מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד
במאמר זה
סיכום
תקציר
החיים מחולק למחיצות בתוך קרום השומנים כדי לאפשר היווצרות מבודדת של מצבים מולקולריים ברורים בתוך תאים ואורגלים. Fusion תא הוא מיזוג של שני תאים או יותר כדי ליצור תא בודד. כאן אנו מספקים פרוטוקול למיזוג תאים של שני סוגי תאים שונים. תאים היברידית התמזגו מועשרים על ידי מיון cy, מבוססי הזרמת הזרם, ואחריו מיקרוסקופ פלואורסצנטית של מבנה תאים היברידית ותפקוד. פלואור שתייגת חלבונים שנוצרו על ידי עריכת הגנום הם התמונה בתוך תאים התמזגו, המאפשר מבנים סלולריים להיות מזוהה מבוסס על פליטת הזריחה והפניה בחזרה לסוג התא של המקור. השיטה האיתנה והכללית יכולה להיות מוחלת על סוגי תאים שונים או על-ידי אורגלים של עניין, להבין את המבנה התאי והתפקוד על-פני מגוון של שאלות ביולוגיות בסיסיות.
מבוא
הומסטטי תחזוקה של מבנה הסלולר הוא קריטי לחיים. לתאים יש מורפולוגיות אופייניות, מספרי משנה-תאית וקומפוזיציה ביוכימית פנימית. הבנת האופן שבו מאפיינים בסיסיים אלה נוצרים וכיצד הם משתבש במהלך המחלה מחייב כלי מעבדה כדי לperturb אותם.
Fusion תא הוא המיזוג בין שני תאים נפרדים או יותר. היתוך תא אולי היה קריטי הופעתה של חיים איקריוטית1. בגוף האדם, פיוז'ן התא הוא נדיר יחסית, המתרחשים בנסיבות התפתחותיות מוגבלות סוגי רקמות, כגון במהלך הפריה או היווצרות של שריר, עצם השליה2. פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של היתוך תא התא בקווי תרבות של רקמה עם שורות מפורטות בצורה מסודרת, ככלי להבנת המנגנונים השולטים במבנה ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תא פלורסנט משלים התיוג
- התיוג הגנטי עם Cas9
- השתמש ב-CRISPR Cas9 הגנום עריכה לתייג שורטלטין (או גנים אחרים של עניין) עם חלבונים פלורסנט meGFP או mScarlet-I בתאי הסרטן האנושי.
הערה: פרוטוקולים מפורטים עבור עריכת הגנום מכוסים במקום אחר24,25,26.
- השתמש ב-CRISPR Cas9 הגנום עריכה לתייג שורטלטין (או גנים אחרים של עניין) עם חלבונים פלורסנט meGFP או mScarlet-I בתאי הסרטן האנושי.
- תוויות צבע פלורסנט
- לגדול Cal51 תאים סרטניים אנושיים במדיום שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עוברי (FBS), L-גלוטמין, ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° צ' ו 5% CO2 באינקובטור מחולל.
הערה: חשוב לוודא כי התאים נבדקים באופן ק....
- לגדול Cal51 תאים סרטניים אנושיים במדיום שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עוברי (FBS), L-גלוטמין, ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° צ' ו 5% CO2 באינקובטור מחולל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאים מסומנים כראוי גלויים במהלך הזרימה cy, לנסות על ידי אות פלואורסצנטית גבוה יותר מאשר בתאי בקרה בלתי מסומן (איור 2א). גייטס מוגדר למיון תאים חיוביים כפולים, העשרת האוכלוסייה הזאת ישירות לתוך מנות הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. תאים התמזגו הם לזיהוי ברורים כפול פלואורוסקופים תאים חיוביים ומהווים כ-~ 1% מהאוכלוסייה.
פיוז'ן גורם לסידור מחדש של האדריכלות התאית באמצעות ערבוב של שני תאים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מדגימים נתיישב ופרוטוקול חסכוני עבור תאים פיוזינג ומדמיין את הארכיטקטורה הבאה של תאים היברידיות עם מיקרוסקופ, לוקח בערך יומיים מתחילתו ועד סופו. חלקים קריטיים של פרוטוקול זה הם העשרת התאים המוחלקים על-ידי מיון התאים (מקטע פרוטוקול 3) ואימות קפדני של תאים מוחלקים באמצעות מיקרוסקופ (פרוטוקול סעיף 4). סעיפים אלה להבטיח כי תאים התמזגו מתקבלים בקלות והם בתום heterokaryons. יש לדבקה בריכוזים ובזמני דגירה. לדוגמה, כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר או בזמני דגירה ארוכים יותר, צבעי תאים יכולים להיות בהירים מדי ולהרוות את ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו ממומנת על ידי ברוכים העקב חומרי גלם באמון מחבר הנרי ברוכים המספרים (https://wellcome.ac.uk/grant מספר 100090/12/Z). לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד. אנו מודים לאשוק ולפול פרנץ ' לייעוץ ביקורתי ולהדרכה על הפרויקט. אנו מודים לקיארה וגבריאלה Grondys-Kotarba במכון קיימברידג ' לזרימת המחקר הרפואי מתקן Cy, לתמיכה מעולה. , אנו מודים לליאם קסידיי, תומס מילר. וג'אנמרקו קונארו על הגהה של כתב היד
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור 15 מ"ל | Sarstedt | 62554502 | |
| תמיסת פורמלדהיד 37% | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 סריקת לייזר קונפוקלי Airyscan מיקרוסקופ | קרל זייס | ||
| 8 בארות הדמיה צלחות | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP אלפקה GFP מאיץ ננו-גוף | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx ממיין תאים | BD Biosciences | ||
| אלבומין סרום בקר | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| מסנני תאים (70 μ m) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, GlutaMAX, פירובט | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| סרום בקר עוברי | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I ננו-גוף אלפקה | NanoTag Biotechnologies | N1302-AT565 | |
| L15 CO2 מדיום הדמיה עצמאי | סיגמא-אולדריץ' | 21083027 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא-אולדריץ' | 15140122 | |
| פנול אדום ללא DMEM, גלוקוז גבוה | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (1x PBS) | 8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2HPO4, dH2O עד 1 | ||
| ליטר פוליאתילן גליקול Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| צינורות פוליפרופילן | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | פעילי שטח לא יוני |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | חומר ניקוי לא יוני |
מקורות
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
