Summary
Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.
Abstract
A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos específicos de células ou regiões de interesse de tecidos heterogêneos. A complexidade celular e molecular de elementos esqueléticos aumenta com o desenvolvimento. A heterogeneidade tecidual, como na interface de elementos cartilaginosos e osseos uns com os outros ou com tecidos circundantes, é um obstáculo para o estudo do desenvolvimento de cartilagem e osso. Nosso protocolo fornece um método rápido de processamento de tecidos e isolamento de cartilagem e osso que produz RNA de alta qualidade para análise de expressão gênica. Os tecidos congelados frescos de embriões do rato são seccionados e a mancha violeta breve do cresyl é usada para visualizar a cartilagem e o osso com as cores distintas dos tecidos circunvizinhos. Slides são então rapidamente desidratados, e cartilagem e osso são isolados posteriormente por LCM. A minimização da exposição a soluções aquosas durante este processo mantém a integridade do RNA. A cartilagem e osso mandibular do rato Meckel na E16.5 foram coletados com sucesso e a análise da expressão gênica mostrou expressão diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e condrocitos. O RNA de alta qualidade também foi isolado de uma variedade de tecidos e idades embrionárias. Este protocolo detalha a preparação da amostra para LCM que inclui o cryoembedding, seção, coloração e desidratação de tecidos congelados frescos, e a isolação precisa da cartilagem e do osso por LCM tendo por resultado o RNA de alta qualidade para a análise transcriptomic.
Introduction
O sistema musculoesquelético é um sistema multicomponente composto de músculo, tecido conjuntivo, tendão, ligamento, cartilagem e osso, interno e vascularizado pelos vasos sanguíneos1. Os tecidos esqueléticos desenvolvem-se com o aumento da heterogeneidade celular e complexidade estrutural. Cartilagem e osso se desenvolvem a partir da mesma linhagem osteochondroprogenitor e são altamente relacionados. Cartilagem embrionária e osso se desenvolvem em associação com músculos, nervos, vasos sanguíneos e mesenchyme indiferenciado. A cartilagem também pode ser cercada por ossos, como a cartilagem de Meckel e cartilagem condylar dentro do osso mandibular. Estes tecidos são anatomicamente associados e interagem uns com os outros através de sinais extracelulares durante o desenvolvimento. No estudo da expressão gênica no desenvolvimento de cartilagem e osso, um obstáculo é a heterogeneidade de estruturas esqueléticas compostas por múltiplos tipos de tecido. O isolamento preciso do tecido específico de interesse é fundamental para uma análise transcricional bem-sucedida.
A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos de células ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos, e é reproduzível e é sensível ao nível de célula única2. Ele pode precisamente alvo e capturar células de interesse para uma ampla gama de ensaios a jusante em transcriptômica, genômica e proteômica3,4. A qualidade do RNA, DNA ou proteína isolado pode ser avaliada com um bioanalisador ou plataforma equivalente. Por exemplo, a qualidade do RNA é indicada pelo número de integridade do RNA (RIN)5.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para a coloração rápida e isolamento da cartilagem e osso por LCM de tecidos congelados frescos. Usamos o embrião do camundongo para demonstrar que este protocolo produz RNA de alta qualidade para análise transcriptômica subsequente, como sequenciamento de RNA (RNA-seq).
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Protocol
Tecidos de camundongos foram obtidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, e protocolos de estudo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Icahn School of Medicine no Monte Sinai.
1. Preparação de espécime congelado fresco
- Dissecar o embrião ou tecido de interesse. Incorporar a amostra em um molde de incorporação descartável com temperatura de corte ideal (OCT) composto. Ajuste a orientação do espécime com uma ponta ou agulha.
