזורים מייצגים מבודדים על ידי LCM ונאסף עבור RNA-seq. (א – ג) הנציגמוכתםMC (A), הסחוס condylar (ב), ו המילין עם MC כבר מבודדים (C) בקריוסעיף לפני lcm. (D – F) האזורים ב-A, B ו-C לאחר הרקמות הייעודיות בודלו על ידי LCM. סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: איכות ה-RNA וכמות הדגימות LCM. (א – ב) הנציג electropherogram (A) ואת התמונה ג'ל המשויך (ב) מתוך bioanalyzer עבור דגימת עצם הלסת. (ג) rins של RNA הכולל מדגימות עצם הלסת ויטראז ' (n = 4) או ללא כתמים (n = 4). (ד) RINS של RNA הכולל מרקמות שונות בודד על ידי lcm. הסחוס של מקל ב-E 16.5 (n = 6); סחוס condylar ב-E 16.5 (n = 6); עצם הלסת על E 16.5 (n = 6); הסחוס באף מחיצת האף ב-E 14.5 (n = 6); המוח באי 14.5 (n = 6); המוח בשנת 16.5 (n = 7); המוח בשעה 29.7 (n = 4). (ה) יבול של סך RNA משלוש רקמות. כל המדגם של MC או condylar הסחוס היה בריכה של 10 אזורים מיקרו של סחוס, כל מדגם של עצם הלסת היה בריכה של 4 אזורים של מיקרומים של הלסת. (ו) התשואה לכל אזור יחידה (ng/mm2) בכל רקמה. נתונים משמעות ± s.e.m. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: האיכות של ספריות ו-RNA-seq נתונים שנוצרו מדגימות LCM. (A) נציג cdna בגודל של ספרייה ממדגם עצם הלסת נקבע על ידי bioanalyzer. (ב – ד) בקרת איכות של RNA-seq מ 18 דגימות LCM (MC1-6, הסחוס של Meckel; C1-6, סחוס condylar; M1-6, עצם הלסת) על ידי MultiQC. (ב) ערכי האיכות הממוצע בכל מיקום בסיס בקריאות נוצרו על-ידי fastqc. הרקע של הגרף מחלק את ציר y לשיחות באיכות טובה מאוד (ירוק), שיחות של איכות סבירה (כתום) ושיחות של איכות ירודה (אדום). (ג) התאמת הקריאות נותחה על ידי פיקארד. התקציר מוצג כאחוזים של קריאות מיושרות. (ד) כיסוי גנטי מנורמל שנותח עם פיקארד. העלילה מציינת את הכיסוי הממוצע היחסי לאורך התעתיק מקצה 5 (משמאל) לקצה של 3 (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של הנתונים RNA-seq מ עצם הלסת ו-MC מבודדים על ידי LCM. (A) הירארכי באשכולות של 4,006 גנים מאוד מבוטא באופן משמעותי (P < 0.05) בין עצם הלסת ו-MC. שלושה משכפל ביולוגי שימשו עבור כל רקמה. M1-3, עצם הלסת; MC1-3, MC. (ב) מגרש הר הגעש מציג שינויי קיפול וערכי P של הביעו הגנים בין עצם הלסת התחתונה ו-MC. דוגמאות של גנים ספציפיים באופן מאוד מבוטא תאים מוצגים: מחוז אוסטאופו סמנים אוסטאופנית בכחול, סמנים האוסטאופהאחרונים בירוק, ו סמנים כונדרוציט באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ג'ין | סוג תא | log2FoldChange | ביטוי ממוצע | ערך P מותאם |
| Col1a1 | אוסטאובלסט/אוסטציט | 2.64 | 12.94 | 2.22 e-05 |
| Col1a2 | אוסטאובלסט/אוסטציט | 3.41 | 12.87 | 8.27 e-07 |
| Dkk1 | אוסטאובלסט/אוסטציט | 7.59 | 2.01 | 5.21 e-03 |
| Dmp1 | אוסטאובלסט/אוסטציט | 9.73 | 3.42 | 3.19 e-04 |
| Dstn | אוסטאובלסט/אוסטציט | 2.51 | 6.87 | 5.73 e-07 |
| Runx2 | אוסטאובלסט/אוסטציט | 1.24 | 8.62 | 4.08 e-02 |
| Sp7 | אוסטאובלסט/אוסטציט | 2.24 | 6.95 | 5.81 e-03 |
| ב sparc | אוסטאובלסט/אוסטציט | 3.40 | 12.26 | 5.56 e-09 |
| Acp5 | אוסטאוקלסט | 3.38 | 5.74 | 6.46 e-06 |
| Csf1r | אוסטאוקלסט | 2.01 | 5.80 | 1.17 e-04 |
