Summary
この記事では、レーザードップラー流量測定法を使用して、動脈血圧の低下中に血流を調節する脳循環の能力を評価する。
Abstract
脳血流を調節する身体のメカニズムを調べるとき、レーザードップラー流量測定法(LDF)を用いて微小循環血流の相対的な測定が得られる。本論文では、頭蓋骨を貫通したり、チャンバーや大脳の窓を設置することなく、脳血流を評価できる閉じた頭蓋骨製剤を示す。自動車調節機構を評価するために、等級出血による制御血圧低下のモデルを利用しながら、同時にLDFを採用することができる。これにより、循環血液量の離脱によって生じる動脈血圧の低下に応じて、血流の相対的な変化をリアルタイムで追跡することができます。このパラダイムは、動脈血圧の低下時に脳血流自動調節を研究する貴重なアプローチであり、プロトコルのわずかな変更を伴い、出血性ショックの実験モデルとしても価値がある。LDFは、自律応答の評価に加えて、代謝、筋原性、内皮、体液、または脳血流を調節する神経機構および様々な実験の影響を調べる際の皮質血流を監視するために使用することができる脳血流の介入と病理学的状態。
Introduction
脳循環における自己調節機構は、脳内の恒常性と正常な機能を維持する上で重要な役割を果たす。脳血流の自己調節は、心拍数、血速、灌流圧、脳抵抗動脈の直径、および微小循環抵抗を含む複数の要因によって影響を受け、そのすべてが全身血圧の生理学的範囲にわたって脳内の全脳血流を一定に維持する役割を果たす。動脈圧が上昇すると、これらのメカニズムは、頭蓋内圧の危険な増加を防ぐために動脈および抵抗動脈を収縮させる。動脈血圧が低下すると、局所制御機構は動脈を拡張して組織灌流およびO2送達を維持する。高カプニア、外傷性または世界的な低酸素脳損傷、および糖尿病性微小血管障害1、2、3、4、5、6などの様々な病理学的状態は、その血流を自動調節する脳の能力を破壊する可能性がある。例えば、慢性高血圧は、有効な自制態の範囲を高圧7、8、9にシフトし、高塩(HS)食生活は、脳微小循環10における正常な内皮依存性拡張を妨げるだけでなく、動脈圧が低下した場合に組織の灌流を拡張および維持する脳循環における自制機構の能力を損なう。脳の自動調節はまた、彼らがHS食12を与えられるとき、ダール塩感受性ラットで損なわれる。
動脈圧の低下の間に、脳抵抗性動脈および動脈の拡張は、最初は、灌流圧の低下にもかかわらず、制御値に脳血流を返す。動脈圧がさらに低下するにつれて、血管系が低圧で血流を維持するために拡張できなくなるまで、脳血流は低圧(対指圧応答の高原相)で一定のままである。臓器が正常な血流を維持できる最低圧は、自己調節(LLA)の下限と呼ばれます。LLA以下の圧力では、脳血流は安静値から有意に減少し、動脈灌流圧力13、14の減少のたびに直線的に減少する。LLAの上向きのシフトは、高血圧7、8、9で観察されるように、動脈灌流圧が低下する条件(例えば、心筋梗塞、虚血性脳卒中、または循環ショック)の間に虚血性損傷のリスクおよび重症度を増加させる可能性がある。
LDFは、脳循環11、14、15における血流の自動調節を含む様々な状況下で微小循環中の血流を評価する非常に貴重なアプローチであることが証明されている。LDFは、自律応答の評価に加えて、代謝、筋原性、内皮、体液、または脳血流を調節する神経機構および脳血流に対する様々な実験的介入および病理学的状態の影響を調べる際の皮質血流を監視するために使用することができる。
LDFは、移動粒子の数と速度(この場合は赤血球)に応じて、反射レーザー光のシフトを測定します。脳血管自動調節の研究では、動脈血圧を増加させるためにα-アドレナリン作動異常者の注入のいずれかによって動脈血圧が変化する(脳循環自体がα-アドレナリン血管収縮症に対して感受性が低いため)12、15、または制御された血液量を介して動脈圧を低下させる11、14。本研究では、LDFは、健康なラットにおける脳の自己調節に対する血圧の等級減少の影響を実証するために利用される。文献22、23、24、25に開閉した頭蓋骨の方法が記載されているが、本論文は、頭蓋骨を貫通したり、チャンバーまたは大脳窓を設置することなく脳血流を評価することを可能にする、閉じた頭蓋骨製剤を示す。
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Protocol
ウィスコンシン州立医科大学機関動物利用委員会(IACUC)は、この論文に記載されているすべてのプロトコルを承認し、すべての手順は国立衛生研究所(NIH)実験動物福祉局(OLAW)に準拠しています。規制。
1. 実験動物と記録準備
- 体重250~300gの8~12週齢の雄のスプレイグ・ドーリーラットを使用する。これらの実験では、0.4%NaCl、200 g/kgカゼイン、3 g/kg DL-メチオニン、497.77 g/kg スクロース、150 g/kg コーンスターチ、50 g/kg トウモロコシ油、50 g/kg セルロース、2 g/kg コリン二タルタル酸塩、35 g/kg からなる標準的な食事をラットに与えます。
