Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

ERRATUM NOTICE

Summary

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Abstract

Dit is een protocol voor de dubbele visualisatie van Microglia en infiltrerende macrofagen in muis hersenweefsel. TMEM119 (welke labels Microglia selectief), in combinatie met IBA1 (die een uitzonderlijke visualisatie van hun morfologie biedt), maakt onderzoek mogelijk van veranderingen in dichtheid, distributie en morfologie. Het kwantificeren van deze parameters is belangrijk om inzicht te geven in de rollen die worden uitgeoefend door Microglia, de ingezeten macrofagen van de hersenen. Onder normale fysiologische omstandigheden worden Microglia regelmatig verdeeld in een mozaïek achtig patroon en presenteren ze een klein SOMA met vertakte processen. Niettemin, als reactie op omgevingsfactoren (dat wil zeggen, trauma, infectie, ziekte, of letsel), microgliale dichtheid, verdeling, en morfologie worden gewijzigd op verschillende manieren, afhankelijk van de belediging. Bovendien maakt de beschreven methode voor dubbele kleuring visualisatie mogelijk van infiltrerende macrofagen in de hersenen op basis van hun expressie van IBA1 en zonder colokalisatie met TMEM119. Deze aanpak maakt het mogelijk discriminatie tussen Microglia en infiltrerende macrofagen, die nodig is om functionele inzichten in hun duidelijke betrokkenheid bij hersenen homeostase over verschillende contexten van gezondheid en ziekte te bieden. Dit protocol integreert de nieuwste bevindingen in Neuro immunologie die betrekking hebben op de identificatie van selectieve markers. Het fungeert ook als een nuttig hulpmiddel voor zowel ervaren neuro immunologen als onderzoekers die Neuro immunologie willen integreren in projecten.

Introduction

Of acute of chronische, neuro ontsteking wordt nauw beïnvloed door Microglia, de ingezeten macrofagen van de hersenen. Het visualiseren van Microglia door middel van immunokleuring is waardevol voor de studie van neuro ontsteking met het gebruik van lichte microscopie, een zeer toegankelijke techniek. In homeostatische omstandigheden worden Microglia meestal verdeeld in een niet-overlappend, mozaïek achtig patroon. Ze vertonen kleine soma's die vertakte processen uitbreiden1, die soms contact met elkaar2. Microglial vertakte processen dynamisch onderzoek van de hersen parenchym, interactie met neuronen, andere gliacellen en bloedvaten tijdens normale fysiologische omstandigheden3. Microglia zijn uitgerust met een arsenaal aan receptoren die hen in staat stellen om immunologische taken uit te voeren en te reageren op veranderingen in de hersen milieu, op celdood of op weefselbeschadiging. Bovendien, zij uitoefenen belangrijke fysiologische functies, met name in synaptische vorming, onderhoud, en eliminatie4,5.

Onder de beschikbare markers die worden gebruikt om Microglia te bestuderen, is geïoniseerde calcium bindings adapter molecuul 1 (IBA1) een van de meest gebruikte. IBA1 is een calcium bindend eiwit dat een uitzonderlijke visualisatie van microgliale morfologie biedt, inclusief fijne distale processen, zoals bevestigd door elektronenmicroscopie6. Deze tool heeft een belangrijke rol gespeeld bij het karakteriseren van microglial transformatie, voorheen "Activation" genoemd, in een breed scala aan dierziekte modellen7,8,9. In aanwezigheid van neuro ontsteking omvat de microglial respons: microgliosis die wordt gedefinieerd als een toename in cellulaire dichtheid, veranderingen in de distributie die soms resulteren in Clustering, vergroting van het cellichaam, evenals verdikking en verkorting van processen in verband met meer ameboid vormen10,11,12,13.

Immunokleuring wordt beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen gericht tegen specifieke markers. Belangrijk is dat IBA1 wordt uitgedrukt door Microglia, maar ook door perifere macrofagen die de hersenen ininfiltreren14. Terwijl observatie van IBA1-positieve cellen in de hersenen een marker van Microglia is geworden in dit onderzoeksveld, is perifere macrofaag infiltratie gemeld onder verschillende omstandigheden, zelfs marginaal in het gezonde brein15,16 ,17,18. Bijgevolg is het gebruik van IBA1 alleen niet toegestaan voor selectieve visualisatie van Microglia. Daarnaast nemen macrofagen moleculaire en morfologische kenmerken van Resident Microglia aan zodra ze de hersenen hebben geïnfiltreerd, waardoor differentiatie19wordt belemmerd. Dit vormt een uitdaging bij het onderzoeken van de functie van zowel Microglia als infiltrerende macrofagen.

