Summary
Este manuscrito describe un protocolo detallado para el uso de imágenes por ultrasonido de alta frecuencia para medir el diámetro luminal, la velocidad de propagación del pulso, la distensibilidad y la tensión radial en un modelo de ratón de aneurisma de la aorta abdominal.
Abstract
Un aneurisma de la aorta abdominal (AAA) se define como una dilatación localizada de la aorta abdominal que supera el diámetro intraluminal máximo (MILD) en 1,5 veces de su tamaño original. Estudios clínicos y experimentales han demostrado que los pequeños aneurismas pueden romperse, mientras que una subpoblación de aneurismas grandes puede permanecer estable. Por lo tanto, además de la medición del diámetro intraluminal de la aorta, el conocimiento de los rasgos estructurales de la pared del recipiente puede proporcionar información importante para evaluar la estabilidad de la AAA. El endurecimiento aórtico ha surgido recientemente como una herramienta confiable para determinar los primeros cambios en la pared vascular. La velocidad de propagación del pulso (VPP) junto con la distensibilidad y la tensión radial son métodos altamente útiles basados en ultrasonidos relevantes para evaluar la rigidez aórtica. El objetivo principal de este protocolo es proporcionar una técnica integral para el uso del sistema de imágenes por ultrasonido para adquirir imágenes y analizar las propiedades estructurales y funcionales de la aorta según lo determinado por MILD, PPV, distensibilidad y tensión radial.
Introduction
Un aneurisma de la aorta abdominal (AAA) representa una enfermedad cardiovascular significativa caracterizada por una dilatación localizada permanente de la aorta que supera el diámetro del vaso original en 1,5 veces1. AAA se encuentra entre las 13 principales causas de mortalidad en los Estados Unidos2. La progresión de la AAA se atribuye a la degeneración de la pared aórtica y la fragmentación de la elastina, lo que en última instancia conduce a la ruptura aórtica. Estos cambios en la pared aórtica pueden ocurrir sin un aumento significativo en el diámetro intraluminal máximo (MILD), lo que sugiere que MILD por sí solo no es suficiente para predecir la gravedad de la enfermedad3. Por lo tanto, es necesario identificar factores adicionales para detectar cambios iniciales en la pared aórtica, que pueden guiar las opciones de tratamiento temprano. El objetivo general de este protocolo es proporcionar una guía práctica para evaluar las propiedades funcionales aórticas utilizando imágenes por ultrasonido caracterizadas por mediciones de la velocidad de propagación del pulso (PPV), la distensibilidad y la tensión radial.
Un modelo experimental bien caracterizado para estudiar AAA, descrito por primera vez por Daugherty y sus colegas, implica la infusión subcutánea de angiotensina II (AngII) a través de bombas osmóticas en Apoe-/- ratones4. La medición precisa de MILD mediante imágenes por ultrasonido ha sido fundamental para caracterizar AAA en este modelo de ratón5. Aunque los cambios histológicos durante el desarrollo de AAA han sido ampliamente estudiados, los cambios en las propiedades funcionales de la pared del recipiente como la rigidez aórtica no se han caracterizado bien. Este protocolo hace hincapié en el uso de ultrasonidos de alta frecuencia en combinación con los sofisticados análisis como potentes herramientas para estudiar la progresión temporal de AAA. Específicamente, estos enfoques nos permiten evaluar las propiedades funcionales de la pared del recipiente medida por PPV, distensibilidad y deformación radial.
Estudios clínicos recientes en seres humanos con AAA, así como en el modelo AAA inducido por el aslastasa murina, sugieren una correlación positiva entre rigidez aórtica y diámetro aórtico6,7. El PPV, un indicador de rigidez aórtica, se acepta como una excelente medición para cuantificar los cambios en la rigidez en la pared del recipiente6,8. El VPP se calcula midiendo el tiempo de tránsito de la forma de onda del pulso en dos sitios a lo largo de la vasculatura, proporcionando así una evaluación regional de la rigidez aórtica. Recientemente hemos demostrado que el aumento de la rigidez aórtica medida por el VPP, y a nivel celular según se determina mediante la microscopía de fuerza atómica, se correlaciona positivamente con el desarrollo del aneurisma9. Además, la literatura sugiere que la rigidez aórtica puede preceder a la dilatación aneurisma y por lo tanto puede proporcionar información útil sobre las propiedades intrínsecas regionales de la pared del recipiente durante el desarrollo de AAA10. Del mismo modo, las mediciones de distensibilidad y deformación unitaria son las herramientas de cuantificación para medir los cambios anteriores de la aptitud arterial. Las arterias sanas son flexibles y elásticas, mientras que con mayor rigidez y menos elasticidad, se reduce la distensibilidad y la tensión. Aquí, proporcionamos una guía práctica y un protocolo paso a paso para el uso de un sistema de ultrasonido de alta frecuencia para medir MILD, PPV, distensibilidad y tensión radial en ratones. El protocolo proporciona enfoques técnicos que deben utilizarse junto con la información básica proporcionada por los manuales para instrumentos de imágenes de ultrasonido específicos y el tutorial de vídeo adjunto. Es importante destacar que en nuestras manos el protocolo de imagen descrito proporciona datos reproducibles y precisos que parecen valiosos en el estudio del desarrollo y progresión de la AAA experimental.