- Congele rapidamente as amostras em um banho seco de gelo/metil-2-butano. Continue para o próximo passo ou armazenar a -80 °C.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Criossecagem para Microdissese de Captura a Laser
- Descongele o criostat e limpe superfícies internas com 70% de etanol. Trate a placa anti-rolo e um par de fórceps com agente de descontaminação RNase. Defina o criostat a temperatura de corte desejada (-18 a -22 °C). Prepare um recipiente com tampa com gelo seco, colocando uma folha de alumínio no gelo seco para armazenamento temporário das lâminas de amostra seccionadas durante a criossecção.
CUIDADO: O gelo seco é extremamente frio. Sempre lidar com gelo seco com cuidado e usar luvas isoladas sempre manuseá-lo. - Transfira o espécime congelado fresco em um balde de gelo seco. Coloque uma camada de composto OCT em um suporte de espécime criostat e coloque imediatamente o espécime em cima do OCT com pressão suave. Quando oct está completamente congelado, aperte o suporte com o espécime no braço de corte criostat.
- Deixe a amostra no criostat por 15 min para equilibrar a temperatura de corte.
- Seção o tecido e recolher as fatias de polietileno naftalato (PEN) desliza membrana em uma espessura de 12 μm. Alinhar seções consecutivas na membrana. Uma vez que um slide é concluído, permitir que as seções secar por alguns minutos e transferir o slide para a folha no recipiente de gelo seco até que todos os slides necessários são coletados.
- Guarde os slides a -80 °C em uma caixa de slides.
Nota: A espessura da seção é escolhida para maximizar a quantidade de tecido coletado ao permitir o corte eficiente do tecido, e pode variar dependendo do tecido do interesse. O protocolo pode ser pausado aqui. Mantenha os slides livres da contaminação por RNase. Evite mudanças de temperatura. Embora os RINs de RNA de slides armazenados por até 6 meses ainda possam indicar alta qualidade do RNA, recomendamos o uso de slides o mais rápido possível.
3. Preparação da amostra para a microdissecção da captação do laser
- Prepare soluções para coloração e desidratação.
- Coloque 45 mL de 80% de etanol em cada um dos três tubos de centrífuga de 50 mL no gelo. Rotulá-los como #1, #2 e #3. Diluir etanol com água livre de RNase/DNase.
- Coloque 45 mL de 95% de etanol em um tubo de centrífuga de 50 mL no gelo.
- Coloque 45 mL de 100% de etanol em um tubo de centrífuga de 50 mL no gelo.
- Coloque 45 mL de xileno em um tubo de centrífuga de 50 mL à temperatura ambiente.
CUIDADO: Xileno deve ser usado em um capô de fumaça.
- Descongele uma membrana PEN deslize brevemente, colocando-a contra uma mão enluvada, em seguida, lave duas vezes por 30 s cada em 45 mL de 80% de etanol (#1 e #2) com agitação em tubos de centrífuga de 50 mL para remover o OCT.
Nota: É importante remover oct antes da coloração, para evitar OCT solto durante a coloração de obscurecer as seções. Fórceps podem ser usados para facilitar a remoção de OCT que não é lavado pela agitação. - Coloque a lâmina em uma folha de alumínio. Pipette 0,8 mL de 0,1% violeta cresyl em 50% de etanol no escorregador e mancha por 30 s. Lave o slide em 45 mL de 80% de etanol (#3) para 30 s, e depois desidratar por passagem para 30 s cada através de 45 mL de 95% de etanol, 100% etanol, e xylene em tubos de 50 mL centrífuga.
- Suporte slides em um limpador de tarefas delicada spor 5 min para drenar seções de xileno e seca.
Nota: Os slides devem ser completamente secos antes do LCM.
4. Microdissese de captura a laser
Nota: Use luvas de nitrilo sem pó durante a execução de LCM.
- Ligue o microscópio LCM, laser e computador. Faça login no computador e inicie o software. Ligue a chave para a posição "On" para iniciar o laser. Quando a luz verde (Laser) estiver acesa, pressione o botão vermelho para ativar o laser e, em seguida, a luz (Laser) fica vermelha indicando que o laser está pronto para uso.