| קצק | אוסטאוקלסט | 3.19 | 7.56 | 5.73 e-07 |
| Itgb3 | אוסטאוקלסט | 2.88 | 5.37 | 2.43 e-04 |
| אוסקר | אוסטאוקלסט | 3.41 | 2.67 | 1.63 e-04 |
| אקן | כונדרוציט | -5.23 | 5.01 | 2.76 e-04 |
| Col2a1 | כונדרוציט | -3.61 | 9.47 | 3.29 e-03 |
| Col9a1 | כונדרוציט | -7.01 | 3.58 | 5.51 e-03 |
| Col9a2 | כונדרוציט | -5.40 | 3.76 | 2.60 e-03 |
| Col9a3 | כונדרוציט | -6.63 | 3.80 | 2.90 e-02 |
| Comp | כונדרוציט | -5.86 | 1.54 | 7.51 e-03 |
| Lect1 | כונדרוציט | -7.37 | 1.34 | 2.35 e-02 |
| Sox5 | כונדרוציט | -2.88 | 4.43 | 6.06 e-04 |
טבלה 1: הביטוי הדיפרנציאלי של גנים ידועים בסוגי תאים שונים של עצם וסחוס (עצם הלסת לעומת MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCM מאפשרת בידוד של אוכלוסיות תאים מועשר או הומוגניים מרקמות הטרוגניות. היתרונות שלה כוללים לכידת מהירה ומדויקת של תאים בהקשר vivo שלהם, בעוד חסרונות פוטנציאליים כוללים אותו להיות זמן רב, יקר, ומוגבל על ידי הצורך המשתמש לזהות אוכלוסיות משנה נפרדות בתוך דוגמה מסוימת30. פרוטוקול זה מספק פרטים של LCM של סחוס מעובריים העכבר העצם, הדגשת השימוש של cresyl סגול כתמים בהליך מהיר כדי להמחיש את הסחוס ואת העצם לאוסף רקמות מדויק תוך שמירה על שלמות RNA גבוהה עבור ניתוח עוקבות על ידי RNA-seq. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי מערכת LCM משמש כאן אינו מסוגל לחתוך ישירות על פני רקמות מינרליזציה (למשל, רקמת הלסת בשחור באיור 2ג); כתוצאה מכך, כל אזור העצם צריך להיות גזור. בעיקר, האזורים המיקרושים מבודדים על ידי LCM אינם הומוגניות, וכוללים לפחות את אוכלוסיית המשנה של האוסטאופה, האוסטאופציטים, והאוסטאופאורים (שולחן 1). אף על פי כן, העשרה על ידי LCM הוא בעל ערך כמו המחקר הקודם שלנו הראה כי שינויים מוגדרים באוכלוסיות משנה ספציפיות כגון אוסטאופאוקיים ברקמת העצם מיקרוגזור ניתן עדיין להבחין על ידי RNA-seq6.
עבור ניתוח ביטוי גנים, יש לנו אופטימיזציה הכנה לדוגמה ו LCM הליך עבור איכות RNA גבוהה ותשואה. הפרוטוקול שלנו מתחיל עם. רקמות קפואות טריות טרי הרקמה הקפואה חלקים לאפשר כמות ואיכות מעולה של RNA שחולצו3, כמו mrna הוא רגיש לשיטות סטנדרטיות של קיבוע31. RNA הוא מושפל במהירות על ידי זיהום RNase, ותחזוקה של סביבת RNase-free לאורך ההכנה לדוגמה, LCM, ו-RNA בידוד הוא קריטי עבור יישום מוצלח. חשיפה למים במהלך עיבוד מקטע מזיק לאיכות RNA31,32. הפרוטוקול שלנו מגביל חשיפה כזו, עם הרמה הגבוהה ביותר של חשיפה מימית להיות 50% במהלך כתמים קרסיל סגול. בדקנו כי כתמים מהירה (30 s) עם 0.1% cresyl סגול ב 50% אתנול נותן צבע להבדיל הסחוס ואינו מוריד את שלמות RNA עבור ניתוח במורד הזרם כגון כניסה נמוכה RNA-seq (איור 3ג ואיור 4). התשואה/אזור (ng/mm2) הוא כ 20 ng/mm2 (איור 3F), בדומה או גבוה יותר מאשר שיטות אופטימיזציה קודמות33. על פי צפיפות התא ב-MC ועצם הלסת6, אנו מעריכים כי עם פרוטוקול זה התשואה הממוצעת מתא אחד הוא כ 5 pg rna לכל תא, ו 1 – 5 ng rna הכולל ניתן לחילוץ מ 200 – 1000 תאים, אשר ניתן להשתמש עבור קלט נמוך RNA-seq6,7,33. זה יעילות תשואה גבוהה הרבה יותר מאשר הוקמה שיטות lcm34, וגם מעולה או דומה פרוטוקולים אופטימיזציה האחרונות33,35.