Para demostrar aún más la utilidad de las imágenes por ultrasonido, proporcionamos imágenes de ejemplo y mediciones tomadas de nuestros propios estudios destinados al uso de enfoques farmacológicos para prevenir la AAAexperimental 11. Específicamente, se ha propuesto que la señalización de muesca participe en múltiples aspectos del desarrollo vascular y la inflamación12. Utilizando haploinización genética y enfoques farmacológicos, hemos demostrado previamente que la inhibición de la muesca reduce el desarrollo de AAA en ratones al prevenir la infiltración de macrófagos en el lugar de la lesión vascular13,14,15. Para el artículo actual, utilizando el enfoque farmacológico para la inhibición de la muesca nos centramos en la relación entre la rigidez aórtica y los factores relacionados con AAA. Estos estudios ilustran que la inhibición de la muesca reduce la rigidez aórtica, que es una medida de la progresión AAA11.
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Protocol
El protocolo para el manejo de ratones e imágenes por ultrasonido fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri (protocolo animal número 8799) y se llevó a cabo de acuerdo con AAALAC International.
1. Configuración y preparación de equipos de ratones
- Configuración del equipo
- Encienda el instrumento de ultrasonido, el calentador de gel ultrasónico y la almohadilla de calentamiento.
- Abra el programa de ultrasonido e introduzca el nombre del estudio y la información descriptiva para cada ratón.
- Seleccione la aplicación como Imágenes generales.
- Elija el transductor adecuado para la toma de imágenesabdominales (Figura 1B,C). En este experimento, se utiliza el transductor MS400.
- Asegúrese de que la anestesia isoflurano y los niveles de oxígeno sean adecuados para cada sesión experimental.
- Limpie la plataforma de imágenes de animales de ultrasonido.
- Preparación del ratón
- Coloque la jaula del ratón encima de una almohadilla de calentamiento (36,5 a 38,5 oC).
- Sujete suavemente el ratón por su base de cola y colóquelo en la cámara de isoflurano llena de oxígeno.
- Dirija el flujo de isoflurano y oxígeno a la cámara de inducción.
- Encienda el vaporizador de isoflurano y ajuste el nivel de isoflurano a 1-2% vol/vol. Encienda la presión del tanque de oxígeno a 1-2 L/min.
- Después de 2 min, confirme la profundidad adecuada de la anestesia por la ausencia de reflejos de abstinencia al pellizcar la almohadilla del pie del ratón.
- A continuación, apague la rama de suministro de la cámara de inducción y encienda la rama dirigida al cono nasal de anestesia.
- Transfiera el ratón de la cámara de inducción a la etapa de imágenes por ultrasonido y coloque el cono de anestesia sobre la nariz del animal.
- Incline la plataforma de imágenes de animales alrededor de 10o a la esquina inferior derecha para un escaneo óptimo(Figura 1B).
- Ponga una gota de solución oftálmica estéril en ambos ojos de ratones para evitar el secado bajo anestesia.
- Coloque el ratón en posición supina con la nariz insertada en el cono de anestesia.
- Aplique el gel de electrodo a las cuatro patas usando un hisopo de algodón y pegue las patas a los cables de cobre en la plataforma de imágenes de animales para lecturas de electrocardiogramas(Figura 1C).
- Use cortadoras para afeitar el cabello en el sitio de imágenes y luego aplique crema depilatoria para eliminar el pelaje restante. Dejar actuar durante menos de 1 min.
- Limpie suavemente la crema y el cabello con una toalla de papel húmeda.