- データ取得ソフトウェアまたは同等の記録方法を使用して動脈血圧とLDF測定値を記録します。
- 動脈圧トランスデューサを記録システムの一方のチャンネルに取り付け、LDFプローブを記録システムの他のチャンネルに接続します。
- 測定の前に、レーザードップラープローブを校正して運動性基準を設定し、レーザードップラー流量計が安定した出力を提供していることを確認します。
- 予備手術と実験に必要な追加の機器を準備する:解剖顕微鏡、げっ歯類の人工呼吸器、エンド潮汐CO2モニター、ラットの頭部を位置に固定する立体税器具、および骨盤微小循環上のLDFプローブを見つけて安定した位置に維持するマイクロマニピュレータ。
2. 外科的準備
- ラットを計量し、3.5%のイソフルランと30%O2サプリメントで誘導室で動物を麻酔します。
- 誘導室から動物を取り出し、30%O2サプリメントで1.5~3%のイソフルランを送る麻酔マスクを代用します。
- 37°Cに維持された循環水毛布の上にラットを置き、引き出し反射があることを確認するためにつま先ピンチで反射神経をチェックします。角膜乾燥を防ぐために、両眼に無菌眼科軟膏を塗布する。
- 頭蓋骨、腹部の首の領域、および大腿骨の三角形の上部を剃ります。それらの領域から緩い髪を取り除き、アルコールをこしてきれいにします。
- ラットを循環温水ポンプ付きの加熱パッドの上に置き、動物の体温を37°Cに保ち、医療テープを使用してパッドに一時的に固定します。
- 他の26で説明するように、頸部の腹部切開を介して気管カニューレ(PE240ポリエチレンチューブ)を取り付ける。
- 気管カニューレを末端の潮汐CO2モニターと2.5~3.0%のイソルラン(動物の大きさに応じて)と30%O2吸入サプリメントを送出する人工呼吸器に取り付けます。呼吸数、呼吸時間、および分の換気容積が設定され、実験全体を通して約35 mmHgの期限切れのエンド潮汐CO2を確保するために監視されていることを確認してください。
注:これは一般的に、呼吸数が約48~60回、潮量が1.70~2.30mL、250~300gラットのインスピレーションタイムが0.50~0.60sです。 - 凝固を防ぎ、カテーテルの効力を維持するために、アイソトニックNaCl溶液中の1 U/mLヘパリンで2つのPE50ポリエチレンカニューレを充填します。充填後、動脈への挿入を容易にするために、外科的はさみで各カニューレの開いた端をベベル。
- 他の場所27で説明されているように左右の大腿動脈をカニューレし、一方のカテーテルの動脈圧の連続的なモニタリングを可能にし、もう一方のカテーテルから血液を引き出す。
- 解剖顕微鏡で周囲の組織から動脈を慎重に分離した後、動脈の遠位端をリゲートし、結び目を締め付けずに動脈の中央部と近位端の周りに2つの追加縫合糸を配置します。
- カニューレ挿入の切開後の動脈からの出血を防ぐために、近位縫合糸を持ち上げ合字として使用する(ステップ2.11)。
- カニューレが固定されるまで血管を閉塞させるために、動脈の下のペーパークリップから作られたV字型のワイヤーを挿入します。
- 解剖顕微鏡の下でバンナスはさみを使用して遠位ライゲーションの近くの大腿動脈に小さな切開を行う。カニューレのベブエンドを切開部に挿入し、大腿動脈に進めます。中央合字の結び目を締めてカニューレを所定の場所に固定し、リフティング合字またはペーパークリップを取り外したときに動脈圧によって外れないようにします。
- 中央合字が締め付けた後、持ち上がる合字の張力を放し、ペーパークリップを取り外し、近位合字を締めます。
- 細かい縫合糸(3~0シルク)または外科的ステープルで切開部を閉じます。あるいは、切開部位の上に湿ったガーゼを置く。
3. LDF測定のための頭蓋骨の間引き
- カニューレが所定の位置に配置された直後に、動物を胸骨の位置に置き、ステレオタキシック装置で頭部を固定し、カテーテルまたは気管チューブを外さないように注意する。
- 外科的はさみを使用して、頭蓋骨を覆う皮膚に楕円切開を行う。綿棒を使用して結合組織を除去し、頭蓋骨が清潔で乾燥していることを確認します。頭皮の切開部の周りに小さな細長く転がったティッシュペーパーを置き、出血を止めます。
- 解剖顕微鏡では、ドレメルツールまたは2.15mmドリルビットの歯科ドリルを使用して、左または右の体性皮質上の頭頂部の小さな骨領域(ラットの大きさに応じて約0.5〜1cm)を薄くします。
注意:頭蓋骨が浸透しないように、骨をゆっくりと慎重に薄くしてください。このステップを実行している間、生理線溶液は、領域が過熱するのを防ぐために自由に適用する必要があります。 - 頭蓋骨が薄くなり、その領域がピンク色の外観を持ち、血管が可視化されたら、ミネラルオイルで領域を覆い、マイクロマニピュレータを使用してレーザードップラープローブを露出した脳微小循環の上に配置し、プローブの先端が鉱物油のプールの上部に触れるだけです(図1)。