Nota: O laser precisa de aproximadamente 10 min para aquecer. - Configure os tubos de coleta.
- Insira a tampa de um tubo de reação em cadeia de polimerase de 0,5 mL (PCR) no coletor.
Nota: Escolha o coletor correspondente para os tubos PCR desejados (0,2 ou 0,5 mL). - Pipette 50 μL de buffer de extração (fornecido pelo kit de isolamento RNA listado na Tabela de Materiais) na tampa do tubo de coleta de 0,5 mL.
- Insira o dispositivo de coleta no microscópio.
- Na janela do dispositivo de coletor de mudança, clique no botão Move to Reference Point para mover o coletor para o ponto de referência (RP). Ajuste o foco para ver claramente o RP. Clique nas setas para mover o RP para o centro da vista.
- Insira a tampa de um tubo de reação em cadeia de polimerase de 0,5 mL (PCR) no coletor.
- Carregar slides de espécimes.
- Clique no botão de descarga esquerdo na barra de ferramentas para baixar o suporte de slides.
- Coloque o slide no suporte, com a seção de tecido voltada para baixo.
Nota: Esta orientação garante que as seções de tecido capturados caiam na tampa do tubo de coleta por gravidade. - Insira o suporte de volta ao palco.
- Configure os parâmetros a laser.
- Selecione a opção controle do menu Laser ou clique no ícone Laser.
- Ajuste esses parâmetros como desejado: Poder,o poder do laser; Abertura,a largura do laser; e Velocidade,a velocidade de corte no modo Draw and Cut.
Nota: Teste o laser em uma área fora do interesse. Maior potência ou abertura maior torna mais fácil de cortar, mas causa mais danos às células. Ajuste a combinação de potência, abertura e velocidade para obter corte eficiente e danos mínimos do tecido. Por exemplo, Power = 40, Aperture = 5, e Velocidade = 7 para o tecido da cartilagem em uma seção de 12 μm.
- Selecione e corte áreas de interesse.
- Comece com 5x objetivo e encontrar as áreas de interesse, e depois mudar para o objetivo (5x, 10x, ou 40x) que melhor mostra a área de interesse.
Nota: Após a coloração violeta cresyl, cartilagens são manchadas magenta e tecidos mineralizados parecem marrom ou preto, distinguível de outros tecidos. As imagens podem ser salvas usando salvar a imagem como do menu arquivo. - Escolha o tubo para coleta (A, B, C, D) clicando na marca no coletor.
- Escolha Mover e cortar ou desenhar e cortar. No modo Move and Cut, o espécime é cortado manualmente, usando o mouse ou a caneta touch-screen para desenhar formas à mão livre. No modo Draw and Cut, as formas podem ser desenhadas à mão livre com o mouse ou a caneta touch-screen para o corte subsequente. Clique no botão Iniciar o Corte para iniciar o corte a laser.
- Uma vez que o corte é terminado, o tecido do alvo com membrana da PENA cai no tampão do tubo da coleção pela gravidade. Repita 4,5 para reunir várias áreas de interesse, se necessário.
Nota: Repetir cortes ou aumentar o poder ou a abertura pode ser necessário se o tecido não deixar cair no tampão do tubo da coleção devido ao corte incompleto. Osso mineralizado (marrom ou preto) não pode ser cortado diretamente por laser.
- Comece com 5x objetivo e encontrar as áreas de interesse, e depois mudar para o objetivo (5x, 10x, ou 40x) que melhor mostra a área de interesse.
- Descarregue o coletor e feche cuidadosamente o tubo PCR. Coloque os tecidos microdissecados em gelo seco. Continue para o próximo passo ou armazenar a -80 °C.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Repita 4,2 a 4,6 para a próxima amostra.
5. Lysis de tecidos microdissecados e isolamento de RNA
- Descongele os tecidos microdissecados à temperatura ambiente. Centrífuga brevemente e incubar as amostras por 30 min a 42 °C.