- Supervise la respiración y asegúrese de que la frecuencia cardíaca se mantenga entre 450-550 latidos/min. Si está por debajo de este nivel, reduzca el flujo de isoflurano y espere hasta que la frecuencia cardíaca se recupere.
- Aplicar gel ultrasónico precalentado (37 oC) en el sitio de la piel preparado y fijar el transductor a su soporte y bajar hacia abajo hasta que toque el gel(Figura 1C).
2. Imágenes por ultrasonido de la aorta abdominal
- Coloque el transductor horizontalmente (es decir, perpendicular a la línea media del ratón).
- Suaviza el gel ultrasónico y elimina las burbujas usando el palo de madera de un hisopo de algodón.
- Baje el transductor y coloque 0,5 - 1 cm por debajo del diafragma después de tocar el gel. Ahora empieza a observar las imágenes.
- Visualice la aorta abdominal en la vista de eje corto(Figura 1C).
NOTA: El modo B es el modo predeterminado y más eficaz para localizar anatómicamente la aorta y colocar el transductor. La aorta abdominal se identifica por la presencia de flujo pulsátil utilizando los modos Doppler de color y Doppler de potencia en el eje corto (es decir, la sección transversal circunferencial de la aorta). Ajuste los micromanipuladores en el escenario animal y el transductor para llevar la sección transversal de la aorta al centro de la imagen. - Gire suavemente el transductor 90o en el sentido de las agujas del reloj y ajuste lentamente la perilla del micromanipulador del eje X para visualizar la aorta en la vista de eje largo (sección longitudinal de la aorta).
NOTA: En muchos casos, los gases gastrointestinales pueden interferir con la imagen, o la aorta puede no estar en el ángulo óptimo para permitir una vista clara del eje largo. Ajuste el ángulo del transductor lenta y horizontalmente hasta obtener una vista de eje largo aceptable. Si los problemas persisten, eleve el transductor, compruebe si hay burbujas de aire debajo del transductor, ajuste ligeramente el ángulo de inclinación de la etapa animal, vuelva a aplicar los geles y repita todos los pasos de nuevo. - Establezca la zona de enfoque y la profundidad en la región de la aorta mediante las alternancias Zona de enfoque y Profundidad de enfoque, respectivamente. Ajuste el control deslizante de compensación de ganancia de tiempo manualmente para oscurecer el lumen de la aorta para lograr un contraste óptimo de la pared de la aorta.
- Ajuste el manipulador del eje Y para visualizar los puntos de ramificación de las arterias renales superiores y derechas. Utilice la arteria renal derecha como punto de referencia para capturar la imagen de la aorta suprarrenal(Figura 2A).
- Grabe al menos 100 fotogramas de imágenes en modo B en la aorta suprarrenal.
- Pulse cinestore para guardar las imágenes en modo B.
- Pulse el botón de modo M en el teclado del instrumento para activar la grabación en modo M. Enrolle la bola del cursor para llevar la línea indicadora amarilla a una sección aorta normal con una imagen clara de la pared del recipiente, o a las secciones donde se observa el diámetro máximo del aneurisma.
- Presione el interruptor SV/gate y ajuste la bola del cursor para asegurarse de que las paredes del recipiente están incluidas en el soporte de medición. Pulse Actualizar para grabar mediciones en modo M y pulse cinestore para capturar(Figura 2A,B).
NOTA: Es posible que el diámetro máximo del aneurisma no esté en el mismo plano de imagen que la vista óptima del eje largo de la aorta. Ajuste ligeramente la perilla del manipulador del eje X para cada medición en modo M para asegurarse de que se captura el MILD de cada sección. - Para obtener imágenes de la visualización de Kilohertz (EKV) cerradas por ECG, pulse el botón de modo B para volver a la grabación en modo B.
NOTA: Si las imágenes no son nítidas, ajuste el manipulador del eje X para lograr la imagen más nítida de la pared superior del lumen sobre una longitud de sección (es decir, > 6 mm). - Pulse el botón Physio Settings (Ajustes físicos) en el teclado y seleccione Respiration Gating. Ajuste el retardo de gating y la ventana manualmente para registrar los datos solo durante las partes más planas de la onda de respiración. Las secciones de grabación se mostrarán como bloques de color en el trazado de la onda de respiración.