Hoewel Microglia en perifere macrofagen verschillende oorzaken hebben (bijv. uit de embryonale dooierzak en het beenmerg, respectievelijk20,21), is er een toenemend aantal bevindingen waaruit blijkt dat de twee celpopulaties verschillende rollen in de hersenen19. Het is dus van cruciaal belang om methoden te gebruiken die discrimineren tussen deze twee populaties zonder invasieve manipulaties (d.w.z. beenmerg chimeras of parabiose) die hun dichtheid, verdeling, morfologie en functie kunnen moduleren. TMEM119 is ontstaan als een Microglia-specifieke marker over gezondheids-en ziekte omstandigheden22. In combinatie met IBA1, deze marker wordt nuttig voor het differentiëren van deze cellen van infiltreren macrofagen, die TMEM119-negatief en IBA1-positief zijn. Terwijl het is ontwikkelmentaal gereguleerd, TMEM119 wordt uitgedrukt zo vroeg als postnatale dagen 3 (P3) en 6 (P6), gestaag toenemen tot het bereiken van volwassen niveaus tussen P10 en P1422. IBA1 wordt uitgedrukt in embryonale dag 10,5 (E 10.5)23. Het voorgestelde dubbele etiketterings protocol is dus nuttig om deze twee populaties gedurende het hele postnatale leven te bestuderen.

Dit protocol biedt een stapsgewijze immunokleurings procedure die discriminatie tussen Microglia en perifere macrofagen mogelijk maakt. Ook wordt uitgelegd hoe u een kwantitatieve analyse van de microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals analyse van perifere macrofaag infiltratie uitvoeren. Hoewel het onderzoek naar Microglia en perifere macrofagen op zichzelf nuttig is, maakt dit protocol de lokalisatie van neuroinflammatoire Foyers mogelijk. het fungeert dus ook als een platform voor het identificeren van specifieke regio's om te onderzoeken, met het gebruik van complementaire (nog, meer tijd-en resource-verbruiken) technieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele Dierenethische comités, in overeenstemming met de Canadese Raad voor Dierverzorging en het Dierenzorg Comité van de Université Laval.

1. immunokleuring

  1. Selecteer drie muis hersen secties met de regio van belang (ROI) (dat wil zeggen, de hippocampus) met behulp van een hersen Atlas. Plaats de delen in een plastic multi-well plaat en bedek ze met 350 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (tabel 1).
    Opmerking: voor optimale resultaten moeten de hersenen worden geperfectiongebruikt met 4% Paraformaldehyde en worden gesneden tot een dikte van 50 μm met een vibratome. Voor een 24 multi-well plaat, elk goed kan maximaal zes secties te houden. Het aanbevolen volume oplossing voor elke put is 350 μL (voor maximaal drie secties) en 500 μL voor putten met zes secties. Voor een hoger aantal secties wordt aanbevolen om een 12 multi-well plaat te gebruiken. Zorg ervoor dat het geselecteerde volume van de oplossing voor elk goed volledig bedekt het weefsel en laat de secties te zweven. De aanbevolen volumes gelden voor elke oplossing die wordt gebruikt in de rest van het protocol.
  2. Was de monsters door ze te bedekken met 350 μL PBS en laat ze rusten door de multi-well plaat bovenop een multifunctionele Shaker op kamertemperatuur (RT) te plaatsen. Verwijder de PBS na 5 minuten en vervang deze 5x met verse PBS.
    Opmerking: om de oplossingen te verwijderen, wordt een pipet voor overdracht aanbevolen. Bij het gieten in een oplossing, zorg ervoor dat u het uiteinde van de pipet tegen de put muur te beschermen weefsel integriteit. Zorg er ook voor dat u voor elke nieuwe oplossing een nieuwe pipet gebruikt.
  3. Verwijder PBS en Voeg 350 μL van 10 mM Natriumcitraat buffer toe met pH = 6,0 (tabel 1).
  4. Verzegel de multi-well plaat met paraffine folie en laat deze op een eerder voorverwarmd waterbad drijven voor 40 min bij 70 °C.
  5. Laat de multi-well plaat ongeveer 15 minuten afkoelen.
  6. Verwijder de Natriumcitraat buffer en was de secties in PBS zoals gedaan in stap 1,2.
  7. Verwijder PBS en Voeg 350 μL vers gemaakte 0,1% NaBH4 (tabel 1) toe en laat 30 minuten bij RT inbroed.
  8. Verwijder de oplossing van 0,1% NaBH4 en was de secties in PBS zoals gedaan in stap 1,2.
  9. Verwijder PBS en voeg de blokkerings buffer (tabel 1) voor 1 uur toe bij RT bovenop een multifunctionele Shaker.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u de dubbele volumes van de blokkerende buffer voorbereidt, omdat dezelfde oplossing in de volgende stap wordt gebruikt.
  10. Verwijder de blokkerende buffer en vervang door een blokkerende buffer met het mengsel van primaire antilichamen (1:150 muis IBA1 + 1:300 TMEM119). Sluit het plaatje af met een paraffine laagje en laat het op 4 °C inbroed.
  11. De volgende dag, warme monsters bij RT voor ongeveer 15 minuten.
  12. Was de secties 5x voor 5 min elk in PBS met Triton (PBST) (tabel 1).
  13. Verwijder PBST en voeg blokkerende buffer met het mengsel van secundaire antilichamen (1:300 Donkey anti muis Alexa 488 voor IBA1; 1:300 geit anti-konijn Alexa 568 voor TMEM119) voor 1,5 h bij RT. vanaf dit punt, Bescherm de monsters tegen licht.
  14. Verwijder de blokkerende buffer en was de secties 5x zoals gedaan in stap 1,2, behalve deze keer met PBST.
  15. Verwijder de PBST en voeg 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) [1:20000] gedurende 5 min bij RT.
  16. Verwijder DAPI en was de secties 3x voor 5 min elk in fosfaatbuffer (PB).
  17. Monteer de secties op een Microscoop-dia. Laat ze drogen terwijl ze beschermd zijn tegen licht.
  18. Wanneer gedroogd, voeg enkele druppels van de montage fluorescentie medium en bedekken met een dekslip, het vermijden van Bubble vorming.
    Opmerking: Bewaar de dia's tegen licht, in een histologische Slide box, bij 4 °C. De monsters kunnen enkele maanden worden bewaard.