メモ:レーザードップラーの測定値を妨げる外部振動がなく、実験全体を通して同じターゲット領域にプローブがしっかりと固定されている領域でLDF測定を行う必要があります。
4. 脳血管自動調節の評価
- LDFプローブの位置が固定されたら、実験を開始する前に30~45分の平衡期間を取り込む。平衡期間後、平均動脈圧(MAP)とレーザー大脳血流(LCBF)を30s毎に2分間測定し、その値を平均して前出血血圧とLCBFのベースライン値を求める。
- 動脈圧低下に応じて脳血管の自己調節を評価するために、大腿動脈11からの血液の1.5mLの連続的な引き出しに続いてLCBFおよびMAPを測定する。カテーテル特許を保つために、ヘパリン溶液の体積(等張性生理行で100 U/mL)が各血液の引き出し後にカテーテル容積とほぼ等しいことを確認します。
注:カテーテルのパテンシーを維持するためにヘパリン溶液を注入する場合、ヘパリン溶液の体積をカテーテルの体積にできるだけ近づけて、動物があまりにも多くのヘパリンを受け取るのを防ぐことが重要であり、これは望ましくない原因となる可能性があります出血。 - 各血液量の離脱後、ラットが2分間平衡化し、その後MAPとLCBFが30sごとに2分間記録されます。
- 前出血MAPからLLAまでの血圧の範囲を特定することによって、有効な自動調節範囲を決定する(下記のステップ4.5および5.3)。
- LCBFがまだ血液量離脱後の前の出血制御値の20%以内に戻る最低圧力を特定することによってLLAを決定するか、または自動調節の高原段階で決定された回帰直線の交点を特定し、LLAの下でLCBFが連続する血液離脱のたびに減少する(ステップ5.3、以下)。
注:LLAおよびauto調節高原を定義するための基準は、実験室(例えば、高田ら28対ジョーンズら29)と動脈血圧を低下させる手順(例えば、特定の動脈圧レベルに達するために特定の血液量対制御出血の離脱)11とによって異なる可能性がある。 - 実験の終わりに、IACUCによって承認された麻酔の外科平面の下で両側気胸を作成することによって動物を安楽死させる。
- 動物が安楽死した後に組織で得られたLDF値は、実験セットアップのためのゼロベースラインフロー値を提供するであろう。
5. 統計分析
- 線形回帰分析を実行して、LDF 値とそれに対応する動脈圧との相関関係を評価します。動物が安楽死した後に得られたベースラインLDF測定値を使用して、測定された流量に影響を与える非特異的LDF信号がないことを確認します。
- 自動調節プラトーの上下の回帰直線間の交点を使用して LLA を計算します。この方法を使用して LLA を計算するには、2 つの回帰式を組み合わせて、動脈圧の結果の方程式を解きます。
- 異なる実験群を比較する場合は、線形回帰分析を使用して、各動物のLLAの上下のLDFと動脈圧関係の傾きを計算し、その実験群の動物に対して平均±SEMとして集計します。
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Representative Results
図2は、10匹の男性スプレイグ・ドーリーラットに与えられた標準的な実験室チャウで行われた実験の結果をまとめたものである。これらの実験では、平均LCBFは、平均動脈圧がLLAに達するまで、最初の3つの血液量の引き出しに続く前出血値の20%以内に維持された。LLA以下の圧力でのその後の血液量の引き出しは、LCBFの進行性の低下を引き起こし、脳循環が低い灌流圧力で一定の脳血流を維持するのに十分なレベルの血管拡張を生成することができなくなったことを示した。
図3は、高原相における平均動脈圧とLCBFとCBF自動調節の代償相(MAP <65 mmHg)との関係をまとめたものである。LLA以上の圧力では、LCBFと動脈圧との間に有意な相関関係はなかった(r2 =0.0246;p=0.3534)。LCBFが自主調節曲線の高原範囲における動脈圧に依存しないことを示す。LLAの下では、LCBF/動脈圧関係は負の傾きを有し、LCBFは動脈圧と有意に相関していた(r2 = 0.7907;p = 8.7 x 10–25)。