NOTA: Sin el ajuste de la respiración, las imágenes EKV se desenfocarán debido al movimiento normal del animal durante la respiración. - Pulse el botón EKV para activar el modo EKV. En el menú correspondiente, seleccione Resolución estándar y velocidad de fotogramas 3000 o superior. Seleccione continuar para grabar imágenes EKV. Pulse cinestore para guardar las imágenes. Utilice la imagen en modo EKV para obtener mediciones de la velocidad de propagación del pulso (PPV), la distensibilidad y la tensión radial.
NOTA: La grabación de EKV puede fallar si hay fluctuaciones anormales en la respiración, el animal está respirando demasiado rápido o los ajustes de las velocidades de fotogramas son demasiado altos. En esos casos, establezca la velocidad de fotogramas más baja y espere a que la respiración animal se estabilice. Establecer la velocidad de fotogramas en 3000 suele ser adecuado tanto para ratones como para ratas.
3. Pasos posteriores a la toma de imágenes
- Limpie suavemente el gel ultrasónico de la zona abdominal del ratón con una toalla de papel humedecida con agua tibia.
- Coloque el ratón de nuevo en su jaula de casa en una almohadilla de calefacción.
- Apague la máquina de isoflurano, limpie la plataforma de imágenes de animales y el transductor con toallitas húmedas.
- Transfiera los datos de imagen recopilados durante la ecografía al disco duro.
- Apague el instrumento de ultrasonido.
- Después de que el ratón se recupere de la anestesia y esté alerta, retire la almohadilla de calentamiento y devuelva la jaula al estante de la carcasa del animal.
4. Análisis de imágenes de la aórtica abdominal
- Análisis de imágenes en modo M para medir MILD
- Abra el programa de ultrasonido e introduzca el nombre del estudio y la información descriptiva para cada ratón.
- Abra los datos de ultrasonido en el software de análisis y abra la imagen en modo M y detenga el latido del corazón.
- Haga clic en Medidas.
- Seleccione el paquete vascular en las opciones desplegables. Haga clic en Profundidad y dibuje una línea a través del lumen aórtico que se extiende desde la pared interior hasta la pared(Figura 2C,D).
NOTA: Para la consistencia, las mediciones deben tomarse en la fase sistólica del ciclo cardíaco cuando la aorta se expande al máximo. Dibuje tres líneas a través de tres latidos diferentes para obtener mediciones precisas y medias de MILD. En AAA, las mediciones se toman a la dilatación máxima de la aorta. También es aconsejable ayunar los animales 4-6 h antes de recoger imágenes para evitar interferencias de la motilidad intestinal y garantizar la claridad de la imagen.
- Análisis de la velocidad de propagación del pulso (PPV)
- Abra la imagen EKV y detenga el latido del corazón.
- Abra una nueva ventana en el software de análisis (por ejemplo, Vevo Vac) haciendo clic en el icono de nombre.
- Haga clic en la opción PPV (flecha en el cuadro 3D). Una pequeña ventana aparecerá con la imagen de la aorta.
- Dibuje una caja rectangular haciendo clic en la pared superior del recipiente y arrastrando el puntero durante unos 4 mm cubriendo ambas paredes de la aorta suprarrenal.
NOTA: Mantenga la longitud de la caja consistente (4 mm) para todas las imágenes. El usuario puede ajustar el cuadro rectangular girando para alinear la caja y seleccionando la línea y luego arrastrando a una nueva posición en el recipiente que se está analizando para obtener la inflexión más adecuada y clara de la onda de pulso. Las líneas verticales de datos del rectángulo se mostrarán e identificarán como izquierda (imagen superior) y derecha (imagen inferior) en el ROI. Para una mejor visualización de la inflexión de la onda de pulso, a veces es útil para el cuadro de dibujo sólo en la pared superior como se muestra en la Figura 3. El software calculará automáticamente el PPV (m/s). Sin embargo, siempre es mejor ajustar manualmente las líneas púrpuras para establecer el punto de inflexión exacto en las ondas de pulso y el PPV cambiará en consecuencia. - Por último, seleccione el comando Aceptar para guardar los valores PPV. Exporte las cifras y los datos a la unidad de almacenamiento de datos.
- Análisis de distensibilidad y deformación radial
- Abra la imagen EKV y detenga el latido del corazón.
- Haga clic en el icono del software. El software abrirá una nueva ventana.