2. beeldvorming voor dichtheids-en distributie analyse

  1. Met behulp van een Widefield epifluorescentie Microscoop, gebruik een lage vergroting en de DAPI-kanaal te lokaliseren van de ROI (dat wil zeggen, de CA1-regio van de hippocampus).
  2. Verkrijg beelden bij 20x, met behulp van een numerieke diafragma (NA) van 0,5, met de DAPI, 488 en 568 kanalen en filters, bij een resolutie van 0,3 μm/pixel. Leg een mozaïekfoto vast die de ROI dekt. U ook afzonderlijke Foto's maken die worden gestikt in een grotere afbeelding.
    Opmerking: een mozaïek afbeelding is een super afbeelding die wordt gevormd door kleinere afbeeldingen. Mozaïek afbeeldingen worden meestal gebruikt om het beperkte gebied van het gezichtsveld van hoge vergroteringen te overwinnen. Sommige software bevat een mozaïek functie; Niettemin, beelden kunnen ook handmatig worden gestikt samen met andere fotobewerkingssoftware door het naaien van de afzonderlijke afbeeldingen in één. Vergeet niet de schaal gegevens aan het bestand toe te voegen. Voor dit type analyse wordt aanbevolen om ten minste 300 microglial cellen te laten afbeelgen per ROI/dier (overeenkomend met ongeveer 10 − 15 Foto's voor de hippocampus, bijvoorbeeld), met een minimum van vijf dieren per experimentele aandoening. Figuur 1A − C toont de beelden van cogelabelde Microglia.
  3. Sla de afbeelding op als een TIFF-bestand.

3. beeldvorming voor morfologie analyse

  1. Gebruik met behulp van een confocale of gestructureerde verlichtings Microscoop het DAPI-kanaal om de ROI bij een lage vergroting te vinden.
  2. Met behulp van een 40x doelstelling (dat wil zeggen, NA 1,4 olie), zoek een IBA1 +/TMEM119 + cel in de ROI. Terwijl Live Imaging, beweegt u in de Z-as. Zodra het signaal van de willekeurig geselecteerde Microglia verdwijnt, stelt u dit Z-niveau in als het begin van de Z-stack. Beweeg langs de Z-as in de tegenovergestelde richting tot het signaal van de Microglia verdwijnt en stel dat punt in als het einde van de Z-stack.
    Opmerking: afbeelding 2A − C toont beelden van IBA1 +/TMEM119 + Microglia.
  3. Maak een Z-stack in alle drie de kanalen (DAPI, 488, 568) met behulp van een 0,33 μm Z-interval en pixelgrootte van 0,15 μm/pixel. Voeg de schaal gegevens toe aan het bestand.
    Opmerking: de aanbevolen Z-interval is afhankelijk van het oplossend vermogen van de doelstelling (bijv. voor een 40x doelstelling zoals NA 1,4 olie, het is 0,33 μm). Voor de morfologie analyse wordt aanbevolen om ten minste 20 cellen per dier met een minimum van vijf dieren per experimentele aandoening te hebben.
  4. Sla het bestand op als een TIFF-bestand.

