Summary
介绍了一种记录自由游泳金鱼大脑细胞外神经信号的新型无线技术。记录装置由两个三元仪组成，一个微型驱动器，一个神经数据记录器和一个防水外壳。除数据记录器及其连接器外，所有部件都是定制的。
Abstract
控制鱼类行为的神经机制仍然鲜为人知，尽管鱼类占所有脊椎动物的大多数。记录自由移动鱼类的大脑活动的能力将大大促进对鱼类行为的神经基础的研究。此外，精确控制大脑中的记录位置对于研究鱼脑中跨区域的协调神经活动至关重要。在这里，我们介绍一种技术，从自由游泳的鱼的大脑无线记录，同时控制记录位置的深度。该系统基于与新型水兼容植入物相关的神经记录器，该植入物可以通过微驱控制三轮驱动来调整记录位置。该系统的功能通过金鱼的端管记录来说明。
Introduction
鱼类是最大、最多样化的脊椎动物群，与其他脊椎动物一样，它们表现出复杂的认知能力，如导航、社交、睡眠、狩猎等。然而，控制鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不为人所知。
在过去的几十年里，固定鱼的细胞外记录主要用于研究行为1、2的神经基础的不同方面。虽然这种技术适用于某些感官系统，但研究行为的神经基础的全部谱是很难的，如果不是不可能在固定动物。第一个进展涉及记录从毛斯纳细胞的系绳游泳鱼3，4。然而，毛斯纳细胞不成比例地大，记录的动作潜力振幅，可以高达几mV，便于记录。后来，Canfield等人描述了一个概念证明，当使用系绳动物记录从鱼的telencephon5。记录鱼类神经活动的另一项最新技术是钙成像（见奥尔格和德波拉维娅6和Vanwalleghem等人的评论）。这项技术是开发用于斑马鱼幼虫，因为皮肤和头骨是透明的，在幼虫阶段。然而，这种技术不能用于研究后期开发阶段的复杂行为。
在这里，我们提出了一种新技术，用于记录自由游泳鱼大脑中的细胞外神经活动。这是Vinepinsky等人8中描述的协议的修改版本。主要的创新是增加了一个微驱，使得手术后能够控制电极的位置。该技术设计用于使用一组通过微驱动器连接到神经数据记录器的四叶鱼记录金鱼的端管。整个设置是无线的，并锚定在鱼的头骨。系统的特定重量通过添加一个小浮子，使鱼可以自由游泳，从而与水特定重量相等。
该技术基于使用神经数据记录器，该记录器放大、数字化并将信号存储在板载存储设备中。记录器遥测系统用于启动和停止录像，以及与摄像机同步。在此协议中，使用 16 通道神经记录器，与微型驱动器一起嵌入防水盒中。
微驱组件由两个主要部件制成：微驱本身和微驱外壳（图1A，B）。外壳装有微驱动器和三头龙，还充当头骨和记录器箱之间的锚点（图1C）。PVC记录器盒采用机器工艺制造，使用 O 形环进行密封（图1E-G，另见补充图 1、补充图 2和辅助图 3，用于三维 [3D] 图）。在一端，一块聚苯乙烯泡沫被连接到记录器盒上，以补偿植入物的重量，并为鱼提供浮力中性植入物。协议中描述的微驱的构造遵循 Vandecasteele 等人9提出的程序，对微驱连接到外壳进行了修改（图 1A）。介绍了所有主要步骤。
议定书中描述的鱼头骨制备程序与Vinepinsky等人8中所述的程序类似，并在协议中作了简要说明。手术后一天，鱼通常从麻醉效果中完全恢复，并准备进行行为实验。请注意，可以通过转动微驱螺钉来调整 ttrode 位置。螺钉每次完全旋转的间距为 300 μm，建议在达到目标大脑位置之前提高 75 μm。应参考适当的大脑图集，以针对感兴趣的特定大脑区域。建议每次对鱼进行麻醉以更换电池或存储卡时测试电极阻抗。
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Protocol
所有手术程序都必须得到当地动物福利伦理委员会（如IACUC）的批准。
1. 微型驱动外壳的建造
- 要构建外壳，请使用锯片将 1 mm 宽的黄铜板切割成 19 mm x 29 mm x 1 mm 板。在垂直于边缘的两条长边上切割两个 5.5 mm 的狭缝，使每个狭缝距离窄边 6.5 mm（图2A）。
- 使用钳子，将长边上长边之间的区域向内折叠，然后将底部向内折叠，将上侧向外折叠以获得外壳（图 2B，C）。
- 使用 3 mm 钻头在微驱壳体中为螺钉打孔。