- Haga clic en el nuevo ROI de traza y dibuje una caja rectangular en las dos paredes del buque. El software rastreará automáticamente las paredes superior e inferior del recipiente. El usuario puede ajustar el trazado para alinearen en la pared haciendo clic en puntos verdes(Figura 4A,B).
- Ahora acepte el rastreo. El software calculará la distensibilidad (1/Mpa) en el ROI seleccionado.
- Para la medición de deformación unitaria radial, seleccione la opción de deformación unitaria adecuada en las barras de menú de la parte superior izquierda. Se abrirán las imágenes de la deformación radial y la deformación tangencial tangencial.
- Obtener el valor de la deformación radial (%) moviendo el cursor en el pico de la curva. Exporte los datos como imágenes o en formato de vídeo(Figura 4A,B).
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Representative Results
Las imágenes representativas en modo M de la aorta abdominal normal y aneurisma de ratones se muestran en la Figura 2A y la Figura 2B,respectivamente. La aorta abdominal suprarrenal se identifica por su ubicación junto a la arteria renal derecha y la arteria mesentérica superior(Figura 2A). Las imágenes representativas utilizadas para el cálculo de MILD, en tres latidos cardíacos diferentes del ciclo cardíaco sistólico, en aorta normal y aneurisma se muestran en la Figura 2C,D respectivamente. En la situación en la que se ha desarrollado un aneurisma aórtico, el diámetro luminal se determina dibujando una línea amarilla perpendicular entre los dos bordes internos del lumen en el área de dilatación máxima(Figura 2B). Por lo general, se promedian tres mediciones independientes para determinar un diámetro intraluminal preciso.
Las imágenes representativas de EKV de la aorta abdominal utilizada en el análisis de PPV se muestran en la Figura 3. El PPV se calcula dibujando una caja rectangular en la pared luminal de la aorta suprarrenal(Figura 3E)y el ajuste de las líneas verticales púrpuras de los datos obtenidos de la caja rectangular(Figura 3F). Las líneas púrpuras deben ajustarse para establecer el punto de inflexión de las ondas de pulso. En la Figura 4se muestran imágenes representativas de EKV de la aorta abdominal adecuadas para el análisis de la distensibilidad y las deformaciones radiales. La distensibilidad y la deformación radial se calculan trazando las paredes luminosas de la aorta suprarrenal como se muestra en la Figura 4E. El valor de distensibilidad (1/MPa) se obtiene eligiendo la opción de distensibilidad/elasticidad del menú desplegable del cuadro (flecha roja, Figura 4F). La tensión radial (%) se obtiene eligiendo la opción de deformación unitaria radial(Figura 4G)y moviendo el cursor al pico del gráfico de deformación unitaria radial(Figura 4H).
Hemos validado la importancia del VPP en el modelo de ratón inducido por AngII de AAA y hemos examinado más a fondo el potencial terapéutico de un inhibidor de la muesca (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-fenilglicina t-butilo éster; DAPT) sobre la progresión y estabilidad de la AAA preestablecida. Concretamente, todos estos estudios de aneurisma se realizaron en 8-10 semanas de edad Apoe-/- ratones macho tras la perfusión de AngII por protocolos publicados4,13. En el día 28 de la perfusión de AngII, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos y se les administró vehículo o DAPT (10 mg/kg) hasta el sacrificio en el día 5613. Las imágenes por ultrasonido transabdominal mostraron un aumento progresivo en el MILD, el VPP y una disminución de la distensibilidad y la tensión radial en respuesta a AngII en el día 28(Figura 5A-E). La perfusión de Angii aumentó marginalmente MILD desde el día 28 hasta el 56 y DAPT no cambió significativamente MILD en comparación con AngII solo(Figura 5A y Figura 5B). Sin embargo, el VPP aumentó progresivamente con la perfusión de AngII desde el día 28 hasta el día 56 y DAPT disminuyó significativamente los aumentos adicionales de la VPP en el día 56(Figura 5C). La distensibilidad y las deformaciones radiales, los parámetros para evaluar la elasticidad de la pared del recipiente se redujeron con la perfusión de AngII, mientras que DAPT no mostró ningún efecto significativo(Figura 5D y 5E). Es importante apreciar que el PWV se correlacionó fuertemente con MILD en el día 28 (R2a 0,51, Figura 5F), mientras que en el día 56, la correlación era relativamente débil (R2x 0,22)(Figura 5G). La rigidez aórtica en AAA se asocia principalmente con cambios en la arquitectura de muros aórticos. Histológicamente, la infusión de AngII aumentó la degradación del colágeno y la actividad proteolítica en la capa medial de la aorta(Figura 5H, fila superior). El tratamiento DAPT minimiza batusa estos cambios en la degradación de ECM(Figura 5H, fila inferior).