4. dichtheid en distributie analyse

  1. Open FIJI/ImageJ met de dichtstbijzijnde neighbor distance (NND) plugin geïnstalleerd. Open de 20x-afbeelding.
    Opmerking: gebruik een zoekmachine met het trefwoord "dichtstbijzijnde neighbor-afstanden berekenen met ImageJ" om de installatie-instructies te vinden. De plugin-auteur is Yuxiong Mao.
  2. Als u de schaal handmatig wilt instellen op basis van een schaal die op de afbeelding is afgedrukt, selecteert u het gereedschap rechte lijn (figuur 3e), plaatst u de cursor op de rand van de schaal en, terwijl u op SHIFT drukt, tekent u een lijn zo dicht mogelijk bij de schaal van de afbeelding (figuur 3i ), selecteer analyseren | Stel schaalin en voer vervolgens de juiste informatie in (figuur 3j).
    Opmerking: de schaal kan soms worden opgenomen in de metagegevens van het bestand en automatisch worden ingesteld.
  3. Afbeelding selecteren | Kleur | Maak composiet om een samengestelde afbeelding van alle kanalen te maken.
    Opmerking: tijdens het verzamelen van afbeeldingen maakt FIJI/ImageJ automatisch een samenstelling in het RGB-formaat.
  4. Selecteer in de menubalk analyseren | Stel metingen in. Controleer gebied, zwaartepunt en omtrek. Klik op het tabblad omleiden naaren selecteer het geopende bestand (figuur 3k).
  5. Ga naar afbeelding | Kleur | Channel tool om de Channel tool te openen.
    Opmerking: met dit menu kan een specifieke kleur worden uitgeschakeld. Het DAPI-kanaal kan nuttig zijn om de ROI te identificeren en om cellen te bevestigen. Het kan worden gedeactiveerd om het tellen gemakkelijker te maken.
  6. Teken een ruwe omtrek van de ROI met de FreeHand Selection Tool (figuur 3D).
  7. Schakel het selectiepenseel in door te dubbelklikken op het gereedschap Ovaal op de werkbalk en ervoor te zorgen dat het selectie penseel inschakelen is aangevinkt (figuur 3G). Deze tool wordt gebruikt om de ROI preciezer te afbakenen. Selecteer een geschikte penseelgrootte tussen 200 − 400.
  8. Pas met het selectiepenseel de omtrek aan de ROI aan. Druk op T op het toetsenbord om toe te voegen aan de ROI Manager (figuur 3l).
  9. Selecteer analyseren | Meet of druk op de M -toets en een resultatenvenster verschijnt. Kopieer en plak de resultaten in een gegevensblad en sla de informatie over het gebied op (d.w.z. het gebied van de ROI; Figuur 3R).
  10. Nadat u het gebied van de ROI hebt gekopieerd, wist u de informatie uit het resultatenvenster door erop te klikken en op de BACKSPACE -toets te drukken.
  11. Ga naar het venster ROI Manager (afbeelding 3L), klik met de rechtermuisknop op de ROI Trace, wijzig de naam zodat deze overeenkomt met de naam van de afbeelding en sla vervolgens op.
  12. Dubbelklik op het gereedschap Penseel op de werkbalk. Selecteer de zwarte kleur en een penseelgrootte van 10. Zorg ervoor dat de optie Paint of overlay is uitgeschakeld (afbeelding 3H).
  13. Plaats in het TMEM119 kanaal voorzichtig een zwarte stip in het midden van de Soma voor elke TMEM119 + Microglia. Plaats een witte stip in het midden van de cellen die niet positief zijn voor TMEM119 (om te markeren infiltreren macrofagen). Herhaal dezelfde procedure voor alle cellen die deel uitmaken van de ROI.
    Opmerking: het is belangrijk dat alle stippen (zwart en wit) zich in hetzelfde kanaal bevinden. De identiteit van het kanaal kan worden geverifieerd (rood, blauw of groen) door te kijken naar de kleur van de labels van het afbeeldingsvenster.
  14. Afbeelding selecteren | Kleur | Gesplitst kanaal. Er verschijnt een venster voor elk kanaal. Identificeer vervolgens het kanaal met de dot-annotaties en sluit de andere twee vensters.
  15. De nieuwe gesplitste kanaalafbeelding omleiden. Ga naar analyseren | Stel metingen in. Klik op het tabblad omleiden naaren selecteer de gesplitste kanaalafbeelding (figuur 3k).
  16. Afbeelding selecteren | Type | 8-bit. Ga naar afbeelding | Pas de drempel aan en selecteer deze (afbeelding 3O). Als u de drempel wilt aanpassen, schuift u de knop van de tweede balk naar links (drempelwaarde = 0) in beide staven.
    Let op: dit zal alleen de zwarte stippen op de afbeelding achterlaten, wit verschijnen.
  17. Selecteer de ROI in het venster ROI Manager. Selecteer analyseren | Analyseer het deeltje (figuur 3n). Op maat (inch ˆ 2): Schrijf 1 − 20. Houd de pixel eenheid uitgeschakeld, Controleer weergeven, samenvatten en toevoegen aan Manageren druk op OK. Het overzichtsvenster zal verschijnen en het aantal punten geven (figuur 3P). Kopieer en plak de gegevens in het gegevensblad.
  18. Selecteer plugins | Nnd. Het NND-venster zal verschijnen (figuur 3Q). Kopieer en plak alle gegevens in het gegevensblad. Elk getal vertegenwoordigt de afstand die elke Microglia naar de dichtstbijzijnde naburige Microglia heeft.
  19. Ga terug naar het drempel venster en schuif de eerste balk helemaal naar rechts (drempelwaarde = 255 in beide staven), waardoor alle witte stippen zichtbaar zijn, wit verschijnen (figuur 3m).
  20. Selecteer analyseren | Analyseer deeltje. Het overzichtsvenster met het aantal punten zal verschijnen (figuur 3P). Kopieer en plak de gegevens in het gegevensblad.
  21. Ga naar de ROI Manager Selecteer alle punten, klik met de rechtermuisknop en sla op met de naam van de afbeelding. Hiermee u alle punten in een zip-bestand opslaan (afbeelding 3l). Selecteer bestand | Opslaan alsen sla het bestand op met een naam waarmee de geanalyseerde afbeelding kan worden geïdentificeerd.
  22. Verkrijg de dichtheid van Microglia (voor elke afbeelding) door het aantal IBA1 +/TMEM119 + dubbel-positieve cellen te delen door het gebied van de ROI.
    Opmerking: de waarden voor elke foto kunnen voor elk dier worden berekend. De gegevens kunnen vervolgens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van alle dieren.
  23. Bepaal de NND door een gemiddelde per afbeelding van de NND-waarden van alle TMEM119 +-cellen te verkrijgen.
    Opmerking: de gegevens kunnen dan worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van alle dieren.
  24. Bereken de afstand index met behulp van de formule: NND2 x dichtheid.
    Opmerking: de gegevens kunnen dan worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van alle dieren. De eenheden voor deze meting zullen willekeurige eenheden zijn.
  25. Kwantiseer microglial clusters door cellen te identificeren die een NND onder 12 μm hebben.
    Notes: hier is 12 μm geselecteerd, omdat het de geschatte afstand is tussen twee direct juxtaposerende microglial cellen die elkaar raken met arboriisaties. Als er meer dan drie Microglia zijn die aan deze voorwaarde voldoen, keert u terug naar de afbeelding en controleert u of deze cellen deel uitmaken van een of meerdere clusters.
  26. Nadat u het aantal clusters hebt bevestigd, schrijft u het aantal clusters in het gegevensblad.
    Opmerking: het aantal clusters kan worden gedeeld door het ROI-gebied om de dichtheid van cellen/mm2 voor elk dier te verkrijgen. De gegevens kunnen dan worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van alle dieren.
  27. Om het percentage van perifere myeloïde celinfiltratie te bepalen, berekent u de% van IBA1 +/TMEM119-cellen over het totale aantal myeloïde cellen (TMEM119 +/IBA1 + + TMEM119-/IBA1 +) voor elk dier.
    Opmerking: de gegevens kunnen dan worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van alle dieren.

