Summary
Nós descrevemos uma plataforma que utilize uma biblioteca de Escherichia coli resistente antibiótico isogênicos para o desreplicação dos antibióticos. A identidade de um antibiótico produzido por bactérias ou fungos pode ser deduzada pelo crescimento de E. coli expressando seu respectivo gene de resistência. Esta plataforma é economicamente eficaz e tempo-eficiente.
Abstract
Um dos principais desafios na busca de novos antibióticos a partir de extratos de produtos naturais é a re-descoberta de compostos comuns. Para abordar esse desafio, a dereplicação, que é o processo de identificação de compostos conhecidos, é realizada em amostras de interesse. Os métodos de desreferência, como a separação analítica seguida por espectrometria de massas, são demorados e com uso intensivo de recursos. Para melhorar o processo de dereplicação, desenvolvemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP). O ARP é uma biblioteca de aproximadamente 100 genes da resistência antibiótica que foram clonados individualmente em Escherichia coli. Esta coleção de estirpe tem muitas aplicações, incluindo um método rentável e facile para a dereplicação de antibióticos. O processo envolve a fermentação de micróbios de produção de antibióticos na superfície de placas de Petri retangulares contendo meio sólido, permitindo assim a secreção e difusão de metabólitos secundários através do meio. Após um período de fermentação de 6 dias, a biomassa microbiana é removida e uma fina sobreposição de agar é adicionada à placa de Petri para criar uma superfície lisa e permitir o crescimento das cepas do indicador e. coli . Nossa coleção de cepas de ARP é fixada na superfície do prato de Petri contendo antibióticos. A placa é incubada em seguida durante a noite para permitir o crescimento de E. coli na superfície da sobreposição. Apenas cepas que contenham resistência a um antibiótico específico (ou classe) crescem nesta superfície, possibilitando a rápida identificação do composto produzido. Este método tem sido usado com sucesso para a identificação de produtores de antibióticos conhecidos e como um meio para identificar aqueles que produzem novos compostos.
Introduction
Desde a descoberta da penicilina em 1928, os produtos naturais derivados de microrganismos ambientais provaram ser uma fonte rica de compostos antimicrobianos1. Aproximadamente 80% dos antibióticos do produto natural são derivados de bactérias do gênero Streptomyces e outros Actinomycetes, enquanto os 20% restantes são produzidos por espécies fúngicas1. Alguns dos andaimes antibióticos mais comuns utilizados na clínica, como os β-lactams, tetraciclinas, rifamicinas e aminoglicosídeos, foram originalmente isolados de micróbios2. No entanto, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes (MDR), nosso atual painel de antibióticos tornou-se menos eficaz no tratamento3,4. Estes incluem os patógenos "ESKAPE" (i.e., enterococos resistentes à vancomicina e Staphylococcus aureusresistentes a β-lactâmicos, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniie Enterobacter SP.), que são um subconjunto de bactérias consideradas associadas ao maior risco por um número de grandes autoridades de saúde pública, como a Organização Mundial da saúde3,4,5. O surgimento e a disseminação global desses patógenos do MDR resultam em uma necessidade constante de novos antibióticos3,4,5. Lamentavelmente, as duas últimas décadas demonstraram que a descoberta de novos antibióticos a partir de fontes microbianas é cada vez mais difícil6. As abordagens atuais para a descoberta de drogas incluem a triagem de alto débito de compostos bioativos, incluindo bibliotecas de extração de produtos naturais, permitindo que milhares de extratos sejam testados em um determinado momento2. No entanto, uma vez detectada a atividade antimicrobiana, o próximo passo é analisar o conteúdo do extrato bruto para identificar o componente ativo e eliminar aqueles que contenham compostos conhecidos ou redundantes7,8. Este processo, referido como dereplication, é vital para prevenir e/ou reduzir significativamente o tempo gasto na redescoberta de antibióticos conhecidos7,9. Embora um passo necessário na descoberta de medicamentos de produto natural, a desreferência é notoriamente trabalhosa e intensiva de recursos10.
Desde que Beutler et al. primeiro cunhou o termo "dereplicação", esforços extensivos têm sido feitos para desenvolver estratégias inovadoras para a rápida identificação de antibióticos conhecidos11,12. Hoje, as ferramentas mais comuns utilizadas para a dereplicação incluem sistemas cromatográficosanalíticos, comocromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e métodos de detecção baseados em ressonância magnética nuclear11,13. Infelizmente, cada um desses métodos requer o uso de equipamentos analíticos caros e interpretação de dados sofisticados.
