이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이질적인 조직에서 특정 세포 모형 또는 관심 있는 지구를 격리하는 강력한 공구입니다. 골격 원소의 세포 및 분자 복잡성은 발달과 함께 증가합니다. 조직 이질성, 같은 서로 또는 주변 조직과 연골 및 골변 요소의 계면에서, 연골과 뼈를 개발하는 연구에 하나의 장애물이다. 당사의 프로토콜은 유전자 발현 분석을 위해 고품질 RNA를 산출하는 연골과 뼈의 조직 처리 및 격리의 신속한 방법을 제공합니다. 마우스 배아의 신선한 냉동 조직은 단면화되고 짧은 크레실 바이올렛 염색은 주변 조직과 구별되는 색상으로 연골과 뼈를 시각화하는 데 사용됩니다. 슬라이드는 다음 빠르게 탈수, 연골과 뼈는 LCM에 의해 이후에 격리. 이 프로세스 동안 수성 솔루션에 대한 노출을 최소화하면 RNA 무결성이 유지됩니다. 마우스 메켈의 연골과 E16.5에서 하악골이 성공적으로 수집되었고 유전자 발현 분석은 조골세포, 골세포, 골세포 및 연골세포에 대한 마커 유전자의 차등 발현을 보여주었다. 고품질 RNA는 또한 다양한 조직 및 배아 시대로부터 분리되었다. 이 프로토콜은 냉동, 절제, 염색 및 탈수를 포함한 LCM에 대한 샘플 준비를 자세히 설명하며, LCM에 의한 연골과 뼈의 정밀한 분리는 전사분석을 위한 고품질 RNA를 생성합니다.
서론
근골격계는 근육, 결합 조직, 힘줄, 인대, 연골 및 뼈로 구성된 다성분 시스템으로, 신경에 의해 심이도가 있고혈관에의해 혈관이 혈관에 의해 1. 골격 조직은 증가 세포 이질성 및 구조적 복잡성으로 개발. 연골과 뼈는 동일한 골연방울 감소기 계보에서 개발하고 매우 관련이 있습니다. 배아 연골과 뼈는 근육, 신경, 혈관 및 미분화 중간엽과 관련하여 발생합니다. 연골은 또한 뼈에 의해 포위 될 수있다, 이러한 Meckel의 연골과 하악골 내의 condylar 연골 등. 이 조직은 해부학적으로 연관되고 발달 도중 세포외 신호를 통해 서로 상호 작용합니다. 연골과 뼈의 발달에 있는 유전자 발현의 연구 결과에서, 1개의 장애물은 다중 조직 모형으로 구성된 골격 구조물의 이질성입니다. 관심 있는 특정 조직의 정밀한 분리는 성공적인 전사 분석을 위한 열쇠입니다.
레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이기종 조직 내의 세포 유형 또는 관심 영역을 분리하는 강력한 도구이며 재현 가능하며 단일 세포 수준2에민감합니다. 전사학, 유전체학 및 프로테오믹스3,4에서광범위한 하류 ....
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프로토콜
마우스에서 조직은 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 건강 가이드의 국가 학회에 따라 장악되고, 연구 프로토콜은 마운트 시나이에 있는 Icahn 의과 대학에 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 신선한 냉동 표본의 준비
- 관심 있는 배아 또는 조직을 해부합니다. 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물로 일회용 임베딩 금형에 시료를 내장합니다. 팁이나 바늘로 시편의 방향을 조정합니다.
- 드라이 아이스/메틸-2-부탄 욕조에서 시료를 빠르게 동결시되십시오. 다음 단계로 계속 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
2. 레이저 캡처 미세 해부를위한 냉동 절제
- 저온 유지를 해동하고 70 % 에탄올로 내부 표면을 청소하십시오. 롤 방지 플레이트와 한 쌍의 집게를 RNase 오염 제거제로 처리하십시오. 저온 온도를 원하는 절삭 온도(-18 ~ -22°C)로 설정합니다. 냉동 절제 중에 단면 된 샘플 슬라이드를 임시 보관하기 위해 드라이 아이스에 알루미늄 호일 시트를 놓고 건조 얼음으로 뚜껑이 달린 용기를 준비하십시오.
주....
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결과
E16.5에서 신선한 냉동 마우스 조직의 코로나 섹션은 Meckel의 연골 (MC), condylar 연골 및 LCM에 의한 하악골의 격리 및 수집을 입증하는 데 사용되었습니다. E16.5에서 마우스 배아는 OCT 화합물을 가진 극저온 형에 해부되고 매립되었다. 금형의 시료를 드라이 아이스 및 메틸-2-부탄 배스에서 급속히 동결시키고 -80°C에서 보관하였다.
연골과 뼈의 크레실 바이올렛 염색을 입증하기 위해, 관상 평면에서 냉동 절편을 수행하고 현미경 슬라이드에 샘플을 수집하였다. 섹션은 위의 프로토콜에 따라 세척, 염색 및 탈수되었습니다(단계 3.2-3.4). 슬라이드는 공기 건조및 영구 장착 매체로 장착되었다. 조사된 모든 연골은 염색된 마젠타(MC, condylar 연골, 비강 중격 연골, 코스튬 연골, 프리페노이드 뼈의 연골 프리모르듐, 반경과 척골의 연골 프리모르디아)와 모든 미네랄화된 조직이 갈색 또는 검은색으로 염색되었다(도1<.......
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토론
LCM은 이질적인 조직에서 농축되거나 균질한 세포 집단의 분리를 가능하게 한다. 그 장점은 생체 내 컨텍스트에서 세포의 신속하고 정확한 캡처를 포함, 잠재적 인 단점은 시간이 소요되는 것을 포함, 비싼, 지정된 샘플 내에서 뚜렷한 하위 집단을 인식하는 사용자에 대한 필요성에 의해 제한30. 이 프로토콜은 마우스 배아 연골과 뼈의 LCM의 세부 사항을 제공, RNA-seq에 의해 후속 분석을 위한 높은 RNA 무결성을 유지하면서 정확한 조직 수집을 위한 연골과 뼈를 시각화하는 빠른 절차에서 크레실 바이올렛 염색의 사용을 강조. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 여기에 사용되는 LCM 시스템이 광물화된 조직(예를 들어, 도 2C에서검은색하악조직)을 직접 절단할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 전체 뼈 영역을 해부 할 필요가있다. 특히, LCM에 의해 분리된 미세 제해골화 영역은 균질하지 않으며.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 치과 및 두개안면 연구의 국립 연구소 (R01DE022988)와 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (P01HD078233)에 의해 지원되었다. 저자는 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학에서 라이카 LMD 6500 플랫폼에 액세스 할 생물 rerepository 및 병리학 코어 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메틸부탄 | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| 바이오분석기 | 애질런트 | G2939BA | |
| 원심분리기 튜브 | ThermoFisher Scientific | 339653 | 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 50mL |
| 크레실 바이올렛 아세테이트 | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| 저온 유지 장치 | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| 섬세한 작업 와이퍼 | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| 일회용 임베딩 몰 | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | 분자생물학 등급 |
| 유리 PEN 멤브레인 슬라이드 | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM 시스템 | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| 현미경 커버 유리 | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| 현미경 슬라이드 | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM 수집 튜브 |
| 영구 장착 매체 | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA 분리 키트 | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase 오염 제거제 | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase 표면 청소용 오염 제거제 |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
참고문헌
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profi....
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재인쇄 및 허가