5. morfologie analyse

  1. Open FIJI/ImageJ.
  2. Open de 40x afbeelding met afbeelding J of FIJI. Selecteer een pop-upvenster verschijnt met de vraag of de afbeeldingen in een stapel moeten worden geopend. Klik op OK. Selecteer vervolgens afbeelding | Stapels | Z-project om het venster z-projectie te openen. Alle segmenten opnemen, van het eerste tot het laatste segment. Zorg ervoor dat de maximale intensiteit is geselecteerd onder projectie typeen klik op OK
  3. Klik op het nieuwe venster met het Z-project. Afbeelding selecteren | Kleuren | Gesplitste kanalen. Voer de sporen uit op de beelden van het IBA1 kanaal.
    Opmerking: de andere kanalen (TMEM119 en DAPI) kunnen tijdens de microglial-morfologie analyse open en zo nodig worden geraadpleegd.
  4. Selecteer in de menubalk analyseren | Stel metingen in. Controleer het gebied, zwaartepunt en omtrek. Selecteer op het tabblad omleiden naarhet geopende bestand (figuur 3k).
  5. Stel de schaal in zoals beschreven in stap 4,2.
  6. Om de Soma grootte in het IBA1 kanaal te meten, tekent u een ruwe omtrek van het SOMA met de FreeHand Selection Tool (figuur 3D).
  7. Schakel het selectiepenseel in door te dubbelklikken op het gereedschap Ovaal op de werkbalk, gevolgd door de optie selectiepenseel inschakelen (afbeelding 3G) in te schakelen. Selecteer een selectiepenseel grootte tussen 10 − 20 (Figuur 3b).
  8. Pas met het selectiepenseel de tracering aan om het beste bij het SOMA te passen. Inzoomen zorgt voor precisie tijdens deze stap (figuur 2I).
  9. Druk op de toets T om de Soma-Trace toe te voegen aan de ROI Manager (figuur 3l).
  10. Selecteer analyseren | Meet of druk op de M -toets. Een resultatenvenster zal verschijnen. Kopieer en plak de resultaten in een gegevensblad (afbeelding 3R).
  11. Om de informatie over het SOMA-gebied op te slaan, gaat u naar het venster ROI Manager, klikt u met de rechtermuisknop op de ROI, wijzigt u de naam zodat deze overeenkomt met de naam van de afbeelding, geeft u op dat de tracering voor Soma is en slaat u het bestand op.
  12. Om het arborization-gebied in het IBA1-kanaal te meten, klikt u op een microglial-proces uiteinde met de veelhoek selectietool, die de veelhoek vorm zal starten (figuur 3c).
  13. Volg de tips van de microglial-processen rond de Microglia door te klikken op de uiteinden van elke proces extremiteit om een veelhoek te vormen die het best het gebied vertegenwoordigt dat wordt bedekt door de microglial-arboriisaties (figuur 2D− H).
    Opmerking: Zorg ervoor dat de polygoon alle microglial proces extremiteiten verbindt. De lijnen die de veelhoek vormen, mogen nooit elkaar kruisen. Bij het klikken rond een microglial proces tip, wees voorzichtig om te voorkomen dat het snijden van een deel van het proces. Het is soms handig om extra punten toe te voegen om een proces rond te gaan. Het aantal punten dat de polygoon vormt, is niet direct gekoppeld aan het aantal distale processen en is dus niet relevant voor de studie.
  14. Als u de veelhoek wilt sluiten, klikt u op het beginpunt van de veelhoek.
  15. Druk op de toets T om de tracering toe te voegen aan de ROI Manager (figuur 3l). Selecteer analyseren | Meet of druk op de M -toets. Een resultatenvenster zal verschijnen. Kopieer en plak de resultaten in een gegevensblad (afbeelding 3R).
  16. Om de informatie over het arborization-gebied op te slaan, gaat u naar het venster ROI Manager, klikt u met de rechtermuisknop op de ROI, wijzigt u de naam zodat deze overeenkomt met de naam van de afbeelding, geeft u voor arborization op en slaat u het bestand op.
  17. Bepaal het SOMA-gebied door alle Soma-gebieden voor elk dier te middelen.
    Opmerking: de gegevens kunnen worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van alle dieren.
  18. Bepaal het arborization-gebied door alle arborization-gebieden voor elk dier te gemiddelde.
    Opmerking: de gegevens kunnen worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van alle dieren.
  19. Bereken de morfologie index met behulp van de formule Soma gebied/arborization gebied voor elke microglial cel en gemiddelde per dier.
    Opmerking: de gegevens kunnen worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van alle dieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont de co-labeling van Microglia met behulp van IBA1 en TMEM119 in een coronale sectie van de dorsale Hippocampus afgebeeld op 20x door fluorescentiemicroscopie. Een succesvolle kleuring onthult microglial cellichamen en hun fijne processen (Figuur 1A − C). Deze kleuring maakt de bepaling mogelijk van microgliale dichtheid en verdeling en identificatie van microgliale clusters (Figuur 1I) en infiltrerende macrofagen (Figuur 1F).