Na tentativa de desenvolver um método de desreferência que pode ser realizado rapidamente sem equipamento especializado, estabelecemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP)10. O ARP pode ser usado para a descoberta de adjuvantes antibióticos, o perfilamento de novos compostos antibióticos contra mecanismos de resistência conhecidos, e a desreferência de antibióticos conhecidos em extratos derivados de actinobactérias e outros micróbios. Aqui, nós nos concentramos em sua aplicação na dereplicação de antibióticos. O ARP utiliza uma biblioteca de cepas isogênicas de Escherichia coli expressando genes de resistência individuais que são eficazes contra os antibióticos mais comumente redescobertos14,15. Quando a biblioteca de e. coli é cultivada na presença de um organismo produtor de metabolito secundário, a identidade do composto pode ser deduzada pelo crescimento de cepas de e. coli que expressam seu gene de resistência associado10. Quando o ARP foi relatado pela primeira vez, a biblioteca consistiu em > 40 genes conferindo resistência a 16 classes de antibióticos. O modelo de dereplicação original foi projetado para abranger um subconjunto de genes de resistência por classe antibiótica para fornecer informações sobre subclasse antibiótica durante o processo de desreferência. Hoje, o ARP é compreendido de > 90 genes que conferem a resistência a 18 classes antibióticas. Usando nossa extensa coleção de genes de resistência, um modelo de dereplicação secundária foi desenvolvido e é conhecido como a plataforma mínima de resistência a antibióticos (MARP). Este modelo foi criado para eliminar a redundância genética e simplesmente fornecer informações sobre a classe geral de antibióticos que um metabolito dereplicated está relacionado. Adicionalmente, o modelo de MARP possui o tipo selvagem e uma tensão deficiente hyperpermeable/efflux de e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δBAMBδTolc), comparado à encarnação original do ARP, que somente utiliza a estirpe hiperpermeável. Este aspecto único cria fenótipos adicionais durante a dereplicação, indicando uma capacidade de compostos para atravessar a membrana externa de bactérias Gram-negativas. Aqui, nós descrevemos um protocolo robusto a ser seguido quando dereplicating com o ARP e/ou o MARP, realça as etapas as mais críticas a ser seguidas, e discute os vários resultados possíveis.
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Protocol
1. preparação de E. coli biblioteca de estoques de glicerol (a partir de agar Slants)
- Raia as cepas de ARP/MARP e. coli de inclinações de agar de caldo de lisogenia (lb) em placas de Petri contendo Agar lb e o marcador selecionável apropriado (tabela 1).
- Prepare culturas para cada uma das cepas de E. coli inoculando 3 ml de lb contendo o marcador selecionável apropriado com uma única colônia. Cresça durante a noite em 37 ° c com aeração (250 rpm).
- Combine 800 μL da cultura e 200 μL do glicerol estéril de 80% em um CryoVial de 1,8 mL. Misturar invertendo os tubos 3 − 4 vezes e conservar a-80 ° c.
2. preparação congelada da placa da biblioteca de estoque de ARP/MARP
- Raia as cepas de ARP/MARP dos estoques de glicerol preparados na seção 1 para um novo conjunto de placas de Petri contendo Agar LB e o marcador selecionável apropriado. Cresça durante a noite em 37 ° c.
- Usando a técnica asséptica, pipeta 500 μL do caldo ajustado cátion de Mueller Hinton (MHB) de um reservatório estéril em cada poço de uma placa de poço profundo estéril de 96.
- Com as placas preparadas na etapa 2,1, use uma vara do aplicador para inocular a placa do poço profundo 96 de acordo com o mapa de ARP/MARP (Figura suplementar 1 e suplementar Figura 2). Assegure-se de que o marcador selecionável apropriado esteja adicionado a cada poço. Coloque uma membrana de vedação respirável sobre a superfície da placa de poço profundo e incubar durante a noite a 37 ° c (250 rpm).
- Assegure-se de que não existam poços contaminados referindo-se ao mapa ARP/MARP. Repita se estiver contaminado. Usando um pipettor multicanal, transfira 100 μL de cada poço da placa de poço profundo para uma placa de fundo redonda estéril 96-bem. Repita esta etapa para criar várias placas de biblioteca de estoque congeladas.