注：这些孔稍后将用于将壳体连接到记录器盒（图 2D）。 - 焊接外壳的两侧。
- 使用精细圆形文件，在外壳底部生成一个半径为 1.5 mm 的半圆形小狭缝（图 2E）。
注：稍后将用它来插入不锈钢管以引导电极。 - 使用 1 mm 钻头在 Ttrodes 的壳体背面打一个洞（图 2F）。
注：外壳的 3D 模型位于补充外壳.stl 文件中。
2. 微型驱动器的建造
- 使用刀具，从单行公销头条上折断三针件（图1H）。使用钳子，拉出中间销。
- 使用刀具将剩余销切割到 10 mm 的长度（比螺钉长度少 2 毫米）。另一种可能性是使用更长的螺钉（参见步骤 2.4）。
- 使用#65钻头通过中间销孔钻一个孔。使用 00_99 分针钻螺纹。
- 组装微驱和黄铜板（7.5 毫米 x 2.5 毫米 x 0.6 毫米，参见补充图 4），以便黄铜板接触销。将螺钉（#00-90 圆头，12 mm，黄铜）插入第一黄铜板，然后穿过销头螺纹和第二黄铜板。最后，将螺母放在螺钉上，轻轻拧紧组装的微驱。
- 将销与黄铜板焊接在一起，将螺母与螺钉尖端焊接在一起。
- 将微驱焊接到微驱外壳中，在微驱黄铜板两侧的四个点上。
- 切割一个6毫米长、内径为1.5毫米的不锈钢管，另一根不锈钢管长3毫米，内径为1.2毫米。
- 使用环氧树脂将 6 mm 长管粘附到微驱壳体底部的小半圆形狭缝上。将 3 mm 长不锈钢粘附到销头上，与壳体上的 6 mm 长管对齐。
- 切割两个直径为 0.64 mm 的 5 厘米长硅胶管段和一个直径为 0.250 mm 的 5 厘米长聚酰亚胺管。
- 将三根管子插入两个不锈钢管中。使用氰丙烯酸酯胶水将管粘附在连接到销头的不锈钢管上。一直拧起微驱，从两根钢管的顶部和底部切断多余的管子。
注：带外壳的微型驱动器现已准备就绪（图 1C）。
3. 准备泰特罗德阵列
- 要制造一个双特洛德植入物，每个ttrode上有四个电极，从直径为25微米的钨丝中制备八根电线，每根12厘米长，Fformvar绝缘。
注：同样的设计可以容纳四个四元。 - 将16通道电极接口板（EIB-16）PCB（见材料表）的支架放在显微镜下。
- 使用软倾斜钳和打火机，使用火焰从一侧的八根电线上取下涂层。
注：这是为了确保以后将导线正确连接到 PCB 连接器。 - 将导线推入 EIB-16 中的一个孔中，孔中的涂层侧。放置销子并用钳子按压。通过测量引脚和导线未涂层侧的电阻来检查连接。
注：阻力在几十欧姆的分左右。 - 对所有八根导线重复步骤 3.4。
- 使用管道胶带将两组四根导线用胶带粘在一起。
注：每个小组稍后将粘在一起，形成一个ttrode。 - 切割一条长 12 厘米、直径为 50 μm 的钨丝。将其连接到 EIB-16 连接之一。
注：这根导线将用作参考电极。 - 切割两根长 12 厘米、直径为 75 μm 的裸线，作为记录记录器的基础。在 EIB-16 中将两根导线焊接到接地连接上。
- 将 EIB-16 放在电动车削装置上方，并将一组四根导线的管道胶带端放在电动调谐装置上。顺时针应用 130 轮，然后逆时针旋转 20 轮。应用氰丙烯酸酯胶水覆盖三色。
- 等待胶水固化。将切口切在靠近管道胶带的地方。
- 对第二个 ttrode 重复步骤 3.9 和 3.10。
注：这将生成已完成的双 ttrode 数组 （图 1D）。
4. 组装植入物
- 一直拧下微驱。
- 使用 1 x 3M Phillips 圆头螺钉，将 EIB-16 连接到 PVC 板。
- 使用软端钳，将所有线和线通过记录器箱盖前部孔。
- 使用 2 x 6M Phillips 平头螺钉，将 PVC 板连接到记录器盒盖上。使 EIB-16 接头保持正确的方向，以便记录器可以安装在 EIB-16 上。确保 EIB-16 固定到位，以避免记录信号中的运动伪影。
- 使用环氧树脂将导线密封到包装盒上。尽可能少涂抹，因为主密封将在稍后通过室温硫化 （RTV） 完成。
- 使用 2 mm 螺钉将微驱壳体连接到记录器箱盖。
- 通过微驱壳体背面的孔将三通线和所有导线螺纹。通过微驱动器中的两个硅胶管将四分线螺纹。通过微驱中的聚酰亚胺管将 50 μm 钨丝螺纹。