Figuur 2 toont IBA1 +/TMEM119 + Microglia (Figuur 2A − C) in een stapsgewijs voorbeeld van de procedure voor het traceren van microglial arborization (Figuur 2D − H), evenals een voorbeeld van de tracering van de celromp (Figuur 2I ), beide afgebeeld op 40x door confocale microscopie.

Figure 1
Figuur 1: IBA1 en TMEM119 dubbele kleuring van muis hersenweefsel voor dichtheid, distributie, clustering en perifere myeloïde celinfiltratie analyse. (A − C) Typische microglial verdeling in de hippocampus van een C57BL/6 volwassen muis. (D − F) Microglia geïdentificeerd als IBA1 +/TMEM119 + en infiltreren macrofaag geïdentificeerd als IBA1 +/TMEM119 (witte pijl) in de amygdala van een mannelijke muis. (G − I) Cluster van twee Microglia (wit vierkant) in de hippocampus van een muis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: IBA1 en TMEM119 kleuring voor microgliale morfologie analyse. (A − C) Microglia. (D − I) Stap-voor-stap voorbeeld van het traceren van de arborization met het IBA1-kanaal met behulp van het gereedschap Veelhoek in FIJI/ImageJ. (J) voorbeeld van Microglia Soma tracing met het IBA1-kanaal met behulp van de FreeHand Selection Tool in Fiji/imagej. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Fiji/ImageJ-interface en tools voor microgliale dichtheid, distributie, Clustering, morfologie en perifere myeloïde celinfiltratie analyse. (A − R) Compilatie van alle tools, menu's en Vensters die worden gebruikt voor de dichtheids-, cluster-en morfologie analyses. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Oplossingen Voorbereiding
Blokkerende buffer 0,5% gelatine + 5% natuurlijk geiten serum + 5% natuurlijk ezel serum + 0,01% Triton X-100 in TBS [0,05 M]
Citraat buffer 1,92 g citroenzuur [10 mM], 500 μL tween 20 [0,05% (v/v)], 700 mL ultrapuur water, pH = 6,0 aanpassen met NaOH [10 N], tot 1 L vullen met ultrapuur water
NaBH4 [0,01% w/w] Disolve 0,01 g NaBH4 in 10 ml ultrapuur water, moet de oplossing goed gemengd zijn. Deze oplossing creëert Bubble; Druk los door de dop na het mengen te openen
PB [100 mM] Disolve 23,48 g van na2HPO4 en 4,8 g van Nah2po4· H2O in 1 L ultrapuur water, vul dan tot 2 L, pas de pH aan = 7,4
Pbs [50 mM] Disolve 5,87 g van na2HPO4, 1,2 g van Nah2po4· H2O, 9 g NaCl in 500 ml ultrapuur water, vul tot 1 L aan met ultrapuur water, pas de pH aan = 7,4
PBST PBS + 0,01% Triton X-100
Tbs Verdun tris HCl [0,5 M] met ultrapuur water 1:10 [0,05 M], neem 1 L tris HCl [0,05 M] en voeg 8,75 g NaCl toe
Tris HCl [0,5 M] 950 mL ultrapuur water, voeg 78,8 g tris-buffer waterstofchloride toe (C4H11No3cl) Stel pH = 8 in en vul tot 1 L