Nota: É o melhor preparar pelo menos 5 placas da biblioteca em um momento de manter-se das etapas de repetição 2.1 − 2.4 no caso da contaminação congelada da placa da biblioteca de estoque. - Termine de fazer as placas de biblioteca de estoque congeladas ARP/MARP introduzindo 100 μL de glicerol 50% estéril em cada poço e misture suavemente com pipetagem para cima e para baixo.
- Cubra as placas com selos de alumínio estéreis e assegure-se de que cada poço esteja selado individualmente.
- Número de placas e dedicar apenas uma placa congelada biblioteca de estoque para inocular novos modelos em um determinado momento. Mantenha o restante como back-ups em caso de contaminação congelada da placa da biblioteca de estoque.
- Coloque a tampa da placa na parte superior do selo de alumínio e armazene a-80 ° c.
3. cultura de semente e preparação da placa do Dereplication
- Usando uma vara do aplicador, inocular 3 ml do meio antibiótico de Streptomyces (Sam) (ou o outro meio apropriado para o organismo que está sendo testado) em um tubo de teste que contem um grânulo de vidro estéril (para quebrar-acima o micélio) com a tensão produzindo que deve ser desreferência. Para Streptomyces, raspe delicadamente esporos da superfície de uma colônia.
- Usando o mesmo Stick aplicador de madeira, raia um controle de esterilidade em uma placa de Petri contendo Agar Bennett.
- Incubar a cultura de sementes a 30 ° c com aeração por 6 dias (250 rpm) e incubar a placa de controle esterilidade a 30 ° c por 6 dias.
Nota: Consulte a tabela 2 para Sam e as receitas de mídia de Bennett. As instruções acima são apropriadas para a maioria de Actinomycetes. Alterar a mídia de crescimento, conforme necessário para outras bactérias e fungos. - Prepare placas de dereplicação aspirando 23 mL de agar quente de Bennett em uma pipeta sorológica e dispense 20 mL uniformemente através da superfície de uma placa de Petri retangular (tabela de materiais), deixando o restante do meio na pipeta para evitar formação de bolhas de ar.
Nota: Assegure-se de que a superfície que está sendo usada para derramar placas esteja nivelada e execute esta etapa antes que o agar esfrie demasiado; uma superfície plana é imperativo para a fixação da biblioteca nas próximas etapas. - Gire suavemente a placa até que o meio cubra todas as áreas da placa e não o perturbe até que o agar tenha definido completamente.
- Prepare folhas de membrana de nitrocelulose (tabela de materiais) usando uma tampa de placa de Petri retangular como um modelo de rastreamento para que as folhas caiam na superfície da chapa de dereplicação. Cortar as folhas e autoclave-los em uma bolsa estéril.
Nota: Esta membrana permite que os organismos esporulate em sua superfície, enquanto metabólitos secundários podem ser excretados no meio abaixo. Uma vez crescido, a membrana é removida para fornecer uma superfície limpa para a dereplicação. O ajuste mais próximo que o papel da membrana tem na superfície do agar de Bennett, o limpador o resultado do desreplicação. - Verifique a placa de controle da esterilidade para assegurar-se de que nenhum contaminador esteja atual após 6 dias da incubação. Se livre de contaminação, retire a tampa do prato de Petri retangular e Pipete 200 μL de cultura de semente na superfície do agar de Bennett.
- Espalhe uniformemente a cultura através da superfície da placa inteira usando um cotonete de algodão estéril.
- Coloc a membrana da nitrocelulose preparada na etapa 3,6 sobre a parte superior da cultura na superfície do prato de Petri. Comece alinhando a borda inferior da membrana à borda inferior da placa de Petri e aplique lentamente a membrana da borda inferior à borda superior da chapa.
- Use um cotonete de algodão estéril para suavizar quaisquer bolhas de ar que possam ter formado entre a interface membrana-Agar, assegurando que a membrana esteja nivelada com o agar.
- Coloque a tampa de volta na placa de Petri retangular e colocá-lo de cabeça para baixo em um saco de plástico selado. Incubar a 30 ° c durante 6 dias.
4. dereplication placa MHB Overlay e ARP/MARP biblioteca placa de preparação
- Após 6 dias, retire a placa de dereplicação da incubadora de 30 ° c. Usando pinças estéreis (esterilizados ou pulverizados completamente com 70% de etanol), Retire cuidadosamente a membrana de nitrocelulose da superfície do agar de Bennett.