- Após a incubação, gire o amortecedor da lyse para baixo no tubo de PCR de 0.5 mL. Realize o tratamento de DNase e a extração de RNA usando um kit de isolamento de RNA (veja a Tabela de Materiais)seguindo as instruções do fabricante.
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Representative Results
As seções coronais de tecidos frescos do rato congelado em E16.5 foram usadas para demonstrar a isolação e a coleção da cartilagem de Meckel (MC), da cartilagem condylar, e do osso mandibular por LCM. Embriões de camundongos na E16.5 foram dissecados e embutidos em moldes criogênicos com composto OCT. As amostras nos moldes foram congeladas ràpida em um gelo seco e em um banho metil-2-butano e armazenadas em -80 °C.
Para demonstrar a coloração violeta do cresyl da cartilagem e do osso, a crioção no plano coronal foi executada e as amostras foram coletadas em corrediças do microscópio. As seções foram lavadas, manchadas e desidratadas seguindo o protocolo acima (passo 3,2-3,4). As lâminas eram secas ao ar e montadas com meio de montagem permanente. Todas as cartilagens examinadas foram magenta manchada (MC, cartilagem condylar, cartilagem do septo nasal, cartilagem costal, primordium da cartilagem do osso presfenoid, primordia da cartilagem do raio e ulna) e todos os tecidos mineralizados foram manchados marrom ou preto (Figura 1A-E). A cartilagem e o osso foram distinguidos facilmente de outros tecidos em locais anatômicos múltiplos.
Para lcm, cabeças de embriões em E16.5 foram seccionados no plano coronal em pen membrana slides em uma espessura de 12 μm, e 6-8 seções consecutivas foram coletadas por slide e armazenados a -80 °C. Oct foi removido e seções foram manchadas com violeta cresyl e desidratadas seguindo o protocolo descrito acima (passo 3.2-3.4). MC, cartilagem condylar e as regiões ósseas mandibular foram selecionadas e isoladas pela LCM(Figura 2). As regiões selecionadas caíram no tampão de larguei na tampa do tubo de coleta. Para obter RNA suficiente para sequenciamento, agrupamos 10 regiões de MC, 10 regiões de cartilagem condylar ou 4 regiões de osso mandibular em cada tubo de coleta como uma amostra, respectivamente.
O RNA foi extraído usando um kit de isolamento de RNA seguindo as instruções do fabricante. O RNA total foi analisado por meio de um bioanalisador(Figura 3A-B). Para testar o efeito da coloração violeta cresyl na qualidade do RNA, comparamos rna de amostras de ossos mandibulares manchadas com violeta cresyl e amostras sem manchas (tecido mineralizado é visível sem coloração, mas a coloração violeta cresyl aumenta a visibilidade para distinguir osso dos tecidos circundantes). Nenhuma diferença significativa na integridade do RNA foi observada entre amostras manchadas (n = 4) e amostras sem mancha (n = 4), indicando que a mancha violeta cresyl rápida neste protocolo tem efeito insignificante na qualidade do RNA (P = 0.858, t-test de Welch de duas caudas, figura 3C). Usamos nosso protocolo para LCM de vários tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento e RINs foram medidos, indicando alta qualidade de RNA(Figura 3D). Os rendimentos médios de RNA de MC, cartilagem condylar e osso mandibular foram de 7,50 ± 1,45 ng, 12,55 ± 2,75 ng, e 33,02 ± 7,63 ng (Figura 3E) e o rendimento/área foi de 19,73 ± 3,82 ng/mm2, 26,70 ± 5,84 ng/mm2, e 17,23 ± 3,98 ng/mm2, respectivamente (Figura 3F), sem diferença significativa entre os tecidos (MC versus condylar, cartilagem P = 0,383; cartilagem condylar versus osso mandibular, P = 0,260; MC versus osso mandibular, P = 0,674).