- 将三分线和电线粘附在管子上，将氰丙烯酸酯胶水涂在管的顶端，以确保运动与微驱一致。将微驱一直拧到顶部。
- 在微驱壳体内裸露的ttrode和电线上涂抹软石油（见材料表），以防止运动。
- 使用加热剃刀刀片切割 12 mm x 14.5 mm 培养皿底窗。将车窗连接到带环氧树脂的微驱壳体前部。将接地线保持在窗外。
- 将 RTV 涂层涂在记录器箱盖和微驱外壳之间的外露的四分线和导线上。
- RTV 固化后，将包装盒内小重量合上，并在水中浸入水中过夜，以确保没有漏水进入包装盒。
- 使用锋利的剪刀将铁丝和参考线切割到所需长度。
- 将标记的挤出聚苯乙烯泡沫（参见材料表）连接到包装盒。调整其大小，使其浮力在水浴中淹没时平衡。
- 将 ttrode 尖端浸入铂黑色溶液中，并使用直流电 （-0.2 μA） 涂覆电极并根据需要设置电极阻抗。使用多电极阻抗测试仪（参见材料表）进行涂层和阻抗测量。
注：在金鱼鱼缸中，40 kOhm 的值是最好的。根据不同的应用，电极阻抗可以通过修改铂黑色涂层10，11来调整。
5. 麻醉制剂 = 1% MS-222 库存解决方案
警告：麻醉制剂包括使用粉末状MS-222，一种致癌物质。因此，步骤 5.2 和 5.3 必须在使用手套的化学罩中完成。
- 将 100 mL 的水添加到可包含超过 100 mL 的管中。
- 在化学罩中，将一次性加权板放在秤上。使用铲子加入 1 克 MS-222 粉末，然后将粉末添加到管中。
- 摇好管子。
注：MS-222 以液体形式可在化学罩外使用，戴手套，但不需要口罩。 - 将一次性加权板放在秤上。用铲子加入2克碳酸氢钠，然后将粉末加入管中。摇好管子。
6. 准备鱼头骨
注：在这个阶段，鱼已经准备好进行植入手术了。手术前，确保所有部件和用品都已通过适当的程序进行消毒。对于此步骤，需要出水 U 形鱼架。在此协议中，使用适合 15 厘米头到尾长金鱼的铝支架。该系统将鱼从水中吸收出来，同时用含氧水将鱼刺注入水中。有关详情，请参阅Vinepinsky等人8。
- 将鱼放入 0.02% MS-222 水浴中 20 分钟，直到鱼睡着。
- 使用无菌手套，将鱼从水中取走，放在鱼架上。
注：注入鱼的含氧水含有MS-222，浓度为0.02%，因此鱼在手术过程中保持麻醉。 - 使用无菌铲子，在指定地点上方的皮肤上涂抹利多卡因5%糊状物10分钟，然后取出利多卡因。
注：查阅适当的大脑图集，以定位特定的大脑区域。 - 使用无菌的 15 刀片手术刀，在植入物区域取出颅骨上方的皮肤。
- 使用带有 0.7 mm 钻头的牙科钻头，在头骨上钻 4 个孔。在每个孔中插入 1 mm 螺钉（3 毫米长），在插入螺钉之前，将氰丙烯酸酯胶水直接涂抹在孔上。
- 使用牙科烧结器，在螺钉和暴露的头骨外围涂抹牙科水泥。
- 使用牙科钻头，在大脑感兴趣区域上方的颅骨上打一个直径为 5 mm 的孔。去除颅骨和大脑之间的脂肪组织，并使用细钳子和软纸巾暴露大脑区域目标。小心不要损坏头骨下面的大血管。
注：到这个阶段结束时，鱼准备植入探头。此处仅介绍特定于此协议的主要步骤。几个术后程序（如动物的健康和手术工具和区域的灭菌的详细文档）没有提出或讨论，因为它们适用于所有与鱼或小动物的手术。
7. 植入探头
注：要完成协议中的最后一步，需要一个机械手，在植入大脑时将植入物固定到位。
- 使用操纵器握住记录器箱盖，将四头指向鱼脑。
- 弯曲参考电极，使当三头龙降低到大脑中时，参考将停留在大脑之外。
- 切开地面，使它们适合在头骨中。可选择将一根接地线连接到其中一个头骨螺钉。
- 降低植入物，使电极插入大脑，而微驱外壳的底部靠近头骨。
- 通过在壳体和最近的头骨螺钉之间涂抹少量牙科水泥，开始将植入物连接到头骨上。
- 牙齿水泥的第一部分固化后，应用牙科水泥，并关闭颅骨上方的孔和整个暴露的头骨。
注：通常需要几轮牙科水泥应用，以覆盖整个暴露的头骨。 - 将记录器和蓄电池安装到包装盒中，用所有螺钉密封包装盒。
- 根据用于实验的鱼的类型应用抗生素和当地止痛药。
- 用清水冲洗鱼的刺，直到鱼开始醒来。将鱼从支架上取下，放回主箱中。
注：鱼在手术后60分钟内完全恢复。 - 确保鱼能够自由游泳与植入物（图3，补充视频1）。如果需要，请重新调整记录器盒上方的挤出聚苯乙烯泡沫的大小，以便鱼能够轻松平衡。