Nota: Esta etapa removerá os esporos hidrofóbicos e os micélios cultivados na superfície da membrana para fornecer uma superfície limpa para a desreferência, facilitando a etapa 4,2. - Como descrito para a etapa 3,4, assegure-se de que a superfície de trabalho esteja nivelada e use uma pipeta sorológicos para aspirar 23 ml do agar MHB ajustado catito morno. Crie uma sobreposição distribuindo 20 mL uniformemente pela superfície da placa de desreferência, deixando o restante do meio na pipeta para evitar a formação de bolhas de ar.
- Gire delicadamente a placa até que o meio cubra todas as áreas e não o perturbe até que o agar esteja ajustado completamente. Uma vez que esfriou e solidified, retorne a placa do desreplicação ao saco de plástico selado e armazene-a de cabeça em 4 ° c durante a noite.
Nota: Esta etapa permite a difusão de metabólitos secundários do meio fermentado de Bennett na sobreposição de agar MHB. Se a membrana de nitrocelulose não foi preparada corretamente, haverá crescimento de esporos em torno das bordas da placa, que têm propriedades hidrofóbicas que repelem o agar MHB. Não despeje a sobreposição em cima desses esporos porque pode resultar em contaminação da sobreposição. - No mesmo dia em que a sobreposição é derramada, inocular um modelo de ARP/MARP fresco introduzindo 100 μL de MHB ajustada de cátion em cada poço de uma placa de 96 poços.
Nota: Para reduzir a possibilidade de espalhar a contaminação durante o desreplicação, use uma única placa da biblioteca ARP/MARP para anular somente placas do desreplicação 2 − 3. Portanto, inocular bastante 96-bem ARP/MARP placas com base no número de cepas que serão dereplicated. - Pegue a placa de biblioteca ARP/MARP de estoque congelado do congelador-80 ° c. Retire o selo de alumínio antes que a condensação comece a se formar em sua parte inferior, diminuindo assim a chance de contaminar poços vizinhos na placa da biblioteca.
- Usando estéril 96-bem fixando ferramentas (ou outras formas de equipamento de inoculação), cuidadosamente fixar a partir do estoque congelado ARP/MARP placa da biblioteca e inocular o fresco MHB-contendo 96-bem placas. Para minimizar a contaminação durante o desreplicação, prepare tantas como placas da biblioteca de ARP ou de MARP necessárias para cancelar somente placas do desreplicação 2 − 3 por a placa da biblioteca. Esterilizar as ferramentas de fixação entre a inocular cada placa.
- Coloque um novo selo de alumínio estéril no modelo congelado uma vez completo e devolva-o ao congelador-80 ° c. Coloc as placas 96-well inoculadas dentro de um saco de plástico selado e incubar em 37 ° c com aeração (250 rpm) para 18 h.
Nota: As placas congeladas novas da biblioteca de estoque podem ser preparadas desta etapa depois de assegurar-se de que nenhuma contaminação esteja atual. Adicione o glicerol à placa antes de armazenar a-80 ° c conforme descrito na etapa 2,5.
5. dereplicating usando o ARP/MARP
- Remova o modelo ARP/MARP da incubadora e assegure-se de que nenhum contaminador esteja atual. Sempre dereplicate usando um modelo que é preparado recentemente e não diretamente do estoque congelado.
- Retire as placas de desreferência a partir de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. Se houver condensação, abra as tampas e deixe secar em um ambiente estéril.
- Usando ferramentas de fixação estéreis (ou outro equipamento de inoculação), fixar da placa da biblioteca ARP/MARP na superfície da sobreposição de agar MHB das placas de desreferência. Tenha cuidado para não furar o agar. Esterilizar as ferramentas de fixação entre a inoculação de cada placa de desreferência.
- Depois de fixar o modelo na superfície das placas de desreferência, permita que o modelo de inoculação seque por 3 − 5 min. Coloque as placas de desreferência inoculadas de cabeça para baixo em um saco plástico selado e incubar durante a noite a 37 ° c.
- Analise os resultados do desreplicação no dia seguinte comparando o crescimento na placa de desreferência aos poços que correspondem ao mapa ARP/MARP (tabela 3 e tabela 4).
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Representative Results
Os seguintes resultados foram obtidos quando uma coleta de cepas produtoras de antibióticos de interesse foi desreferência utilizando o ARP e/ou MARP.