Tabel 1: oplossingen die worden gebruikt voor immunokleuring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol kan worden onderverdeeld in twee kritieke onderdelen: kwaliteit van de kleuring en analyse. Als de kleuring niet optimaal is, zal het falen om microglial cellen adequaat weer te geven, waardoor de dichtheid, verdeling en morfologie metingen worden aangetast. Bovendien kan het aandeel van infiltratie perifere myeloïde cellen worden onderschat. Dit is een geoptimaliseerde versie van het kleurings protocol, maar er zijn verschillende factoren die kunnen resulteren in suboptimale afbeeldingen. Hoewel de perfusie van het dier niet is opgenomen in dit protocol, als hersen fixatie niet goed wordt uitgevoerd, zal de kwaliteit van de kleuring worden aangetast. Bovendien is voldoende perfusie vereist om te zorgen voor de afwezigheid van macrofagen in de bloedvaten die de studie kunnen verstoren.

Met betrekking tot immunokleuring, de meest kritische Details zijn de kwaliteit van buffers, blokkerende stap, juiste opslag van antilichamen, en hersenen monsterbehandeling. De juiste bereiding van buffers en de opslag ervan heeft een directe invloed op de kwaliteit van de kleuring. Tenzij anders aangegeven, kunnen sommige buffers gedurende lange perioden worden opgeslagen, maar het gebruik van een buffer die tekenen van verontreiniging vertoont, moet worden vermeden. Als buffers worden bereid dagen of weken van tevoren, de pH van elke oplossing vóór gebruik moet worden geverifieerd.

Bovendien blijft de aanwezigheid van achtergrondkleuring een van de meest voorkomende problemen met betrekking tot de immunokleuring. Achtergrondkleuring maakt het moeilijk om Microglia te analyseren, vooral hun morfologie, en daarom zal de resultaten bias. Om achtergrond te voorkomen, is het belangrijk dat de blokkerende stap correct wordt uitgevoerd. De opslagomstandigheden van de antilichamen hebben ook directe effecten op hun werkzaamheid. Het wordt geadviseerd om de opslagrichtlijnen van het bedrijf strikt te volgen en te voorkomen dat frequente ontdooien cycli worden bevroren. Ten slotte, tijdens het hele proces, is het van cruciaal belang om aandacht te besteden aan de fysieke integriteit van de hersen secties. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn tijdens elke manipulatie (buffer veranderingen, wast en montage), vooral als de experimenteur niet met deze procedure wordt ervaren. Het is aangeraden om te voorkomen dat de monsters zonder vloeibare oplossing bij het veranderen van oplossingen of buffers, oplossingen voor de volgende stap moet klaar zijn om te gieten in de goed vooraf. De multi-well plaat moet tijdens de nachtelijke stap correct met paraffine folie worden verzegeld om verdamping te voorkomen die de monsters kan laten drogen.

Kwantitatieve analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie heeft verschillende voordelen ten opzichte van kwalitatieve rapporten. Om bias te voorkomen, moet de onderzoeker die de analyse uitvoert geblindeerd worden tot de experimentele aandoening. Daarom wordt gesuggereerd dat verschillende mensen de analyse uitvoeren en de naam van de bestanden wijzigen (terwijl de oorspronkelijke en nieuwe namen in een sleutelblad blijven). De nieuwe namen moeten geen hints hebben van de experimentele toestand. De volledige analyse kan worden gedaan op deze geblindeerde bestanden, en de oorspronkelijke afbeelding identiteit wordt onthuld pas na de compilatie van gegevens en voorafgaand aan statistische analyse. Hoewel blindering al wordt beoefend door ervaren onderzoekers, blijft het waardevol advies voor diegenen die dit type analyse voor de eerste keer uitvoeren.

Controle voor de hersenen regio wordt gedaan tijdens de hersenen sectie selectie en tracering van de ROI tijdens de analyse. Zorg ervoor dat u secties uit hetzelfde bereik van Bregma-niveaus voor dieren gebruikt. Dezelfde ROI moet worden gebruikt voor de dichtheid, distributie, en morfologie analyses. Voor dichtheids-en distributie analyses is het bijzonder belangrijk om nauwkeurig te zijn bij het tekenen van de ROI in FIJI/image J. Het gebruik van een hersen Atlas wordt sterk aanbevolen voor zowel sectie selectie als ROI tracing. Het gebruik van DAPI vergemakkelijkt ook de identificatie van neuroanatomische bezienswaardigheden. Om variantie te voorkomen, wordt het aanbevolen om Microglia die zich slechts gedeeltelijk in de ROI bevinden, af te wijzen, omdat ze kunnen verschillen tussen hun micro-omgeving. Bij het markeren van Microglia voor dichtheids analyse kan het DAPI-kanaal worden gebruikt als een selectiecriterium. Door alleen Microglia te tellen die DAPI-bevlekt kernen bevatten, zijn alle overwogen Microglia in hetzelfde vlak, waardoor de persoonlijke bias tijdens de selectie wordt verminderd.