図1:麻酔ラットの薄い頭蓋骨上のレーザードップラープローブの配置LDFプローブを持つ立体装置のラットは、頭蓋骨の薄い領域の上に配置され、マイクロマニピュレータで所定の位置に保持される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:動脈血圧の出血誘発減少に対する脳血流の自己調節ラットにおける血液量離脱と(A)と(A)の動脈圧(MAP)と(B)レーザー脳血流(LCBF)との関係を要約すると、標準的な食事を与え、逐次的な血液量の引き出しを受けた。各血液量離脱後にn=6~10の平均±SEMとして示されるデータ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:平均動脈圧とレーザー脳血流との関係自主調節応答の高原相(n=37観察)と応答の代償段階(n=70観察)における関係が示され、動脈圧がLLA(〜65mmHg)を下回った。LCBFは、自動調節の代償段階(r2 = 0.7907;p = 8.7 x 10–25)でMAPと高度に相関していましたが、自動調節の高原段階(r2 = 0.0246;p = 0.3534)では相関しませんでした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
レーザードップラーフローメトリー(LDF)による組織血流応答の評価上述したように、LDF信号は、移動粒子の数および速度に比例し、この場合RBCは、微小循環において行う。異なる器官におけるLDF測定値は、電磁流量計および放射性微小球30などの確立された方法によって評価される全臓器血流と十分に相関しており、一般に、カニューリン状動脈製剤10、31、32、33、34および上述微小循環製剤35、36における活性トーンの調節を評価する研究と一致する。
脳の自己調節、およびおそらく他の血管床の自己調節の研究を行う際の1つの考慮事項は、自己調節応答に麻酔の潜在的な影響です。脳の自動調節は現在の研究および我々のグループ11による以前の研究において存在し、脳抵抗性動脈31、32、37の血管拡張反応に対するHS食事の既知の影響と一致したが、ラットp ハムスター頬パウチ36の上動脈動脈35および上皮動脈は、アイソフルラン麻酔が強い血管拡張剤効果を有し、心血管抑制を引き起こすことが報告されている39.アイソフルランはまた、マウス40、41で脳血管の自己調節の喪失を引き起こすことが報告されているので、一部の研究者は、単独で、またはウレタン42と組み合わせてα-クロラロース麻酔を使用して、代わりに脳の自己調節を研究している。
RBCの数と速度は、マイクロサーキュリーベッド内、個人間、および時間の経過とともに個々の被験者内で変化します。したがって、LDFは、臓器またはその微小循環内、異なる器官間、または微小循環の異なる領域における血流の絶対値を提供しない。したがって、LDFプローブが同じ位置にとどまり、実験全体を通して振動を受けないようにしっかりと固定することが不可欠です。脳血流の変化を正確に評価するために、ラットの頭部は立体運動器具に配置され、LDFプローブは頭蓋骨の薄い領域上のマイクロマニピュレータに保持され、運動アーティファクトを防止し、研究対象領域に対するプローブの位置を維持する(図1)。プローブの初期部位から離れた任意の動きは、組織の異なる領域で血流によって決定されるシグナルを生成し、比較を妨げる。LDFは絶対血流の測定を提供しないが、適切に行われると、血管床30全体のレベルで血流の調節を評価する上で便利で貴重なアプローチであり、対照値に対するLDF流れの相対的な大きさの増加または減少を統計的に比較することができる。
脳血流の自動調節脳循環は通常、動脈圧が上昇したときに血管収縮を引き起こす動脈血圧の大きな変化を許容し、動脈圧が自己調節機構によって動脈圧が低下すると血管拡張を引き起こす。これらのメカニズムは、全身血圧が上昇したときに頭蓋内圧の危険な増加を防ぎ、動脈圧が低下したときに十分な組織灌流と酸素供給を維持するために非常に重要である。本実験は、動脈圧が低下するにつれて脳血流を一定に維持する自動調節機構の能力に着目した(MAPが増加するにつれて一定の血流を維持する脳循環の能力ではなく)が、LDFは非常に貴重であり、後者の研究にも広く用いられている。この実験計画のもう一つの貴重な応用は、出血中および循環ショック43、44、45、46の様々な形態で微小血管血流を研究することです。
動脈圧の出血誘発減少時のLCBFの自己調節は、各血液離脱後に2分を測定したLDFフローとMAPを、血液量離脱直前に測定した前出血制御MAPおよびLCBFと比較することによって評価される。この時点で、autoautoyのメカニズムは、より低い灌流圧力で血流を維持するために微小血管系を拡張するように作用しているであろう。LLAは、灌流圧力の低下にもかかわらず、auto調節機構が血流を回復できる最も低いMAPとして識別されます。LLA以下の動脈圧では、自制機構は限界に達し、脳血流のさらなる低下を防ぐのに十分なほど大脳血管系を拡張できなくなりました。LLAが通過した後、新しい圧力11に達するために血液の各引き出しに続く前出血値からのLCBFの有意かつ進行性の低下がある。動脈血圧の低下に応じた脳血管自動調節の有効性は、LLAの前後の動脈圧関係と自動調節の高原相の幅をLCBFの傾きと自己調節の幅と比較することによって評価され、前出血MAPとLLAとの間の動脈圧範囲として定義される。