Um diagrama do fluxo de trabalho de dereplicação ARP/MARP é representado na Figura 1, e os mapas da placa de biblioteca são mostrados na figura 1 suplementar e na Figura 2 suplementar. A Figura 2 demonstra um resultado de dereplicação positiva em que o extrato ambiental wac 8921 é identificado como um produtor de cloranfenicol. A Figura 3 mostra a falta de crescimento do ARP inteiramente, o que indica a presença de um antibiótico desconhecido ou um antibiótico menos comumente encontrado que não é contabilizado na placa da biblioteca ARP/MARP. A Figura 4 demonstra um padrão de crescimento que é exclusivo do MARP devido à sua utilização de ambos os tipos tipo selvagem e . coli BW25113 e um mutante deficiente hiperpermeável e efluxo e . coli BW25113 δBAMBδTolc. Este resultado sugere a presença de um composto com atividade antimicrobiana que não consegue ultrapassar uma membrana externa intacta. A Figura 5 mostra um padrão de crescimento de e. coli que sugere a esterilização inadequada das ferramentas de fixação e a Figura 6 mostra um exemplo de contaminação da placa de biblioteca de estoque congelado ARP/MARP. A Figura 7 demonstra o que acontece se a sobreposição de agar for perfurada durante a dereplicação. Por fim, a Figura 8 mostra a contaminação relacionada à sobreposição de MHB que pode ocorrer durante o processo de dereplicação.
Figura 1: um esquema do processo de dereplicação. A estirpe de produção a ser dereplicated é com listras em um prato de Petri retangular como um gramado e uma membrana da nitrocelulose é coloc na parte superior. A placa é incubada então por 6 dias onde a produção-tensão relacionou a biomassa cresce na superfície da membrana quando e os Metabolites secundários produzidos são segregados nos meios do prato de Petri. Após um período de fermentação de 6 dias, a membrana é removida e uma sobreposição de MHB é adicionada à superfície dos meios que contêm antibióticos para fornecer uma superfície lisa para fixar. A biblioteca de ARP/MARP E. coli , que é arranjada em um formato da placa 96-well de acordo com os mapas ARP/MARP, é fixada então na superfície da sobreposição. Depois de incuar a bandeja durante a noite a 37 ° c, o crescimento de cepas de E. coli expressando genes de resistência específicos indica a identidade do composto produzido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dereplicação de um antibiótico conhecido. A estirpe de produção WAC 8921 foi dereplicated usando o modelo ARP. Crescimento de E. coli BW25113 δBAMBδTolc pGDP1:Cat na superfície da sobreposição de agar MHB indica que WAC 8921 é um produtor de cloranfenicol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dereplicação de um antibiótico desconhecido. A estirpe de produção WAC 9941 foi dereplicated usando o modelo ARP. Uma falta do crescimento da biblioteca de E. coli foi considerada na superfície do prato de Petri retangular, indicando que o wac 9441 está produzindo um composto antimicrobial desconhecido ou um antibiótico raro que não seja CONTABILIZADO no ARP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: identificação de um composto antimicrobiano que não pode atravessar uma membrana externa intacta. A estirpe de produção WAC 4178 foi dereplicated usando o modelo de MARP. As estirpes de e. coli BW25113 são capazes de crescer na superfície dos meios que contêm metabolito secundário, enquanto todas as estirpes de e. coli BW25113 δBAMBδTolc não podem crescer. Isso sugere que o WAC 4178 está produzindo um composto antimicrobiano que não pode atravessar uma membrana externa intacta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: contaminação devido a ferramentas de fixação não estéreis. A estirpe de produção WAC 7094 foi dereplicated usando o modelo ARP. A presença de crescimento da biblioteca de e. coli em áreas que não possuíam uma cepa de e. coli designada sugere que as ferramentas de fixação utilizadas para inocular a sobreposição de agar MHB do prato de Petri Retangular não foram devidamente esterilizadas. Isso resulta na transferência de cepas de E. coli desconhecidas em toda a sobreposição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: contaminação devida a um modelo de ARP/MARP de estoque congelado contaminado. A estirpe de produção WAC 3683 foi dereplicated usando o modelo ARP. Três colônias distintas de e. coli cresceram na superfície retangular do prato de Petri: dois correspondem com e. coli BW25113 δBAMBδTolc expressando stat, uma enzima da resistência do streptothricin, e o outro corresponde a e. coli BW25113 δBAMBδTOLC expressando vim-2SS, uma enzima de resistência β-lactâmico. Devido