Figura 1: Configuración del instrumento. (A) Vista general de la máquina de ultrasonido junto con la cámara de inducción para anestesia y gel más caliente. (B) Vista de primer plano de la plataforma de imágenes y del sistema de transductores. (C) La vista de la colocación del transductor mientras se captura la imagen de eje corto de la aorta abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de imágenes en modo M para obtener el diámetro intraluminal máximo (MILD). Se muestran las imágenes en modo M de la aorta normal (A) y la aorta con aneurisma de la aorta abdominal(B) de ratones. (C) y (D), MILD dibujado en fase sistólica del ciclo cardíaco en la aorta suprarrenal de ratones normales (C) y ratones con AAA (D). Las mediciones en tres latidos diferentes se toman como se muestra y se calcula el valor promedio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de imágenes EKV para obtener la velocidad de propagación del pulso (PPV). Imágenes EKV recogidas de la aorta normal del ratón. El análisis se realiza haciendo clic en las mediciones (A) y el icono de software (B). Aparecerá una nueva ventana con los iconos en el lado derecho, como se muestra en C. Ahora, haga clic en PPV (D) y de nuevo, aparecerá una pequeña ventana (E). Dibuje un cuadro rectangular en la pared superior del lumen como se muestra en E y haga clic en Aceptar. El valor PPV se obtendrá como se muestra en F (flecha). Las líneas púrpuras se ajustan para establecer el punto de inflexión de las ondas de pulso (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medición de la distensibilidad y la deformación radial. Imágenes EKV recogidas de la aorta normal del ratón. El análisis se realiza haciendo clic en las mediciones (A) y el icono de software (B). Aparecerá una nueva ventana con los iconos en el lado derecho, como se muestra en C. Ahora, haga clic en trace new ROI (D), aparecerá una nueva ventana con trazas en la pared superior e inferior del lumen como se muestra en E y haga clic en aceptar. El valor de distensibilidad se obtendrá en la tabla como se muestra en la F. Para la deformación unitaria, haga clic en deformación unitaria (G). La ventana mostrará el valor de deformación unitaria radial (%, verde resaltado), ya que el cursor se coloca en el pico del gráfico de deformación unitaria radial (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: PPV se correlaciona con los rasgos estructurales de la aorta en la AAA establecida. (A) Imágenes representativas de ultrasonido transabdominal que muestren el MILD en los días 0, 28, 42 y 56 de los grupos experimentales indicados en ratones Apoe-/-. DAPT se inició en el día 28. Las líneas amarillas punteadas delinean el lumen. (B) La cuantificación de MILD en los grupos indicados (el color púrpura y verde muestra AngII + vehículo y los ratones tratados AngII + DAPT respectivamente (n-16-18). (C, D y E) PPV, distensibilidad y tensión radial en varios días de tratamientos AngII y DAPT (n-8). (F y G), Gráficos que muestran la correlación de Pearson entre PPV y MILD en el día 28 (F) y el día 56 (G). (H) Imágenes histológicas representativas para la tinción de colágeno (manchada con tricromo y vista como tinción azul) y actividad proteolítica por zimografía in situ con o sin tratamiento DAPT en el día 56. Para el análisis de datos se utilizó la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. *P<0.05; ns - no significativo. Escala 50 m en H. Esta cifra está adaptada de Sharma et al. (2019), Scientifc Reports (SREP-19-16491B)11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las imágenes por ultrasonido proporcionan una técnica poderosa para determinar las propiedades funcionales de la aorta a través de mediciones de PPV, distensibilidad y tensión radial. Estas mediciones son particularmente instructivas para el estudio de los modelos de ratón de AAA y el enfoque in vivo permite la recopilación de datos longitudinales que son potencialmente importantes para entender el desarrollo temporal de la patología aórtica. Específicamente, las mediciones de rigidez aórtica in vivo se determinan localmente en la aorta abdominal por PPV, distensibilidad y deformación radial mediante el análisis de datos EKV y se consideran como un factor de riesgo independiente para la inestabilidad AAA16. Las técnicas descritas en estos protocolos son relativamente rectas y tardan sólo 8-10 minutos en obtener conjuntos de imágenes de un ratón. Todas las imágenes deben ser recogidas preferentemente por un solo operador utilizando puntos de referencia bien definidos y coherentes para generar datos reproducibles y precisos.
