このプロトコルは、IBA1およびTMEM119の免疫蛍光コシャリンのための段階的なワークフローを記述し、ミクログリア密度、分布、および形態の分析に加えて、ならびにマウス脳組織における末梢骨髄細胞浸潤の分析を説明する。
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方法論記事
マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色
この記事について
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サマリー
要約
これは、ミクログリアの二重可視化とマウス脳組織におけるマクロファージへの浸潤のためのプロトコルである。TMEM119(ミクログリアに選択的にラベルを付ける)をIBA1(形態の例外的な可視化を提供する)と組み合わせることで、密度、分布、形態の変化を調査することができます。これらのパラメータを定量化することは、脳の常駐マクロファージであるミクログリアによって引き起こされる役割に関する洞察を提供する上で重要である。正常な生理学的条件下では、ミクログリアはモザイク状のパターンで定期的に分布し、ラミズプロセスを有する小さなソーマを提示する。それにもかかわらず、環境要因(すなわち、外傷、感染、疾患、または傷害)に対する応答として、微小グリア密度、分布、および形態は、侮辱に応じて様々な方法で変化する。さらに、記載された二重染色法は、IBA1の発現に基づいて脳内のマクロファージに浸潤し、TMEM119との共振を伴わずに可視化することを可能にする。このようにこのアプローチは、ミクログリアと浸潤マクロファージとの間の差別を可能にし、健康と疾患の様々な文脈にわたって脳恒常性に対する彼らの明確な関与に対する機能的な洞察を提供するために必要とされる。このプロトコルは、選択的マーカーの同定に関連する神経免疫学の最新の知見を統合する。また、経験豊富な神経免疫学者とプロジェクトに神経免疫学を統合しようとする研究者の両方のための有用なツールとして機能します。
概要
急性か慢性かにかかわらず、神経炎症はミクログリア、脳の常駐マクロファージによって密接に影響される。免疫染色を通じてミクログリアを可視化することは、光顕微鏡を用いた神経炎症の研究に役立つもので、非常にアクセスしやすい技術である。ホメオスタティック条件では、ミクログリアは通常、重なり合わないモザイク状のパターンで分布します。彼らは時々互いに接触する、ラミズされたプロセス1を拡張する小さなソマを示しています。微小グリアの突起プロセスは、正常な生理学的状態の間にニューロン、他のグリア細胞、および血管と相互作用する脳性毛腫を動的に調査する3。ミクログリアは、免疫学的タスクを実行し、脳のミリュー、細胞死、または組織損傷の変化に応答することを可能にする受容体の武器を備えています。加えて、それらは主要な生理学的機能を発揮し、特にシナプス形成、維持、および排除4、5で行う。
ミクログリアの研究に用いられる利用可能なマーカーの中でも、イオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)が最も広く用いられているものの1つである。IBA1は、電子顕微鏡6によって確認された微細遠位プロセスを含む微小....
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プロトコル
すべての実験手順は、カナダ動物ケア評議会およびラバル大学動物ケア委員会に従って、制度動物倫理委員会のガイドラインに従って行われました。
1. 免疫染色
- 脳アトラスの助けを借りて、対象領域(ROI)(海馬)を含む3つのマウス脳セクションを選択します。セクションをプラスチック製のマルチウェルプレートに入れ、350 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で覆います(表1)。
注:最適な結果を得るには、脳を4%パラホルムアルデヒドで浸透させ、ビブラートで50μmの厚さに切断する必要があります。24のマルチウェルプレートの場合、各ウェルは最大6つのセクションを保持することができます。各ウェルの推奨量は350μL(最大3つのセクションの場合)と6つのセクションを含む井戸の場合は500°Lです。セクションの数が多い場合は、12 個のマルチウェル プレートを使用することをお勧めします。各井戸の溶液の選択された容積が完全に組織を覆い、セクションが浮遊することを確認してください。推奨ボリュームは、プロトコルの残りの部分で使用されるすべてのソリューションに適用されます。 - サンプルを350°LのPBSで覆って洗浄し、多目的シェーカーの上に多目的シェーカー(RT)を置いて休ませます。5分後にPBSを取り外し、5xを新鮮なPBSに交換します。
メモ:ソリューションを削除するには、転送ピペットをお勧めします。任意の溶液に注....