à falta de replicar o crescimento da colônia de blaVIM2ss , além da falta de resistência cruzada conhecida por ocorrer entre essas duas classes de antibióticos, pode-se supor que uma cepa diferente de E. coli δBAMBδ tolC pGDP1: blaVIM2ss está crescendo na placa congelada respectiva da biblioteca bem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: sobreposição de agar MHB perfurado. A estirpe de produção WAC 5106 foi dereplicated usando o modelo ARP. Esta cepa foi encontrada como produtora de estreptomicina, conforme indicado pelo crescimento de E. coli BW25113 δBAMBδTolc pGDP3:APH (6)-ia. Furos de punção podem ser vistos na superfície da sobreposição de agar MHB ao longo do perímetro da placa. Embora isso não afete os resultados da desreferência, ele pode tornar os dados difíceis de interpretar à primeira vista. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: contaminação da sobreposição do agar MHB. O agar MHB contaminado produz um padrão de crescimento irregular na superfície da sobreposição que se torna visível após a incubação da placa durante a noite a 37 ° c. Embora o crescimento de E. coli ainda possa ser visível através da contaminação, é aconselhável repetir o experimento antes de extrapolarem os dados da placa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Plasmídeo | Marcador selecionável |
| pGDP1 | Canamicina 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ampicilina 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| Nenhum | - |
Tabela 1: marcadores selecionáveis utilizados na série de plasmídeo pGDP. Raia as cepas de ARP/MARP E. coli em pratos de Petri de agar lb contendo o marcador selecionável apropriado na concentração direita para cada plasmídeo.
| Mídia | Ingrediente | Quantidade |
| Sam | Glicose | 15 g de |
| Peptona de soja | 15 g de | |
| Nacl | 5 g de | |
| Extrato de levedura | 1 g de | |
| CaCO3 | 1 g de | |
| Glicerol | 2,5 mL | |
| ddH2O | A 1 L | |
| O Bennett | Amido de batata | 10 g de |
| Ácidos casamino | de 2 g | |
| Extrato de levedura | 1,8 g | |
| Mix mineral Czapek | 2 mL de | |
| Agar (opcional) | 15 g de | |
| ddH2O | A 1 L | |
| Mix mineral Czapek | Kcl | 10 g de |
| MgSO4∙ 7h2O | 10 g de | |
| NaNO3 | de 12 g | |
| FeSO4∙ 7h2O | 0,2 g | |
| HCl concentrado | 200 μL | |
| ddH2O | Para 100 mL |
Tabela 2: receitas para a mídia de Sam e Bennett, e Mix mineral Czapek. Ajuste SAM e Bennett para pH 6,8 antes de autoclavagem, e filtro esterilizar a mistura mineral Czapek.
| Classe antibiótica | Antibiótico | Gene da resistência | Estirpe de E. coli | Posição do poço |
| Aminoglicosídeos | Estreptomicina | APH (3 ' ')-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 |
| 2-desoxistreptamina | o rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3, C10 | |
| Apramicina | apmA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | |
| Espectinomicina | APH (9)-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | |
| β-lactâs | Penicilina | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 |
| Cefalosporina | ||||
| Carbapenam | ||||
| Lincosamidas | Lincosamidas | o ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 |
| Macrolídeos | Macrolídeos | o ermC | ||
| Estreptograminas tipo B | Estreptograminas tipo B | o ermC | ||
| Tipo A estreptograminas | Tipo A estreptograminas | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 |
| Streptothricin | Streptothricin | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetraciclinas | Tetraciclina | Tet (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Cloranfenicol | Cloranfenicol | Gato | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Rifamicinas | Rifamicinas | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| Polimixinas | Polimixinas | MCR-1 | selvagem-tipo BW25113 | C6, F7 |
| Echinomycins | Echinomycins | uvrA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 |
| Sideromycins | Albomicina | mutante do fhuB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| Tuberactinomycins | Viomicina | VPH | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 |
| N/A | N/A | N/A | selvagem-tipo BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabela 3: tabela da designação do poço para as tensões mínimas de ARP. Esta tabela indica que poço de uma placa 96-well que cada um das tensões mínimas de ARP pode ser encontrada em de acordo com o mapa mínimo da placa da biblioteca ARP. A tabela igualmente alista que classe antibiótica cada Gene confere a resistência a. Por favor, note que alguns genes podem conferir resistência a mais de um antibiótico dentro da classe antibiótica dada.