Existen factores potenciales que requieren experiencia técnica para las aplicaciones de estas herramientas. Por ejemplo, en primer lugar, el VPP no puede reflejar únicamente el grado de desarrollo de AAA en la pared arterial local porque es una medida indirecta de rigidez arterial regional. En segundo lugar, puede ser difícil medir con precisión el VPP si la pared intimal está dañada. En tercer lugar, puede ser difícil obtener imágenes de resolución nítida sin experiencia en el funcionamiento del instrumento. Algunas de estas preocupaciones se han abordado en versiones recientes de sistemas de imágenes por ultrasonido donde se reduce el ruido de motas y los artefactos, preservando y mejorando la adquisición de datos para estudios con animales pequeños.
El enfoque de las técnicas utilizadas en el pasado (Doppler, microangiografía, imágenes por resonancia magnética) para determinar la rigidez aórtica se limitó a imágenes bidimensionales. El VPP calculado a partir de la imagen por ultrasonido ha estado emergiendo como un método fiable y reproducible para determinar la rigidez aórtica y parece ser independiente de la presión arterial9,17. Es importante tener en cuenta que la definición predominante de AAA utilizando el diámetro máximo como índice estándar no siempre se correlaciona de forma fiable con las observaciones clínicas. Por ejemplo, los aneurismas pequeños pueden romperse mientras que algunos aneurismas grandes tienden a permanecer estables18,19,20. El endurecimiento aórtico es un cambio temprano que genera estrés de pared aórtica que desencadena un crecimiento aneurisma, y la remodelación10 y se ha correlacionado fuertemente con Mmp2 y Mmp9 en modelos de ratón de AAA10. Por lo tanto, además del diámetro de la aorta, los análisis funcionales pueden proporcionar información importante para evaluar la progresión y estabilidad de la AAA.
Usando estos protocolos, hemos examinado el potencial terapéutico de un potente inhibidor farmacológico de la muesca (2S-N-[(3,5-Difluorofenil) acetil]-L-aanyl-2-fenilglicina 1,1-dimetiletilo éster; DAPT) sobre la progresión y estabilidad de la AAA preestablecida utilizando un modelo de ratón inducido por AngII de AAA11. Las imágenes por ultrasonido transabdominal mostraron un aumento progresivo en el MILD, EL PWV y una disminución de la distensibilidad y la tensión radial en los ratones Apoe-/- en respuesta a AngII que los controles del día 28. No se observó ningún aumento adicional en MILD más allá del día 28 hasta el día 56(Figura 5). Sin embargo, el VPP aumentó progresivamente y fue significativamente mayor en el día 56 en comparación con el día 28. Con la inhibición de la señalización de Notch por DAPT, los ratones MILD no fue significativamente diferente de AngII solo en el día 56. Curiosamente, DAPT impidió un mayor aumento de la VPP de tal manera que fuera significativamente menor que AngII en el día 56(Figura 5C). El tratamiento con DAPT no afectó significativamente a la distensibilidad ni a la deformación radial(Figura 5D,E). Curiosamente, el PPV se correlacionó fuertemente con MILD en el día 28 (R2x 0,51), mientras que en el día 56, la correlación era relativamente débil (R2x 0,22; Figura 5F). Estos cambios en la rigidez aórtica se reflejaron en el aumento de la degradación del colágeno y la actividad proteolítica con AngII y la atenuación por DAPT (Figura 5H). Este estudio de ejemplo destaca el valor potencial de las medidas de rigidez aórtica basadas en ultrasonidos para comprender el curso de tiempo y la previsibilidad tanto de la progresión aAA como de la estabilidad.
Además, el enfoque basado en ultrasonidos parece valioso para evaluar el papel potencial de las intervenciones farmacológicas, particularmente en etapas que probablemente sean independientes de los cambios en el diámetro intraluminal (es decir, más allá de la expectativa de regresión). En resumen, la comprensión detallada y el uso de dicha tecnología se beneficiarán en la evaluación del pronóstico de AAA en una etapa temprana de la enfermedad para intervenciones terapéuticas eficaces.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por R01HL124155 (CPH) y la financiación del Instituto de Investigación de la Universidad de Missouri a CPH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
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