פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
זהו פרוטוקול עבור הדמיה כפולה של מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים ברקמת המוח של העכבר. TMEM119 (אשר מדבקות מיקרוגלייה באופן סלקטיבי), כאשר בשילוב עם IBA1 (אשר מספק הדמיה יוצאת דופן של המבנה שלהם), מאפשר חקירה של שינויים צפיפות, הפצה, מורפולוגיה. לכמת את הפרמטרים הללו חשוב במתן תובנות לתוך התפקידים שהופעלו על ידי microglia, מקרופאגים המתמחים של המוח. בתנאים פיסיולוגיים נורמליים, מיקרוגלייה מופצים באופן קבוע בדפוס כמו פסיפס ולהציג סומה קטנה עם תהליכים מסויד. עם זאת, כתגובה לגורמים סביבתיים (קרי, טראומה, זיהום, מחלה או פציעה), צפיפות microglial, הפצה ומורפולוגיה משתנות בנימוסים שונים, בהתאם לעלבון. בנוסף, השיטה המתוארת כפולה כפולות מאפשר ויזואליזציה של הסתננות מקרופאגים במוח מבוסס על הביטוי שלהם IBA1 וללא התאמה לשפות אחרות עם TMEM119. גישה זו מאפשרת הפליה בין מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים, אשר נדרש כדי לספק תובנות תפקודית למעורבות שלהם ברורים הומאוסטזיס המוח על פני ההקשרים השונים של בריאות ומחלות. פרוטוקול זה משלב את הממצאים העדכניים ביותר נוירואימונולוגיה הנוגעת לזיהוי של סמנים סלקטיבית. הוא משמש גם כלי שימושי עבור נוירואימונוולוגים מנוסים וחוקרים המבקשים לשלב נוירואימונולוגיה לפרויקטים.
מבוא
אם אקוטי או כרוני, דלקת נוירו מושפע היטב על ידי microglia, מקרופאגים התושב של המוח. המחשה של מיקרוגלייה באמצעות כתמים חיסוני הוא בעל ערך למחקר של דלקת מוחי עם שימוש של מיקרוסקופ אור, טכניקה נגישה מאוד. בתנאים הומסטטיים, מיקרוגלייה מופצים בדרך כלל בתבנית ללא חפיפה, כמו פסיפס. הם מציגים מנות קטנות שמרחיבות את התהליכים הללו1, אשר לעיתים מגעיםאחד לשני. תהליכים מיקרוסקופיים מיקרוגליאל באופן דינמי לסקר את המוח בתוך מכימומה, אינטראקציה עם נוירונים, תאים גליה אחרים, וכלי דם במהלך מצבים פיזיולוגיים נורמליים3. Microglia מצוידים בארסנל של קולטנים המאפשרים להם לבצע משימות אימונולוגיים להגיב לשינויים בתחומי המ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהסכמה עם ההנחיות לוועדות האתיקה של בעלי החיים המוסדיים, בהתאם למועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ולוועדת הבריאות של אוניברסיטת לאוול.
1. מכתים חיסוני
- בחר שלושה סעיפים המוח העכבר המכיל את אזור הריבית (ROI) (כלומר, ההיפוקמפוס) בעזרתו של אטלס המוח. מניחים את הסעיפים בצלחת פלסטיק multi-היטב ולכסות אותם עם 350 μL של מלוחים מאגור פוספט (PBS) (טבלה 1).
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, המוח צריך להיות מוכן עם 4% פאראמפורמלדהיד ולחתוך לעובי של 50 יקרומטר עם רטט. לצלחת 24 מרבי, כל טוב יכול להכיל עד שישה חלקים. הנפח המומלץ של הפתרון עבור כל טוב הוא 350 μL (עד שלושה חלקים) ו 500 μL עבור בארות המכילות ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג את שיתוף התיוג של מיקרוגלייה באמצעות IBA1 ו TMEM119 בחלק הקורילי של ההיפוקמפוס הדו היפוב1 ב-20x על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית. מכתים מוצלח חושף את גופי התא microglial ואת התהליכים העדינים שלהם (איור 1א-ג). זה הצביעת מאפשר נחישות של צפיפות microglial והפצה זיהוי של אשכולות microglial (איור 1I) והסתננות מקרופאגים (איור 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה ניתן לחלק בשני חלקים קריטיים: איכות ההכתמים והניתוח. אם הצביעת אינו אופטימלי, הוא ייכשל לייצג תאים microglial כראוי, ובכך להשפיע על צפיפות, הפצה, ומורפולוגיה מדידות. בנוסף, הפרופורציה של תאים מיאלואיד היקפית היקפיים עלול להיות לא מזלזל. זוהי גירסה ממוטבת של פרוטוקול ההכתמים, אך ישנם מספר גורמים שעלולים לגרום לתמונות מיטביות. למרות הפרזיה של בעל החיים אינו נכלל בפרוטוקול זה, אם קיבעון המוח אינו מבוצע היטב, את איכות ההכתמים יהיה להתפשר. בנוסף, הפרזיה מספקת נדרשת כדי להבטיח את העדר מקרופאגים בתוך כלי הדם העלולים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו אסירי תודה לנטלי ורנוקס על הדרכתו ועזרתה בניסויים. בנוסף, אנו רוצים להודות לד"ר עמנואל פלאמל וסרג ' ריבסט לשימוש הקרינה הפלואורסצנטית והקונקמיקרוסקופים שלהם, בהתאמה. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מלגות מהמועצה המקסיקנית למדע וטכנולוגיה (conacyt; ל-F. G. I), fondation famille-צ'קט ומרכז תימטאקה דה רצ'רצ'ה en מדעי המוח (ctrn; כדי K.P.), כפות דה מחקר du קוויבק-סאנטא (כדי מ ב), ו שתיל הודו-קנדי המכון (כדי K.B.), כמו גם מענק דיסקברי ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (NSERC) כדי M.E.T. M.E.T. מחזיקה כסא מחקר בקנדה (Tier II) של נוירוטיקה החיסונית בריאות וטיפול.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 חמור נגד עכבר | Invitrogen / Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 עז אנטי ארנב | Invitrogen / Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well Multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| בקר סרום אלבומין | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| חומצת לימון | סיגמא-אולדריץ' | C0759-500G | |
| DAPI כתם חומצה מוצלאית | Invitrogen / Thermofisher | MP 01306 | |
| חנות | מברשת עדינה | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| ג'לטין מעור דגי מים קרים | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| מיקרוסקופ כיסוי זכוכית | פישר 1254418 | ||
| Microslides טעון חיובי | VWR | 48311-703 | |
| עכבר חד שבטי Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4· H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| סרום חמור רגיל (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| סרום עיזים רגיל (NGS) | מעבדות Jackson ImmunoResearch Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| ארנב חד שבטי אנטי-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| אמבט טלטול הדדי דגם 25 | |||
| Tris | |||
| TRS002/TRS004 | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
מקורות
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.
The name was corrected from:
Maude Bordelau
to:
Maude Bordeleau