| Classe antibiótica | Antibiótico | Gene da resistência | Estirpe de E. coli | Posição do poço |
| Aminoglicosídeos | Estreptomicina | APH (3 ' ')-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2, G11 |
| APH (6)-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6, F7 | ||
| Espectinomicina | APH (9)-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicina | AAC (3)-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3, H10 | |
| formiga (2 ' ')-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5, H8 | ||
| APH (2 ' ')-ID | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4, H9 | ||
| armA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6, H7 | ||
| AAC (6 ')-APH (2 ' ')-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | ||
| Canamicina | APH (3 ')-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 | |
| APH (3 ')-Illa | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 | ||
| Higromicina | APH (4)-ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6, G7 | |
| β-lactâs | Amoxicilina | TEM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidima | CTX-M-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacilina | OXA-10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7SS | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem | VIM-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 | |
| Lincosamidas | Lincosamidas | o ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| LNU (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | ||
| Macrolídeos | Macrolídeos | o ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| o mphA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 | ||
| o mphB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2, F11 | ||
| Estreptograminas tipo B | Estreptograminas tipo B | o ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| Vgb | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 | ||
| Tipo A estreptograminas | Tipo A estreptograminas | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Streptothricin | Streptothricin | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetraciclinas | Tetraciclina | Tet (M) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5, D8 |
| Cloranfenicol | Cloranfenicol | Gato | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4, A9 |
| Rifamicinas | Rifamicinas | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabela 4: tabela da designação do poço para as tensões de ARP. Esta tabela indica que poço de uma placa 96-well que cada um das tensões ARP pode ser encontrada em de acordo com o mapa da placa da biblioteca ARP. A tabela igualmente alista que classe antibiótica cada Gene confere a resistência a. Por favor, note que alguns genes podem conferir resistência a mais de um antibiótico dentro da classe antibiótica dada.
Complementar Figura 1: mapa da placa de biblioteca usado para o modelo de plataforma de resistência a antibióticos (ARP) original. Organize as respectivas cepas de E. coli em uma placa 96-well usando este formato para garantir que todos os controles e duplicatas necessários sejam incluídos. Este número foi modificado de Cox et al.10. Por favor clique aqui para baixar esta figura.
Figura complementar 2: mapa da placa de biblioteca usado para o modelo mínimo de plataforma de resistência a antibióticos (MARP). Organize as respectivas cepas de E. coli em uma placa 96-well usando este formato para garantir que todos os controles e duplicatas necessários sejam incluídos. Por favor clique aqui para baixar esta figura.
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Discussion
O protocolo descrito acima pode ser aplicado à descoberta de novos compostos antimicrobianos e adjuvantes que podem ser usados em conjunto com os antibióticos existentes para resgatar sua atividade. A plataforma aproveita a especificidade elevada da carcaça de mecanismos da resistência e de seus antibióticos cognato, aos compostos do dereplicate dentro dos extratos naturais crus do produto. Embora o tempo necessário para que as placas de desreferência sejam preparadas seja longa (~ 2 semanas), o processo de dereplicação em si é concluído após um único período de incubação durante a noite, o que é rápido em comparação com o tempo que pode levar para isolar e caracterizar um composto de extratos brutos. Além disso, nenhum equipamento caro ou altamente especializado é necessário, tornando esta plataforma acessível e rentável.
Outro grande benefício desta plataforma é a sua flexibilidade. O ARP pode ser expandido para conter genes de resistência que abrangem mais classes de antibióticos. Isto é conseguido monitorando a literatura para o emergence de enzimas novas da resistência e usando técnicas moleculares básicas do clonagem para adicionar os genes à biblioteca de E. coli . Além disso, o modelo de dereplicação é personalizável com base no nível desejado de especificidade de substrato de faixa ampla ou estreita que um indivíduo deseja usar ao anular a referência. Qualquer combinação de genes na biblioteca de E. coli pode ser usada para fazer novas placas de biblioteca com a capacidade de detectar compostos com perfis diferentes. Por exemplo, uma β-lactamase expressando o modelo de E. coli pode ser desenvolvida para permitir a desreferência altamente específica de β-Lactams e suas diferentes subclasses.
Embora esta plataforma foi inicialmente projetada para desreferência compostos em mídia sólida, ele também foi obras em meios líquidos. Isso é útil quando se trabalha com compostos que já foram purificados em que apenas uma quantidade limitada está disponível para teste, ou quando se trabalha com compostos que não se difusas facilmente ou consistentemente em meios sólidos. Por fim, enquanto este protocolo foi descrito utilizando as cepas de e. coli BW25113 e BW25113 δBAMBδTolc, a plataforma pode ser utilizada com a biblioteca de genes de resistência expressa em diferentes cepas de e. coli (dereplicação fenótipos podem variar). Em última análise, a plataforma de resistência a antibióticos é flexível, tem muitas aplicações, e é vantajoso sobre outros métodos de dereplicação.