As bibliotecas foram preparadas e sequenciadas como descrito anteriormente6,7. Um tamanho representativo do cDNA foi de aproximadamente 500 bp(Figura 4A). Os dados de RNA-seq foram analisados com o MultiQC8. Analisamos dados de RNA-seq de 18 amostras de LCM (MC1-6, cartilagem de Meckel; C1-6, cartilagem condylar; M1-6, osso mandibular). Os valores de qualidade média em cada posição base nas leituras foram gerados pela FastQC, indicando chamadas de qualidade muito boa(Figura 4B). O alinhamento lido foi analisado com Picard(Figura 4C). As leituras mostraram altas porcentagens alinhadas e a porcentagem média de leituras alinhadas foi de 75%. A cobertura gênica foi analisada com Picard (Figura 4D),que indicou uma boa representação ao longo da transcrição do 5' para o final de 3'.
A análise diferencial da expressão gênica foi realizada6,7. Foram expressos 4.006 genes significativamente diferencialmente (P < 0,05) entre o osso mandibular e o MC (Figura 5A). Genes específicos para osteoblastos ou osteócitos (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715, e Sparc16) foram mais expressos no osso mandibular em comparação com MC, enquanto genes específicos de condrocito (Acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123, e Sox524) foram mais expressos em MC em comparação com o osso mandibular ( Figura5B e Tabela 1). Além disso, marcadores osteoclast como Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328,e Oscar29 também foram identificados como mais expressos no osso mandibular em comparação com MC ( Figura5B e Tabela 1), indicando o isolamento bem sucedido dos tecidos direcionados.
Figura 1: Mancha violeta agrião representativa de cartilagem e osso em seções coronais do embrião de rato em E16.5. (A)Cartilagem meckel e hemimandible. (B)Cartilagem de Meckel, cartilagem condylar, e hemimandible. (C)Septo nasal e maxilás. (D)Cartilagem primordium de osso presfenóide e osso palatino. (E)Cartilagem primordium de raio, primordium cartilagem de ulna, e cartilagem costeira. C = cartilagem condylar; CC = cartilagem costal; CP = primordium da cartilagem do osso pré-fenóide; M = hemimandible; MC = Cartilagem de Meckel; MX = maxilla; NS = septo nasal; PL = osso do palatino; R = primordium cartilagem de raio; U = primordium cartilagem de ulna. Barra de escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Regiões representativas isoladas pela LCM e coletadas para RNA-seq. (A-C) Representante manchado MC (A), cartilagem condylar (B),e hemimandible com MC já isolado (C)em crioseca antes lcm. (D-F) As regiões em A, B e C após tecidos direcionados foram isoladas pela LCM. Barra de escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Qualidade e quantidade de RNA de amostras de LCM. (A-B) Eletroferograma representativo (A)e a imagem de gel associada (B)de um bioanalisador para uma amostra de osso mandibular. (C)RINs de RNA total de amostras de osso mandibular manchadas com violeta cresyl (n = 4) ou sem coloração (n = 4). (D)RINs de RNA total de diferentes tecidos isolados pela LCM. Cartilagem de Meckel em E16.5 (n = 6); Cartilagem condylar em E16.5 (n = 6); Osso mandibular em E16.5 (n = 6); Cartilagem do septo nasal em E14.5 (n = 6); Cérebro em E14.5 (n = 6); Cérebro em E16.5 (n = 7); Cérebro em E18.5 (n = 4). (E)Rendimento do RNA total de três tecidos. Cada amostra de cartilagem mc ou condylar foi um pool de 10 regiões microdissecadas de cartilagem e cada amostra de osso mandibular foi uma piscina de 4 regiões microdissecadas de hemimandible. (F)O rendimento por unidade de área (ng/mm2)em cada tecido. Os dados são significam ± s.e.m. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: A qualidade das bibliotecas e dados de RNA-seq gerados a partir de amostras de LCM. (A)Tamanhos representativos do cDNA de uma biblioteca de uma amostra do osso mandibular determinada por um bioanalyzer. (B-D) Análise de controle de qualidade de RNA-seq de 18 amostras de LCM (MC1-6, cartilagem de Meckel; C1-6, cartilagem condylar; M1-6, osso mandibular) por MultiQC. (B) Os valores de qualidade média em cada posição base nas leituras foram gerados pela FastQC. O pano de fundo do gráfico divide o eixo y em chamadas de qualidade muito boa (verde), chamadas de qualidade razoável (laranja) e chamadas de má qualidade (vermelho). (C)O alinhamento das leituras foi analisado por Picard. O resumo é mostrado como as porcentagens de leituras alinhadas. (D)Cobertura genética normalizada analisada com Picard. O enredo indica a cobertura média relativa ao longo da transcrição do final de 5 '(esquerda) para 3' final (direita). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Análise de expressão diferencial dos dados de RNA-seq do osso mandibular e MC isolados pela LCM. (A)Agrupamento hierárquico de 4.006 genes significativamente expressos diferencialmente (P < 0,05) entre o osso mandibular e mc. Três réplicas biológicas foram utilizadas para cada tecido. M1-3, osso mandibular; MC1-3, MC. (B)Enredo vulcânico mostrando mudanças duplas e valores P de genes expressos diferencialmente entre osso mandibular e MC. Exemplos de genes altamente expressos de células expressas são mostrados: marcadores de osteoblasto e osteócito em azul, marcadores de osteoclasta em verde e marcadores de condrocícitos em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Gene | Tipo de célula | log2FoldChange Log2FoldChange | Expressão média | Valor P ajustado |
| Col1a1 Col1a1 | Osteoblasto/Osteócito | 2.64 | 12.94 | 2.22E-05 2.22E-05 |
| Col1a2 Col1a2 | Osteoblasto/Osteócito | 3.41 | 12.87 | 8.27E-07 8.27E-07 |
| Dkk1 Dkk1 | Osteoblasto/Osteócito | 7.59 | 2.01 | 5.21E-03 5.21E-03 |
| Dmp1 Dmp1 | Osteoblasto/Osteócito | 9.73 | 3.42 | 3.19E-04 3.19E-04 |
| Dstn Dstn | Osteoblasto/Osteócito | 2.51 | 6.87 | 5.73E-07 5.73E-07 |
| Runx2 Runx2 | Osteoblasto/Osteócito | 1.24 | 8.62 | 4.08E-02 4.08E-02 |
| Sp7 Sp7 | Osteoblasto/Osteócito | 2.24 | 6.95 | 5.81E-03 5.81E-03 |
| Sparc | Osteoblasto/Osteócito | 3.40 | 12.26 | 5.56E-09 5.56E-09 |
| Acp5 Acp5 | Osteoclast osteoclast | 3.38 | 5.74 | 6.46E-06 6.46E-06 |
| Csf1r Csf1r | Osteoclast osteoclast | 2.01 | 5.80 | 1.17E-04 1.17E-04 |
| Ctsk Ctsk | Osteoclast osteoclast | 3.19 | 7.56 | 5.73E-07 5.73E-07 |
| Itgb3 Itgb3 | Osteoclast osteoclast | 2.88 | 5.37 | 2.43E-04 2.43E-04 |
| Oscar | Osteoclast osteoclast | 3.41 | 2.67 | 1.63E-04 1.63E-04 |
| Acan Acan | Chondrócito | -5.23 | 5.01 | 2.76E-04 2.76E-04 |
| Col2a1 Col2a1 | Chondrócito | -3.61 | 9.47 | 3.29E-03 3.29E-03 |
| Col9a1 Col9a1 | Chondrócito | -7.01 | 3.58 | 5.51E-03 5.51E-03 |
| Col9a2 Col9a2 | Chondrócito | -5.40 | 3.76 | 2.60E-03 2.60E-03 |
| Col9a3 Col9a3 | Chondrócito | -6.63 | 3.80 | 2.90E-02 2.90E-02 |
| Comp | Chondrócito | -5.86 | 1.54 | 7.51E-03 7.51E-03 |
| Lect1 Lect1 | Chondrócito | -7.37 | 1.34 | 2.35E-02 2.35E-02 |
| Sox5 Sox5 | Chondrócito | -2.88 | 4.43 | 6.06E-04 6.06E-04 |
Tabela 1: Expressão diferencial de genes conhecidos em vários tipos celulares de osso e cartilagem (osso mandibular versus MC).