例えば、脳自己調節11に対するHSダイエットの効果を評価する最近の研究では、40〜50mmHgの低い値に動脈圧の持続的な低下の間に低塩(LS;0.4%NaCl)食塩を与えられたラットにおいて、脳血流が一定のレベルで維持されていることがわかった。この知見は、健康なラット16、47におけるLLAの以前の推定と一致する。しかしながら、ノルモテンシブ・スプレイグ・ドーリーラットにおける脳血流自動調節の高原相は、短期(3日)および慢性(4週間)の高塩(HS; 4%NaCl)食事は、動脈圧の連続的な減少に伴って徐々に減少し、HS食は、正常な規範的ラットに通常存在する血流調節の高原相を排除し、血圧11の低下に直面して組織灌流を維持する脳循環の能力に悪影響を及ぼすことを示す。HS食餌を与えたラットにおいて脳血流の自己調節が損なわれることの知見は、食塩の増加が抵抗性動脈31、32、33、34、37、動脈35、36の規範的ラットおよびハムスターの弛緩を損なうことを示す研究の結果と一致している。
微小循環が血流を自動調節する能力に関する貴重な洞察を提供することに加えて、LDF測定は、微小球や電磁気流プローブなどの従来の方法では利用できない血流制御の動的な推定を提供する幅広い用途で採用することができます。例えば、LDF測定は、ACh注入および他の血管活性剤の投与などの血管活性化刺激に対する微小循環の応答を評価する上で非常に貴重である31,32,33,34,37, 高い動脈pCO210, 低酸素17,48, 神経血管結合に応答して官能刺激21,49, 機能機能脳20における充血は、出血性低血圧ストレスおよび様々な種類の循環ショックに対する組織応答を評価する43、44、45、46である。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
著者たちは、この研究を完了し、原稿を準備する際に彼らの優れた支援をしてくれたカリー・コザック、メーガン・スタンプ、ジャック・ブルリスに心から感謝しています。補助金サポート: NIH #R01-HL128242、#R21-OD018309、および #R21-OD024781。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 braided black silk suture | Midwest Vet | 193.73000.2 | |
| Arterial Pressure Transducer | Merit Medical | 041516504A | |
| Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system) | DATAQ Instruments | ||
| Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
| Circulating warm water pump | Gaymar Industries | T-pump | |
| End-tidal CO2 monitor | Stoelting | Capstar-100 | |
| Heparin Sodium | Midwest Vet | 191.46720.3 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Laser Doppler Flow Meter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| Laser Doppler Refill Motility Standard | Perimed | PF1001 | |
| Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula) | VWR | 63018-828 | |
| Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters) | VWR | 63019-048 | |
| Rodent Ventilator | Cwe/Stoelting | SAR-830/P | |
| Saline | Midwest Vet | 193.74504.3 | |
| Sprague-Dawley Outbred Rats | Variable | N/A | Rats were ordered from various companies |
| Standard Rat Chow | Dyets, Inc. | 113755 | |
| Stereotaxic Instrument | Cwe/Stoelting | Clasic Lab Standard |
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