Para garantir que Resultados reprodutíveis e não contaminados sejam obtidos, é fundamental seguir as técnicas apropriadas de esterilização e asséptica. A falha fazer assim conduzirá à contaminação das ferramentas da fixação, da placa da biblioteca, ou da placa do desreplicação própria. Enquanto os marcadores selecionáveis estão presentes na biblioteca E. coli , que pode ajudar a evitar a contaminação causada por bactérias que faltam o marcador, não impede a contaminação cruzada de cepas usando o mesmo marcador. Para reduzir o risco deste acontecimento é essencial esterilizar com cuidado as ferramentas de fixação bacterianas antes de fixar da placa da biblioteca. Cada placa da biblioteca deve somente ser fixada de 3 − 4 vezes o máximo antes de descartar para um molde novo. Isto impede a propagação da contaminação através de todas as placas do desreplicação se uma placa da biblioteca se tornar contaminada durante o processo de fixação. Adicionalmente, nenhum antibiótico é usado ao inocular a placa do desreplicação e assim que o cuidado grande deve ser tomado para impedir a contaminação antes que esteja deixado para fermentar por seis dias. Uma outra fonte de contaminação possível está na sobreposição do agar de MHB da placa do desreplicação. Se o suporte de sobreposição estiver contaminado, o crescimento só aparecerá após a incubação durante a noite a 37 ° c após a fixação. A contaminação por sobreposição pode tornar extremamente difícil analisar o crescimento da biblioteca E. coli na superfície de sobreposição. Para reduzir as chances de contaminação de sobreposição, prepare o agar MHB fresco antes de derramar a sobreposição. Recomenda-se que até que um indivíduo seja confortável com este método, as placas do desreplicação devem sempre ser preparadas em duplicado ou triplicado de tal que no caso da contaminação de uma placa, os dados podem ainda ser extraídos do esperançosamente placas não contaminadas.
Por fim, é importante notar que o ARP/MARP tem limitações. Este protocolo não é adequado para a replicação de cepas produtoras que produzem mais de um composto Bioativo. Cada cepa na biblioteca E. coli foi projetada para expressar um único gene de resistência. Se dois antibióticos estão sendo produzidos por um organismo, nenhum gene de resistência conferirá resistência ao segundo antibiótico, resultando assim na morte celular de ambas as cepas. Assim, essa possibilidade deve ser considerada quando os resultados da dereplicação sugerem a presença de um novo antibiótico, pois a produção de antibióticos múltiplos não pode ser detectada pela biblioteca de E. coli de construção única atual. Uma abordagem que pode ser tomada para combater o desafio de desreferência de cepas que produzem mais de um antibiótico envolve o uso do procedimento de plug-ágar descrito no documento ARP original de Cox et al.10. Neste método, uma porção de um meio sólido fermentado é removida de um antibiótico-produtor que contem a placa e coloc em um gramado da tensão do indicador ARP. A cepa indicadora pode ser qualquer uma das cepas resistentes de E. coli na biblioteca ARP. As zonas de inibição são usadas então para comparar a bioatividade de uma produzir-tensão de encontro às tensões de ARP e a uma estirpe do selvagem-tipo. As estirpes ARP que formam uma zona inibitória de tamanho reduzido em comparação com a estirpe do tipo selvagem podem resistir ao composto a ser produzido. Este método provou ser eficaz na identificação de cepas capazes de produzir múltiplos antibióticos10.
Em resumo, para obter os melhores resultados quando dereplicating com o ARP/MARP recomenda-se que as placas do desreplicação estão preparadas em duplicado ou Triplicate. Outras etapas críticas no protocolo incluem a fixação de uma placa de biblioteca fresca (nunca congelada) e removendo tanta biomassa quanto possível da produção-tensão durante a fase de remoção da membrana. Se todas as etapas necessárias são seguidas, uma deve ter resultados de desreplicação bem sucedidos para uma produção-tensão de interesse dentro de um período de duas semanas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa no laboratório de Wright que pertence ao ARP/MARP foi apoiada pelo fundo da pesquisa de Ontário e pelos institutos canadenses da concessão da pesquisa da saúde (FRN-148463). Gostaríamos de reconhecer Sommer Chou para ajudar na expansão e organização da biblioteca ARP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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