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Discussion
O LCM permite o isolamento de populações de células enriquecidas ou homogêneas de tecidos heterogêneos. Suas vantagens incluem a captura rápida e precisa de células em seu contexto in vivo, enquanto as desvantagens potenciais incluem que seja demorado, caro e limitado pela necessidade de o usuário reconhecer subpopulações distintas dentro de uma amostra especificada30. Este protocolo fornece detalhes de LCM da cartilagem embrionária do rato e do osso, destacando o uso da mancha violeta do agrião em um procedimento rápido para visualizar a cartilagem e o osso para a coleção precisa do tecido ao manter a integridade elevada do RNA para a análise subseqüente pelo RNA-seq. Uma limitação desse protocolo é que o sistema LCM usado aqui não é capaz de cortar diretamente os tecidos mineralizados (por exemplo, o tecido mandibular em preto na Figura 2C); como resultado, toda a área óssea precisa ser dissecada. Notavelmente, as regiões ossificadas microdissecadas isoladas pela LCM não são homogêneas, e incluem pelo menos as subpopulações de osteoblastos, osteócitos e osteoclastos (Tabela 1). No entanto, o enriquecimento por LCM é valioso, pois nosso estudo anterior mostrou que as mudanças transcricionais em subpopulações específicas, como osteoclastos no tecido ósseo microdissecado ainda podem ser detectadas pelo RNA-seq6.
Para análise de expressão gênica, otimizamos a preparação da amostra e o procedimento lcm para alta qualidade e rendimento de RNA. Nosso protocolo começa com tecidos congelados frescos. As seções frescas do tecido congelado permitem a quantidade e a qualidade excelentes do RNA extraído3,porque o mRNA é sensível aos métodos padrão da fixação31. O RNA é rapidamente degradado pela contaminação por RNase, e a manutenção de um ambiente livre de RNase durante a preparação da amostra, o lcm e o isolamento de RNA são fundamentais para a aplicação bem-sucedida. A exposição à água durante o processamento da seção é prejudicial à qualidade31,32. Nosso protocolo limita tal exposição, com o nível o mais elevado de exposição aquosa que é 50% durante a coloração violeta do cresyl. Testamos que uma coloração rápida (30 s) com violeta cresyl de 0,1% em 50% de etanol dá uma cor distinguível à cartilagem e não reduz a integridade do RNA para análise a jusante, como rna-seq de baixa entrada (Figura 3C e Figura 4). O rendimento/área (ng/mm2)é de aproximadamente 20 ng/mm2 (Figura 3F),semelhante ou superior aos métodos otimizados anteriores33. De acordo com as densidades celulares em MC e osso mandibular6, estimamos que com este protocolo o rendimento médio de uma célula é de aproximadamente 5 pg RNA por célula, e 1-5 ng de RNA total pode ser extraído de 200-1.000 células, que podem ser usadas para rna de baixa entrada-seq6,7,33. Essa eficiência de rendimento é muito maior do que os métodos estabelecidos de LCM34,e também superior ou semelhante aos protocolos otimizados recentes33,35.