היכולת להבחין בין סוגי תאים שונים במקטעים היסטלוגיים חיוניים לאיסוף מדויק של רקמות מסוימות. Cresyl סגול הוא הידרופיפילית, כתם בסיסי הנקשר חומצות גרעין טעונה שלילית36. מאפיין זה עושה את זה שימושי עבור כתמי נגד עם הסלקטיביות סוג תא37, וזה כתם היסטולוגית סטנדרטית עבור נוירונים38. Cresyl ויולט כבר בשימוש lcm עבור מגוון של רקמות, מתן מורפולוגיה רקמה טובה באיכות RNA גבוהה33,36,39,40. לעומת שיטות כתמים אחרים, מכתים cresyl סגול מספק הפרטים הגרעיניים cytoplasmic, ו-RNA נמוך שיעור השפלה32. אנו מדגימים כאן כי הכתמים סגול cresyl היא שיטה קלה ומהירה כדי להמחיש את הסחוס ואת העצם, כי רקמות מוכתם עם שיטה זו חוסך שלמות RNA גבוהה. הטיפול xylene משמש בדרך כלל להתייבשות של רקמות לפני lcm35,36,41,42. אנו משתמשים קסילן כדי לשפר את ההדמיה של מורפולוגיה רקמות35 אשר חיוני כדי להבחין רקמות ממוקדות, במיוחד על שקופיות קרום העט כי הם לא ברורים כמו שקופיות זכוכית פשוטה. לא מצאנו שום התרחשות משמעותית של אובדן סעיף של שקופיות עט במהלך הצביעת ושטיפת שלבים, אפילו עם עצבנות כדי להסיר OCT.
מיקרוdroplet או microflui, מבוססי תא יחיד RNA-seq (scRNA-seq) הוא שיטת תפוקה גבוהה כדי לנתח transcript של רקמות עם סוגי תאים הטרוגנית החלה לשמש בביולוגיה השלד43. בניגוד ל-LCM, scRNA-seq כרוך בפירוק אנזימטי ו/או מכני של רקמות לתאים בודדים. רוב הפרוטוקולים עבור הכנה תא בודד דורשים רקמות להיות מודפות בטמפרטורת החדר או 37 ° c עבור תקופות ממושכות, אשר משנה את transcript44,45. בנוסף, בידוד של תאים בודדים סחוס ועצם עשוי להיות מוגבל פיזית על ידי אלמנט השלד מורכבות של טראקטריזציה ומינרליזציה. זה עדיין אתגר טכני לבודד מספר מספיק של תאים קיימא מרקמות השלד כי הם מייצגים באופן מדויק של מגוון הסלולר של רקמות ב vivo, ודיסוציאציה שלמה של התאים עלולים לגרום הטיה לזיהוי של סוגי תאים43. בעוד scRNA-seq מאפשר זיהוי של סוגים שונים של תאים, עומק הרצף הוא נמוך, וגישות טיפוסיות ברצף ללכוד 3 ' תעתיק מסתיים ואינם מאפשרים ניתוח החדרת חלופות. בצובר RNA-seq של רקמת LCM-נגזר הבדלי תאים, אך מאפשר זיהוי תעתיק מקיף וניתוח שחבור אלטרנטיבי. LCM היא אפוא שימושי במיוחד עבור רקמות השלד, כי הם לא בקלות ספרבילית מן הרקמות הסובבות ומורכבות פנימית, והכנת טרי קפוא של הרקמה יכול לשמר את הפרופילים הטרנססקריפט ואת שלמות RNA עבור ניתוח טרנססקריפט. חולשה נוספת של scRNA-seq היא כי לאחר הכנה תא יחיד, המידע המרחבי של התאים הוא איבד. שילוב של LCM ו-scRNA-seq פותחה כדי לאפשר את המחקר של transcript של מדגם קטן מתוך מיקומים גיאוגרפיים מוגדרים (גיאו-seq)46, אשר היא גישה נוספת של ניצול lcm ללמוד ביטוי הגנים מחודש.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק פרטים של LCM אופטימיזציה של סחוס ועצם, הדגשת השימוש של cresyl סגול כתמים בהליך מהיר כדי להמחיש את הסחוס ואת העצם עבור אוסף רקמות מדויק תוך שמירה על שלמות RNA גבוהה עבור ניתוח עוקבות על ידי RNA-seq. פרוטוקול זה נעשה בהצלחה עבור lcm של סחוס ועצם בשלבים התפתחותיים שונים עבור ניתוח ביטוי גנים6,7, וגם ניתן להשתמש עבור רקמות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר קרניו Ofacial (R01DE022988) ו שרייבר יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (P01HD078233). המחברים מודים למרכז הרפואי והפתולוגיה לגישה לפלטפורמת לייקה LMD 6500 בבית הספר Icahn לרפואה בהר סיני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