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結果
図1は、蛍光顕微鏡により20x画像化された後方海馬の冠状部におけるIBA1およびTMEM119を用いたミクログリアの共標識を示す。染色が成功すると、微小グリア細胞体とその微細なプロセスが明らかになります(図1A-C)。この染色により、ミクログリア密度の測定とミクログリアクラスターの分布と同定(図1I)とマクロファージへの浸潤が可能である(図1F)。
図 2は、ミクログリアのアボリゼーション トレース手順 (図 2
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ディスカッション
このプロトコルは、染色と分析の品質という2つの重要な部分に分けることができます。染色が最適でない場合、マイクログリア細胞を適切に表現できず、密度、分布、および形態測定に影響を与えます。また、浸潤末末性骨髄細胞の割合は過小評価され得る。これは染色プロトコルの最適化されたバージョンですが、最適でない画像につながる可能性のあるいくつかの要因があります。動物の灌流がこのプロトコルに含まれていないとしても、脳の固定が十分に実行されない場合、染色の品質が損なわれます。さらに、研究を妨げる可能性のある血管内のマクロファージの欠如を確保するために十分な灌流が必要である。
免疫染色に関しては、最も重要な詳細は、バッファーの品質、ブロッキングステップ、抗体の適切な貯蔵、および脳サンプル処理を含む。バッファーとその貯蔵の適切な調製は、染色の品質に直接影響を与えます。指定しない限り、一部のバッファーは長期間保存できますが、汚染の兆候を示すバッファーの使用は避ける必要があります。バッファーが数日前または数週間前に準備されている場合は、使用前のすべてのソリューションの pH を検証する必要があります。
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
ナタリー・ヴェルヌーの指導と実験への支援に感謝しています。また、エマニュエル・プラネル博士とセルジュ・リヴェスト博士の蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡の使用に感謝申し上げたい。この作品の一部は、メキシコ科学技術評議会(CONACYT;to F.G.I)、フォンダシオン・ファミーユ・チョケット、センター・テマティック・ド・レッシェルシュ・エン・ニューロサイエンス(CTRN;to K.P.)、フォン・ド・レッシェルシュ・デュ・ケベック-サンテ(M.B.)の奨学金によって資金提供されました。シャストリ・インド・カナダ研究所(K.B.へ)のほか、カナダ自然科学・工学研究評議会(NSERC)からM.E.T.M.E.T.へのディスカバリー・グラントは、カナダの健康と治療における神経可塑性の研究委員長(Tier II)を保有しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 ロバ抗マウス | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 ヤギ抗ウサギ | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well 多皿 | Thermo Fisher | 930186 | |
| ウシ血清アルブミン | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| クエン酸 | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| ファインブラシ | アートストア | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| 冷水魚の皮からのゼラチン | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| 顕微鏡カバーガラス | フィッシャーサイエンティフィック | 1254418 | |
| マイクロスライド 正に帯電した | VWR | 48311-703 | |
| モノクローナル マウス 抗 IBA1 | ミリポア | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | バイオショップカナダ | SPM306、SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| 正常ヤギ血清(NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| ウサギモノクローナル抗TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| 相互振とうバスモデル 25 | 精密科学 | ||
| 移送ピペット | |||
| トリス緩衝塩酸塩 | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| トリトンX-100 | Σアルドリッチ | T8787 | |
| トゥイーン20 | シグマアルドリッチ | P7949-100ML |
参考文献
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al.
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.
The name was corrected from:
Maude Bordelau
to:
Maude Bordeleau