A capacidade de distinguir diferentes tipos de células em seções histológicas é essencial para a coleta precisa de tecidos específicos de interesse. Violeta cresyl é uma mancha hidrofílica, básica que se liga a ácidos nucleicos carregados negativamente36. Esta propriedade torna útil para contra-manchas com seletividade do tipo celular37,e é uma mancha histológica padrão para os neurônios38. Violeta Cresyl tem sido usada em LCM para uma variedade de tecidos, fornecendo boa morfologia do tecido e alta qualidade de RNA33,36,39,40. Em comparação com outros métodos de coloração, a coloração violeta cresyl fornece detalhes citoplasmais e nucleares, e uma baixa taxa de degradação do RNA32. Demonstramos aqui que a coloração violeta cresyl é um método fácil e rápido para visualizar cartilagem e osso e que o tecido manchado com este método conserva a integridade alta do RNA. O tratamento com xileno é comumente usado para desidratação dos tecidos antes de LCM35, 36,41,42. Usamos xileno para melhorar a visualização da morfologia do tecido35, que é essencial para distinguir tecidos direcionados, especialmente em slides de membrana PEN que não são tão opticamente claros quanto slides de vidro simples. Não encontramos nenhuma ocorrência significativa de perda de seção de pen slides durante a coloração e lavagem de etapas, mesmo com agitação para remover OCT.
Microdroplet ou microfluídico baseado em rna-seq de células únicas (scRNA-seq) é um método de alta taxa de produção para analisar transcriptomas de tecidos com tipos de células heterogêneas e começou a ser usado em biologia esquelética43. Em contraste com lcm, scRNA-seq envolve enzimática e / ou desagregação mecânica do tecido em células individuais. A maioria dos protocolos para a preparação de células únicas exigem que os tecidos sejam incubados à temperatura ambiente ou 37 °C por longos períodos, o que altera o transcriptoma44,45. Além disso, o isolamento de células individuais na cartilagem e no osso pode ser fisicamente limitado pela complexidade do elemento esquelético de trabecularização e mineralização. Ainda é um desafio técnico isolar um número suficiente de células viáveis de tecidos esqueléticos que são precisamente representativos da diversidade celular de tecidos in vivo, e dissociação incompleta das células pode causar viés na detecção de tipos de células43. Enquanto scRNA-seq permite a identificação de tipos distintos de células, a profundidade de sequenciamento é baixa, e abordagens de sequenciamento típico capturar 3' transcrição termina e não permitem análise alternativa de emenda. O RNA-seq em massa do tecido derivado do LCM homogeneiza as diferenças celulares, mas permite a detecção de transcrição abrangente e a análise alternativa de emenda. LCM é, portanto, especialmente útil para tecidos esqueléticos que não são facilmente separáveis dos tecidos circundantes e internamente complexo, e preparação congelada fresca do tecido pode preservar tanto os perfis transcricionais e integridade RNA para análise transcricional. Outra fraqueza do scRNA-seq é que, após a preparação de uma única célula, a informação espacial das células é perdida. Uma combinação de LCM e scRNA-seq foi desenvolvida para permitir o estudo do transcriptome de uma amostra pequena das posições geográficas definidas (Geo-seq)46,que é uma outra aproximação de utilizar LCM para estudar a expressão regionalizada do gene.
Em resumo, este protocolo fornece detalhes do LCM otimizado de cartilagem e osso, destacando o uso de coloração violeta cresyl em um procedimento rápido para visualizar cartilagem e osso para coleta precisa de tecidos, mantendo a alta integridade do RNA para análise posterior por RNA-seq. Este protocolo tem sido usado com sucesso para LCM de cartilagem e osso em diferentes estágios de desenvolvimento para a análise de expressão gênica6,7,e também pode ser usado para outros tecidos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (R01DE022988) e pelo Instituto Nacional eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (P01HD078233). Os autores agradecem ao Núcleo de Biorepositório e Patologia pelo acesso à plataforma Leica LMD 6500 na Escola de Medicina Icahn, no Monte Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
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