Aangezien metingen voor de NND, Spacing-index en clusteranalyse zijn gebaseerd op de locaties van stippen die afzonderlijke cellen markeren, en aangezien de afstanden worden berekend door FIJI/ImageJ, is het belangrijk om consistent te zijn bij het plaatsen van deze stippen. Zorg ervoor dat u de stippen in het midden van het cellichaam strikt plaatst, die visueel wordt bepaald. Bovendien moet de grootte van de stippen consistent blijven tijdens de analyse. Dit zal bijdragen tot een betere representatie van de ruimtelijke verdeling van de microgliale populatie. Voor clusteranalyse werd 12 μm geselecteerd als een afstands drempel op basis van onze eerdere analyses. Niettemin, als er vier of meer verschillende cellen met een NND onder 12 μm, al deze cellen kunnen deel uitmaken van een enkel cluster of vertegenwoordigen twee clusters van twee cellen. Dit maakte het noodzakelijk om terug te keren naar de beelden en bevestig het werkelijke aantal clusters.

In tegenstelling tot dichtheid en distributie, waarbij de ROI wordt bepaald door neuroanatomische functies met behulp van een hersen Atlas, is de selectie van microglial cellen voor morfologie analyse gebaseerd op de mogelijkheid om de cel te analyseren. Alle cellen die kunnen worden geanalyseerd, moeten worden geselecteerd voor analyse in een Z-stack voordat ze naar een andere Z-stack gaan om selectie bias te voorkomen. Redenen voor het uitsluiten van cellen zijn onder andere problemen met de immuunkleuring of het snijden van weefsels, de verwerking (bijv. scheuren) of de montage (bijvoorbeeld Bubble-vorming). Idealiter moeten hersen secties met dergelijke problemen systematisch worden uitgesloten van beeldvorming en analyse. Het is ook belangrijk op te merken dat de kleuring voor TMEM119 en IBA1 geen overlapping van 100% vertoont (Figuur 2A − C). Omdat TMEM119 geen visualisatie van proces continuïteit (evenals IBA1) toestaat, maakt dit het moeilijk om te beoordelen waar één cel eindigt en waar een ander begint. Zo wordt de morfologie analyse gedaan met behulp van het IBA1 kanaal. Bovendien moeten alle sporen en stippen worden opgeslagen en gevisualiseerd voor toekomstige revisie, waardoor de transparantie en reproduceerbaarheid van resultaten worden vergroot.

Dit protocol biedt waardevolle informatie over Microglia en infiltrerende macrofagen. Voorbeelden van de toepassingen zijn het opsporen van tekenen van neuro ontsteking door veranderingen in Microglia in verschillende hersengebieden, het bestuderen van de anti-inflammatoire effecten van een verbinding, en het bestuderen van factoren die interfereren met de juiste functie van Microglia. Gezien het feit dat dit protocol detectie van infiltrerende macrofagen in de hersenen en differentiatie van deze cellen uit Microglia mogelijk maakt, omvatten aanvullende toepassingen: bepaling als de werving van macrofagen optreedt in een bepaalde belediging of met het gebruik van andere technieken (d.w.z. genetische hulpmiddelen), en het bevestigen en bestuderen van de gevolgen van de afwezigheid van perifere macrofagen in de hersenen tijdens belediging. Houd er rekening mee dat fluorescentiemicroscopie op zichzelf niet voldoende is om infiltratie in het hersen parenchym te bevestigen. Wanneer IBA1 +/TMEM119-cellen worden waargenomen in de buurt van de ventrikels of perivasculaire ruimte, zijn hogere ruimtelijke resolutie technieken zoals elektronenmicroscopie nodig om hun lokalisatie binnen het parenchym te bevestigen. Hoewel veranderingen in dichtheid, distributie en morfologie goede indicatoren zijn voor microglial en macrofaag rollen, is deze aanpak het meest krachtig in combinatie met functioneel onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn Nathalie Vernoux dankbaar voor haar begeleiding en assistentie bij de experimenten. Ook willen we drs. Emmanuel Planel en Serge Rivest bedanken voor respectievelijk het gebruik van hun fluorescentie-en confocale microscopen. Dit werk werd deels gefinancierd door beurzen van de Mexicaanse Raad van Wetenschappen en technologie (CONACYT; tot F. G. I), de Fondation famille-Choquette en het Centre thématique de Recherche en neurowetenschappen (CTRN; to K.P.), Fonds de recherche du Québec-Santé (naar M.B.), en Shastri Indo-Canadees Instituut (naar K.B.), evenals een ontdekking subsidie van natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC) aan M.E.T. M.E.T. houdt een Canada Research Chair (Tier II) van neuro-immune plasticiteit in gezondheid en therapie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific -
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Tags

Immunologie en infectie probleem 152 muis hersenen Microglia myeloïde cellen Neuro immunologie immunofluorescentie IBA1 TMEM119 microscopie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

González Ibanez, F., Picard,… More

González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. È. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter