Trådløs elektrofysiologisk optagelse af neuroner af bevægelige Tetrodes i frit svømmehal

Summary

En ny trådløs teknik til optagelse af ekstracellulære neurale signaler fra hjernen af frit svømning guldfisk præsenteres. Optageenheden er sammensat af to tetrodes, et mikrodrev, en neurale datalogger og en vandtæt sag. Alle dele er specialfremstillede, bortset fra dataloggeren og dens stik.

Abstract

De neurale mekanismer, som regulerer fiske adfærden, er for det meste ukendte, selv om fiskene udgør størstedelen af alle hvirveldyr. Evnen til at optage hjerneaktivitet fra frit bevægende fisk ville fremme forskning på neurale grundlag af fisk adfærd betydeligt. Desuden er præcis kontrol af optagelsen placering i hjernen afgørende for at studere koordineret neurale aktivitet på tværs af regioner i fisk hjernen. Her præsenterer vi en teknik, der registrerer trådløst fra hjernen af frit svømning fisk, mens kontrol for dybden af optagelsen placering. Systemet er baseret på en neurale logger forbundet med en ny vand-kompatibelt implantat, der kan justere optagelsen placering af Micro drive-kontrollerede tetrodes. Systemets egenskaber illustreres gennem optagelser fra telencephalon af goldfish.

Introduction

Fisk er den største og mest forskelligartede gruppe af hvirveldyr, og ligesom andre hvirveldyr udviser de komplekse kognitive evner såsom navigering, socialisering, søvn, jagt osv. Ikke desto mindre er de neurale mekanismer, som regulerer fiske adfærden, for det meste ukendte.

I de sidste par årtier, ekstracellulære optagelser fra immobiliserede fisk er primært blevet implementeret for at undersøge forskellige aspekter af det neurale grundlag for opførsel^1,2. Selv om denne teknik er passende for nogle sensoriske systemer, undersøgelse af det fulde spektrum af neurale grundlag for adfærd er vanskeligt, hvis ikke umuligt i immobiliserede dyr. De første forskud involveret optagelse fra mauthner celler af tøjret svømning fisk^3,4. Men Mauthner celler er uforholdsmæssigt store og den registrerede handling potentielle amplituder, som kan gå så højt som et par mV, lette optagelsen. Senere beskrev Canfield et al. et bevis på koncept ved brug af et tøjret dyr til at optage fra telencephalon af fisk⁵. En anden nylig teknik til optagelse af neurale aktivitet fra fisk er calcium Imaging (Se anmeldelser af Orger og de Polavieja⁶, og Vanwalleghem et al.⁷). Denne teknik er udviklet til brug med Zebra larver, fordi huden og kraniet er gennemsigtigt i larvestadiet. Men denne teknik kan ikke bruges til at studere komplekse adfærd i senere stadier af udvikling.

Her præsenterer vi en ny teknik til optagelse af ekstracellulær neurale aktivitet fra hjernen af frit svømning fisk. Dette er en modificeret version af den protokol, der er beskrevet i Vinepinsky et al.⁸. Den vigtigste nyskabelse er tilføjelsen af et mikrodrev, der gør det muligt at kontrollere elektrodernes position efter operationen. Teknikken er designet til optagelse fra telencephalon af guldfisk ved hjælp af et sæt af tetrodes, der er forbundet til en neurale datalogger via en Micro drive. Hele opsætningen er trådløs og forankret til fiskens kraniet. Den specifikke vægt af systemet er udlignet til den vand-specifikke vægt ved at tilføje en lille float, der gør det muligt for fiskene at svømme frit.

Teknikken er baseret på brugen af en neurale datalogger, der forstærker, digitaliserer og lagrer signalet i en indbygget hukommelsesenhed. Den logger telemetri system bruges til at starte og stoppe optagelserne, og til synkronisering med videokameraet. I denne protokol anvendes en 16-kanals neurale logger, indlejret i en vandtæt boks sammen med mikrodrevet.

Micro drive-modulet er fremstillet af to hovedkomponenter: selve mikrodrevet og mikrodrevets kabinet (figur 1A, B). Huset holder Micro drive og tetrodes, og fungerer også som anker mellem kraniet og loggeren boks (figur 1C). PVC logger Box er fremstillet ved hjælp af en maskine proces og er forseglet ved hjælp af en O-ring (figur 1E-G, se også supplerende figur 1, supplerende figur 2, og supplerende figur 3 for en tredimensionel [3D] diagram). I den ene ende er et stykke polystyren skum fastgjort til loggeren boks for at kompensere for vægten af implantatet og give fisken med en flyde-neutral implantat. Konstruktionen af den mikrodrev, der er beskrevet i protokollen, følger den procedure, der er fremlagt af Vandecasteele et al.⁹ med en ændring, der Fastgør mikrodrevet til huset (figur 1a). Alle større skridt er præsenteret.

Den procedure, der er beskrevet i protokollen til at forberede fisken kraniet svarer til den, præsenteret i Vinepinsky et al.⁸ og er beskrevet kort i protokollen. En dag efter operationen, fiskene er normalt fuldt genvundet fra virkningerne af anæstesi og er klar til de adfærdsmæssige eksperimenter. Bemærk, at tetrode-placeringen kan justeres ved at dreje på Micro drive-skruen. Skruen har en afstand på 300 μm pr. fuld rotation, og et fremskridt på 75 μm anbefales, indtil målet for hjernens placering er nået. Et passende Brain Atlas bør konsulteres for at målrette den specifikke hjerneregion af interesse. Det er tilrådeligt at teste elektrode impedansen hver gang fiskene er bedøvet for batteri eller hukommelseskort udskiftning.

Protocol

Alle kirurgi procedurer skal godkendes af de lokale etiske komitéer om dyrevelfærd (f. eks IACUC).

1. opførelse af Mikrodrevs huset

1. For at konstruere huset, skæres en 1 mm bred messing plade i en 19 mm x 29 mm x 1 mm plade ved hjælp af en sav. Skær to 5,5 mm slids på hver af de lange sider vinkelret på kanten, således at hver spalte er 6,5 mm væk fra de smalle sider (figur 2A).
2. Brug tænger, fold området mellem slidser på de lange sider indad, og fold derefter den nederste del indad og over siden udad for at få huset (figur 2B, C).
3. Brug en 3 mm borekrone til at lave huller til skruer i mikrodrevets kabinet.
   Bemærk: Disse huller vil blive brugt senere for at fastgøre huset til loggeren boks (figur 2D).
4. Lodde siderne af huset.
5. Ved hjælp af en fin cirkulær fil, generere en lille, 1,5 mm i radius, halvcirkelformet spalte i bunden af huset (figur 2E).
   Bemærk: Dette vil blive brugt senere til at indsætte rustfrit stålrør til at guide elektroderne.
6. Brug en 1 mm bore knap til at lave et hul i bagsiden af huset til tetrodes (figur 2F).
   Bemærk: En 3D-model af huset findes i den supplerende bolig. STL fil.

2. opførelse af Mikrodrevet

1. Ved hjælp af en fræser, afbryde en tre-benet stykke fra en enkelt række mandlige pin header Strip (figur 1H). Brug tænger til at trække den midterste nål ud.
2. Ved hjælp af en fræser skæres de resterende ben til 10 mm i længden (2 mm mindre end skruelængden). En anden mulighed er at bruge en længere skrue (Se trin 2,4).
3. Bore et hul ved hjælp af en #65 bore-bit gennem midten PIN hul. Bore en tråd ved hjælp af en 00 − 99 Tap.
4. Saml mikrodrevet og messing pladerne (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, se supplerende figur 4) således at messing pladerne rører benene. Indsæt en skrue (#00-90 rund hoved, 12 mm, messing) gennem den første messing plade, derefter gennem pin header tråd og den anden messing plade. Endelig, Placer en møtrik på skruen og forsigtigt stramme den samlede Micro drive.
5. Lodde benene sammen med messing pladerne, og møtrikken med spidsen af skruen.
6. Lodde mikrodrevet ind i mikrodrevet hus på fire punkter på siderne af Micro drive messing plader.
7. Skær en rustfri stålrør 6 mm lang med en indvendig diameter på 1,5 mm og en anden rustfri stålrør 3 mm lang med en indvendig diameter på 1,2 mm. polere enderne af rørene for at undgå skarpe ender.
8. Klæb det 6 mm lange rør fast til den lille halvcirkelformet spalte i bunden af mikrodrevets kabinet ved hjælp af epoxy. Lim den 3 mm lange rustfrit stål til pin header, foret op med 6 mm lange rør på huset.
9. Skær to 5 cm lange silikone rørsegmenter med en diameter på 0,64 mm og et 5 cm langt polyimid rør med en diameter på 0,250 mm.
10. Sæt de tre rør i de to rustfri stålrør. Lim rørene til det rustfri stålrør, der er fastgjort til pin-headeren ved hjælp af cyanoacrylatlim. Skru mikrodrevet helt op og skær den overskydende slange af fra toppen og bunden af de to stålrør.
    Bemærk: Mikrodrevet med huset er nu klar til brug (figur 1C).

3. klargøring af tetrode-arrayet

1. At fabrikere et to-tetrode implantat med fire elektroder på hver tetrode, forberede otte ledninger, hver 12 cm lang, Formvar isoleret, ud af 25 μm diameter wolfram wire.
   Bemærk: Det samme design kan rumme fire tetrodes.
2. Placer en holder til en 16-kanals elektrode grænseflade tavle (EIB-16) PCB (Se tabel over materialer) under mikroskop.
3. Brug en blød, tippet pincet og en lighter til at fjerne belægningen fra hver af de otte ledninger på den ene side ved hjælp af flammen.
   Bemærk: Dette er for at sikre, at ledningen vil være korrekt forbundet til PCB Connector senere.
4. Skub en ledning ind i et af hullerne i EIB-16 med den coatede side i hullet. Placer en nål, og tryk på den med tænger. Kontroller tilslutningsmulighederne ved at måle modstanden mellem stiften og den ubelagte side af ledningen.
   Bemærk: Modstanden er på rækkefølgen af snesevis af Ohms.
5. Gentag trin 3,4 med alle otte ledninger.
6. Tape to grupper af fire ledninger sammen ved hjælp af gaffatape i slutningen af hver ledning.
   Bemærk: Hver gruppe vil blive limet sammen senere for at danne en tetrode.
7. Skær et stykke wolfram wire 12 cm lang med en 50 μm diameter. Tilslut den til en af EIB'S-16-tilslutningerne.
   Bemærk: Denne ledning vil fungere som referenceelektrode.
8. Skær to nøgne sølv ledninger 12 cm lange med en 75 μm diameter, der vil tjene som begrundelse for optagelsen logger. Lodde de to ledninger til jordforbindelsen i EIB-16.
9. Hold EIB-16 over en motoriseret drejeanordning og Placer kanalen tape enden af en gruppe af fire ledninger på den motoriserede tuning enhed. Påfør 130 runder med uret efterfulgt af 20 rotationer mod uret. Påfør cyanoacrylat lim til at dække tetrode.
10. Vent på, at limen helbredes. Skær tetrode tæt på kanalen tape.
11. Gentag trin 3,9 og 3,10 med den anden tetrode.
    Bemærk: Dette producerer det færdige to-tetrode array (figur 1D).

4. montering af implantatet

1. Skru Micro drive hele vejen ned.
2. Brug 1 x 3M Phillips runde hoved skruer, fastgør EIB-16 til PVC-pladen.
3. Ved hjælp af soft end pincet, trække alle de tetrodes og ledninger gennem hullet i forsiden af logger box Cover.
4. Brug de 2 x 6M Phillips-skruer med fladt hoved til at fastgøre PVC-pladen til logførings boksens dæksel. Hold EIB-16-stikket i den rigtige retning, så loggeren kan monteres på EIB-16. Sørg for, at EIB-16 er fastgjort på plads for at undgå bevægelses artefakter i det optagede signal.
5. Forsegl ledningerne til æsken ved hjælp af epoxy. Påfør så lidt som muligt, fordi den primære forsegling vil ske ved stuetemperatur vulkanisering (RTV) senere.
6. Fastgør mikrodrevets kabinet til logførings boksens dæksel med 2 mm skruer.
7. Tråd tetrodes og alle ledninger gennem hullet på bagsiden af Micro drive huset. Gevind tetrodes gennem de to silikone rør i mikrodrevet. Tråd 50 μm wolfram wire gennem polyimid røret i mikrodrevet.
8. Lim tetrodes og ledninger til deres rør ved at anvende cyanoacrylat lim til den øverste ende af rørene, for at sikre, at bevægelsen er i overensstemmelse med mikrodrevet. Skru Micro drive hele vejen til toppen.
9. Påfør Soft Petroleum (Se tabel over materialer) på den udsatte tetrode og ledninger inde i Micro drive huset for at forhindre bevægelse.
10. Skær et 12 mm x 14,5 mm Petri skål bund vindue ved hjælp af et opvarmet barberblad. Fastgør vinduet til forsiden af mikrodrevets kabinet med epoxy. Hold jordledningerne uden for vinduet.
11. Anvend RTV-belægning på de eksponerede tetrodes og ledninger mellem logførings boksens dæksel og mikrodrevets kabinet.
12. Når RTV er helbredt, skal du lukke boksen med en lille vægt indeni og nedsænkes i vand natten over for at sikre, at der ikke er vandlækage i æsken.
13. Skær tetrodes og reference wire til den ønskede længde ved hjælp af skarp saks.
14. Fastgør den mærkede ekstruderet polystyren skum (Se tabel over materialer) til kassen. Juster dens størrelse, så dens flydeevne er afbalanceret, når nedsænket i et vandbad.
15. Dyp tetrode spidser i platin sort opløsning og brug en jævnstrøm (-0,2 μA) til at belægge elektroderne og indstille elektrodernes impedans som ønsket. Brug en impedans tester med flere elektroder (Se tabel over materialer) til måling af belægning og impedans.
    Bemærk: I guldfisk pallium er en værdi på 40 kohm bedst. Afhængigt af applikationen kan elektrode impedansen justeres ved at ændre platin sort belægning^10,11.

5. anæstesi præparat — 1% MS-222 stamopløsning

Forsigtig: Anæstesi præparat omfatter brugen af pulveriseret MS-222, et kræftfremkaldende. Derfor skal trin 5,2 og 5,3 udføres i en kemisk hætte ved hjælp af handsker.

1. Tilsæt 100 mL vand til et rør, der kan indeholde mere end 100 mL.
2. I en kemisk hætte, Placer en engangs vægtnings plade på en skala. Tilsæt 1 g MS-222 pulver ved hjælp af en spatel, tilsæt derefter pulveret til røret.
3. Ryst røret godt.
   Bemærk: I flydende form kan MS-222 anvendes uden for den kemiske hætte iført handsker, men kræver ikke en maske.
4. Placer en engangs vægtnings plade på en skala. Tilsæt 2 g natriumbicarbonat ved hjælp af en spatel, tilsæt derefter pulveret til røret. Ryst røret godt.

6. klargøring af fiske kraniet

Bemærk: På dette stadium er fiskene klar til implantat kirurgi. Før operationen skal du sørge for, at alle komponenter og forsyninger er blevet steriliseret ved de relevante procedurer. Til dette trin er der behov for en ud af vand U-formet fiske holder. I denne protokol anvendes en aluminiumsholder, der passer til en 15 cm hoved til hale lang guldfisk. Dette system holder fiskene ude af vandet, mens perfusing de gæller med iltet vand. Yderligere oplysninger findes i Vinepinsky et al.⁸.

1. Placer fisken i et 0,02% MS-222 vandbad i 20 minutter, indtil fisken sover.
2. Brug sterile handsker, tag fisken ud af vandet og Placer den i holderen.
   Bemærk: Den ildede vand perfusing fisken indeholder MS-222 i en koncentration på 0,02%, således at fiskene forbliver bedøvet under operationen.
3. Ved hjælp af en steril spatel, anvende lidocain 5% pasta på huden over det udpegede sted for kirurgi i 10 min, derefter fjerne lidocain.
   Bemærk: Konsultere en passende Brain Atlas til at målrette den specifikke hjerneregion.
4. Ved hjælp af en steril 15 klinge skalpel fjernes huden over kraniet i implantat området.
5. Brug en tand boremaskine med 0,7 mm bore bits, bor 4 huller i kraniet. Sæt en 1 mm skrue (3 mm lang) i hvert hul, og Anvend cyanoacrylatlim på hullerne lige før du indsætter skruen.
6. Ved hjælp af en dental burnisher, anvende dental cement på skruerne og på periferien af det udsatte kraniet.
7. Brug tand boret, lav en 5 mm diameter hul i kraniet over hjernen region af interesse. Fjern fedtvæv mellem kraniet og hjernen og eksponere hjernen region mål ved hjælp af fine pincet og blødt silkepapir. Vær omhyggelig med ikke at beskadige de store blodkar under kraniet.
   Bemærk: Ved udgangen af denne fase er fiskene parat til at implantere sonden. Kun de vigtigste trin, der er specifikke for denne protokol, er beskrevet her. Flere postoperative procedurer (såsom detaljeret dokumentation om dyrets helbred og sterilisering af Operations værktøjerne og-området) er ikke præsenteret eller diskuteret, fordi de gælder for alle operationer med fisk eller små dyr.

7. implantering af sonden

Bemærk: For at fuldføre det sidste trin i protokollen, en manipulator, der kan holde implantatet på plads, mens det er indsat i hjernen er nødvendig.

1. Brug manipulatoren til at holde loggeren boks dækslet med tetrodes, der peger ned mod fiske hjernen.
2. Bøje reference elektroden således, at når tetrodes sænkes ned i hjernen, forbliver referencen uden for hjernen.
3. Skær grundene, så de passer ind i kraniet. Du skal eventuelt tilslutte en jordledning til en af kraniets skruer.
4. Sænk implantatet således, at elektroderne er indsat i hjernen, mens den nederste del af mikrodrevet huset er tæt på kraniet.
5. Begynd at montere implantatet på kraniet ved at påføre en lille mængde tand cement mellem huset og den nærmeste kranie skrue.
6. Efter den første del af tand cementen er helbredt, anvende dental cement og lukke hullet over kraniet og hele udsatte kraniet.
   Bemærk: Normalt flere runder af dental cement applikationer er nødvendige for at dække hele udsatte kraniet.
7. Installer loggeren og batteriet i kassen og forsegle boksen med alle skruerne.
8. Anvende antibiotika og lokale smertestillende midler i henhold til den type fisk, der anvendes til forsøgene.
9. Skyl fiskens gæller med ferskvand, indtil fiskene begynder at vågne. Fjern fiskene fra holderen og Placer den tilbage i sin hjem tank.
   Bemærk: Fiskene er fuldt tilbagebetalt inden for 60 min efter operationen.
10. Sørg for, at fisken er i stand til at svømme frit med implantatet (figur 3, supplerende video 1). Hvis det er nødvendigt, justere størrelsen af ekstruderet polystyren skum over loggeren boks, således at fiskene kan balancere let.

Representative Results

Under en indspilnings session svømmede guldfisk frit i en firkantet vandtank, mens den neurale aktivitet i sin telencephalon blev indspillet. Målet med disse eksperimenter var at studere, hvordan den neurale aktivitet af enkeltceller afgør fiskens opførsel. For at gøre dette, spiking aktivitet skulle identificeres i de registrerede data. Hjernens aktivitet, mens den blev indspillet, blev digitaliseret ved 31.250 Hz og High-pass filtreret ved 300 Hz af datalogger. Derefter, offline, et band-pass filter (300 − 5000 Hz) blev anvendt på signalerne, og de forsorterede rå data blev adskilt i hver tetrode kanaler og reference kanalen (figur 4a). Næste, fælles Spike sortering algoritmer¹² blev brugt til at karakterisere enkelt celle aktivitet. For det første blev hver kanal manuelt filtreret efter den minimale spids amplitude tærskel (i forhold til støjniveauerne for hver kanal). Da tetrodes ' spidser ikke er på samme sted, og reference elektroden var uden for hjernen, blev pigge, der optrådte i mere end én tetrode eller i reference kanalen, også filtreret. De filtrerede data blev derefter manuelt grupperet og filtreret efter form, længde, Inter-Spike interval (tiden mellem efterfølgende handlings potentialer skal overholde den ildfaste periode af neuroner), og ved hovedkomponent analyse (PCA). I figur 4vises eksempler på klyngedannelse i enkelt celle vs. multi enhed og støj klynger.

Figur 1: implantat samling. (A) Micro drive, lavet af en pin header, messing plader, og en skrue. B) mikrodrevs kabinet, fremstillet af en enkelt messing plade ved foldning. C) Micro drive-enhed, der er fremstillet med Mikrodrevet (A) og huset (B). D) tetrode-arrayet blev foretaget med anvendelse af EIB-16, to tetrodes, en referenceelektrode og grunde, der var forbundet med en konnektor (Se tabel over materialer). (E) og (F) Micro drive-implantat enheden er tilsluttet den vandtætte logger boks dæksel. Tetrode monterings stikket er placeret inde i kassen og tetrodes er limet til mikrodrevet. (G) logger box base, hvor loggeren og batteriet er placeret. O ringen omkring basen bruges til forsegling. (H) enkelt række mandlige PIN-headere strimmel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: mikrodrev bolig foldeteknik. (A) start med en 1 mm bred messing plade og lav fire slidser. (B) fold den midterste del af siden indad. (C) fold den øvre del bagud og den nederste del indad. (D) bore tre 3 mm huller i toppen. (E) gravér en 1 mm halvcirkel på bunden. (F) bore et 1 mm hul i midten af over siden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: optagelse fra en frit opfører guldfisk. A) tetroderne implanteres i fiske hjernen, og samlingen er forbundet med fiskens kranium. (B) boksen er forseglet med loggeren indeni. (C-E) En fisk svømmer frit med forsamlingen efter operationen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: repræsentative resultater. (A) optagelse 0,5 s lang fra en frit svømning fisk 24 h efter operationen. Signalet filtreres ved hjælp af et bånd-pass filter (300 − 10000 Hz). Der er ingen høj amplitude støj i reference elektroden, hvilket indikerer en mangel på bevægelses artefakter. Der er ingen action potentialer i den anden tetrode (grønne kanaler). De første elektrode data vises i de brune kanaler. Blå og røde stjerner indikerer pigge fra blå og røde klynger vist i henholdsvis panelerne B og C. B) Spike former af to forskellige klynger af enkelt neuroner, indspillet fra tetrode 1. C) fremskrivning af de første tre hovedbestanddele af dataene fra den første tetrode af alle Spike-kandidater, der krydsede tærsklen. Blå og røde klynger svarer til blå og røde Spike figurer fra panel B. grå prikker repræsenterer neurale støj eller stat aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende video 1: svømning mønstre: eksempel på guldfisk en dag før implantation kirurgi (venstre) og en dag efter (højre). Video viser lignende svømning mønstre, hvilket indikerer, at fiskene ikke hindres af kirurgi. Video hastighed er x 1.8. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Supplerende figur 1: diagram af loggeren boks hoved kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 2: diagram af logførings boksens dæksel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 3: diagram over EIB-16 kammer dækslet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 4: diagram over den messing plade, der anvendes til mikrodrevet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: bolig diagram. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Discussion

Denne protokol beskriver de skridt, der er involveret i implantering af en tetrode array i telencephalon af frit svømning guldfisk. Denne teknik implementerer en neurale logger, der forstærker og registrerer de signaler, der er erhvervet fra op til 16 kanaler sammen med et mikrodrev, som kan justere tetrode positionen i hjernen. Mikrodrevet gør det muligt at justere positionen i hjernen for at optimere optagelsen.

Denne protokol kan nemt ændres til optagelse fra andre hjerneområder (Se Vinepinsky et al.⁸ til optagelse fra optisk tectum ved hjælp af en lignende teknik) eller andre akvatiske dyr 15 cm lange eller større (omtrent lig med en guldfisk hoved til hale, ~ 100 gram vægt). Desuden kan protokollen ændres til at arbejde med enhver datalogger, så længe det kommunikerer med en frekvens, der kan trænge ind i vandet. Loggeren bruges her kommunikerer ved hjælp af en radiofrekvens på 900 MHz og kan kommunikere gennem omkring 20 cm vand. En radiofrekvens på 2,4 GHz kan også trænge igennem ~ 15 cm ferskvand. Lavere frekvenser og andre alternativer kan give endnu bedre resultater^13,14,15. Den protokol, der præsenteres her, brugte et to-tetrode array med otte optagelses kanaler. Desuden kan protokollen ændres til at indarbejde andre Probe geometrier såsom en wire array¹⁶ eller silikone sonder⁹.

Der er flere fordele ved at bruge en datalogger over et fuldt telemetri optagelses system eller et tøjret system. For det første tilføjer trådløs kommunikation støj til optagelsen. Derfor vil fuld overførsel af data reducere signalkvaliteten. Desuden sikrer logføring af data, at der ikke mistes data, hvis kommunikationen mislykkes. Desuden giver trådløse systemer fiskene mulighed for at svømme frit, i modsætning til i tøjdyr. Endelig blev denne protokol udviklet til at registrere aktionspotentialer, men kan også bruges til at optage lokale felt potentialer ved at indstille logger analog High-Pass Filter til 1 Hz i stedet for 300 Hz. En ulempe ved loggeren er behovet for fysisk at downloade data og udskifte batteriet, når det løber ned.

Mikrodrevet foreslået i protokollen øger sandsynligheden for at registrere enkelt celle aktivitet betydeligt. Uden Micro drive-anordningen anbringes de implanterede Tetroder omtrent på det samme optagelsessted i hjernen i hele den tid, hvor fiskene testes. Dette begrænser fysisk sandsynligheden for at optage flere enkelt neuroner fra den samme fisk, og derfor begrænses optagelses udbyttet pr. fisk. Det faktum, at den specifikke optagelse site i hjernen forbliver ukendt indtil efter operationen styrker behovet for en bevægelig anordning, der gør det muligt at flytte elektroderne i hjernen efter fiksering samt.

Et vigtigt træk ved denne protokol, som blev udeladt af klarhedshensyn, er bestemmelsen af elektrode impedansen. Elektrode impedansen kan justeres ved valget af tråddiameteren (dvs. en højere diameter fører til lavere impedans), trådsammensætning (f. eks. wolfram eller nikrom) og elektrode belægning (f. eks. platin sort til wolfram og guld til nikrom), som giver ledninger med lavere diametre og lavere impedans. Fordi alle disse parametre er afgørende for succesen af neuronal optagelser, er læseren stærkt opmuntret til at konsultere den store litteratur om dette emne, herunder Harris et al.¹⁷.

Bemærk vigtigheden af reference elektroden til påvisning af mulige eksterne støjkilder i systemet. Reference elektroden er en relativt lav impedans elektrode, der indsættes i kraniet, men er uden for hjernen. Fordi det ikke kommer i kontakt med hjernevæv, det registrerer signalets underskrift, som er sammensat af termisk støj, motion artefakter, og ekstern støj. De store støjkilder i dette system er bevægelses artefakt og kommunikations lyde, der kan styres og timet af loggeren. Disse lyde kan let påvises ved den underskrift, de pålægger signalet fra reference elektroden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15 blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1x3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1x3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate			See Figure 2
2x6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50 µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement - GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 min curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250 µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.