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Representative Results
在记录过程中，金鱼在方形水箱中自由游动，而其端脑的神经活动被记录下来。这些实验的目的是研究单个细胞的神经活动如何决定鱼的行为。为此，需要在记录的数据中确定尖峰活动。大脑活动在被记录时，被数字化为31，250赫兹，高通过滤在300赫兹的数据记录器。然后，离线，对信号应用了带通滤波器（300~5，000 Hz），并将预排序的原始数据分离到每个ttrode的通道和参考通道（图4A）。接下来，使用常见的尖峰排序算法12来描述单个细胞活动。首先，每个通道由最小尖峰振幅阈值（相对于每个通道的噪声电平）手动过滤。然后，由于ttrodes的提示不在同一个部位，并且参考电极在大脑之外，出现在多个ttrode或参考通道的尖峰也被过滤。然后，按形状、长度、尖峰间隔（后续作用电位之间的时间必须粘附到神经元的耐火期）和主组分分析 （PCA） 手动对筛选的数据进行聚类和筛选。图4给出了单单元聚类与多单元和噪声聚类的示例。
图1：植入式组件。（A） 微驱，由销头、黄铜板和螺钉制成。（B） 微驱外壳，由单黄铜板折叠制成。（C） 微驱组件用微驱 （A） 和外壳 （B） 制成。（D） ttrode 阵列使用 EIB-16、两个四分线、一个参考电极和连接到连接器的接地（参见材料表）。（E） 和 （F） 微驱植入物组件连接到防水记录箱盖.Ttrode 组件连接器位于包装盒内，并且 ttrod 粘附在微驱动器上。（G） 记录器盒底座，记录器和蓄电池所在的位置。底座周围的 O 环用于密封。（H） 单行公销头条。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：微驱外壳折叠技术。（A） 从 1 毫米宽的黄铜板开始，并制作四个斜面。（B） 向内折叠侧的中间部分。（C） 向后折叠上部，将底部向内折叠。（D） 在顶部钻三个 3 毫米的孔.（E） 在底部雕刻一个 1 毫米半圆。（F） 在上侧中间钻一个1毫米的孔。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：从自由行为金鱼的记录。（A） 特龙被植入鱼脑，组件与鱼的头骨相连。（B） 盒子是密封的，里面的记录器是密封的。（C-E）手术后随组件自由游动的鱼。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：代表性结果。（A） 记录0.5 s长从自由游泳的鱼在手术后24小时.使用带通滤波器（300~10，000 Hz）过滤信号。参考电极中没有高振幅噪声，表明缺少运动伪影。第二个通道（绿色通道）中没有操作潜力。第一个电极数据显示在棕色通道中。蓝色和红色星形表示分别显示在面板 B 和 C 中的蓝色和红色星团的尖峰。（B） 两个不同单个神经元簇的尖峰形状，从 ttrode 1 记录。（C） 对超过阈值的所有尖峰候选项的第一个 ttrode 数据的前三个主要组成部分进行投影。蓝色和红色聚类对应于面板 B 中的蓝色和红色尖峰形状。 灰色点表示神经噪声或多单位活动。请点击此处查看此图的较大版本。
补充视频1：游泳模式：植入手术前一天（左）和后一天（右）金鱼的例子。视频显示类似的游泳模式，表明鱼不受手术阻碍。视频速度为 x1.8。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。
补充图1：记录器盒主腔图。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图2：记录器箱盖图。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图3：EIB-16室盖图。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图4：用于微驱的黄铜板图。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件1：住房图。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Discussion
该协议详细说明了在自由游泳的金鱼的端脑中植入ttrode阵列所涉及的步骤。该技术实现了一个神经记录器，放大和记录从多达16个通道获得的信号，以及一个可以调整大脑中的ttrode位置的微驱。微驱可以调整大脑中的位置以优化录制。
该协议可以很容易地修改，以便从其他大脑区域进行记录（参见Vinepinsky等人8，以便使用类似的技术从光学技术中记录）或任何其他15厘米长或更大的水生动物（大约等于金鱼头到尾，约100克重量）。此外，该协议可以修改为与任何数据记录器一起工作，只要它以可以穿透水的频率进行通信。此处使用的记录器使用 900 MHz 的无线电频率进行通信，并且可以通过大约 20 厘米的水进行通信。2.4 GHz 的射频也可以穿透 ±15 厘米的淡水。低频和其他替代方法可能会得到更好的结果13，14，15。此处介绍的协议使用了具有八个录制通道的双特罗德阵列。此外，该协议可以修改，以纳入其他探头几何形状，如线阵16或硅胶探头9。
与完整的遥测记录系统或联机系统使用数据记录器有几个优点。首先，无线通信会增加录音噪音。因此，数据的全面传输将降低信号质量。此外，记录数据可确保在通信失败时不会丢失数据。此外，无线系统允许鱼自由游泳，不像在拴动物。最后，此协议被开发用于记录操作电位，但也可用于通过将记录器模拟高通滤波器设置为 1 Hz 而不是 300 Hz 来记录本地场电位。记录器的一个缺点是需要物理下载数据并在电池耗尽时更换电池。
协议中建议的微驱可显著提高记录单细胞活动的可能性。如果没有微驱装置，植入的三分线体大约被放置在大脑的同一记录位中，整个时间都在测试鱼。这在物理上限制了从同一条鱼记录多个单个神经元的可能性，因此限制了每条鱼的记录产量。事实上，在手术后，大脑中的特定记录部位仍然未知，这加强了对可移动设备的需求，使得在固定后能够移动大脑中的电极。
为清楚起见，省略了该协议的一个重要特征是电极阻抗的确定。电极阻抗可以通过选择导线直径（即直径越高导致阻抗越低）、电线组成（例如钨或铬）和电极涂层（例如钨的铂黑和用于单色的金）来调整，从而产生直径较低、阻抗较低的导线。由于所有这些参数对神经元记录的成功至关重要，因此强烈鼓励读者查阅有关这个主题的大量文献，包括Harris等人17。
请注意参考电极在检测系统中可能的外部噪声源方面的重要性。参考电极是一个相对较低的阻抗电极，插入到头骨中，但在大脑之外。因为它不接触脑组织，它记录信号的签名，这是由热噪声，运动伪影和外部噪声组成的。该系统的主要噪声源是运动伪影和通信噪声，这些噪声可以由记录器控制和定时。这些噪声可通过它们施加在参考电极信号上的签名来轻松检测。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢纳楚姆·乌拉诺夫斯基和乌拉诺夫斯基实验室的成员提供的所有帮助。此外，我们感谢塔尔·诺普兰斯基-祖尔提供有益的技术援助。我们感谢来自以色列科学基金会-第一计划（第281/15号赠款）和赫尔姆斯利慈善信托基金通过内盖夫本-古里安大学的农业、生物和认知机器人倡议提供的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15 blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1x3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2x6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50 µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement - GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 min curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
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