Summary
Le but de ce protocole est de fusionner deux types de cellules différents pour créer des cellules hybrides. L'analyse de microscopie de fluorescence des cellules fusionnées est employée pour suivre la cellule d'origine des organites cellulaires. Cet analyse peut être utilisé pour explorer comment la structure cellulaire et la fonction réagissent à la perturbation par fusion cellulaire.
Abstract
La vie est spatialement cloisonnée dans les membranes lipidiques pour permettre la formation isolée d'états moléculaires distincts à l'intérieur des cellules et des organites. La fusion cellulaire est la fusion de deux cellules ou plus pour former une seule cellule. Ici, nous fournissons un protocole pour la fusion cellulaire de deux types de cellules différentes. Les cellules hybrides futilisées sont enrichies par le tri à base de cytométrie de flux, suivi de la microscopie de fluorescence de la structure et de la fonction des cellules hybrides. Les protéines étiquetées fluorescentes générées par l'édition du génome sont représentées à l'intérieur de cellules fusionnées, ce qui permet d'identifier les structures cellulaires en fonction de l'émission de fluorescence et de les référencer au type d'origine cellulaire. Cette méthode robuste et générale peut être appliquée à différents types de cellules ou organites d'intérêt, pour comprendre la structure cellulaire et la fonction à travers une gamme de questions biologiques fondamentales.
Introduction
L'entretien homéostatique de la structure cellulaire est essentiel à la vie. Les cellules ont des morphologies caractéristiques, des nombres d'organites sous-cellulaires et une composition biochimique interne. Comprendre comment ces propriétés fondamentales sont générées et comment elles tournent mal pendant la maladie nécessite des outils de laboratoire pour les perturber.
La fusion cellulaire est la fusion de deux ou plusieurs cellules distinctes. La fusion cellulaire peut avoir été essentielle à l'émergence de la vie eucaryote1. Dans le corps humain, la fusion cellulaire est relativement rare, se produisant pendant les circonstances de développement restreintes et les types de tissu, tels que pendant la fécondation ou la formation du muscle, de l'os et du placenta2. Ce protocole décrit l'induction de la fusion cellule-cellule dans les lignées cellulaires de culture de tissu avec les organites fluorescents différentiellement, comme outil pour comprendre les mécanismes contrôlant la structure et la fonction de cellules.
La fusion cellulaire induite in vitro est au cœur de la production d'anticorps monoclonaux3, un outil important pour la recherche biologique et le traitement des maladies. La fusion cellulaire a également été utilisée pour poser de nombreuses questions biologiques fondamentales différentes sur la dominance du cycle cellulaire4, aneuploidy5,6, reprogrammation cellulaire7,8, la réparation des neurones endommagés9, prolifération virale10, apoptose11, tumorigenesis12, dynamique cytosquelettique13, et fusion membranaire14,15. Méthodes basées en laboratoire pour induire la fusion cellule-cellule16,17,18,19 induire la coalescence de membrane lipidique par la fusion physique de deux bicouches en un seul. La fusion cellulaire peut être induite par l'électricité18, les méthodes virales17, chauffage thermoplasmonique20, expression transgène19, et les produits chimiques, y compris le polyéthylène glycol (PEG)16,21,22.
Les centrosomes sont des centres d'organisation de microtubules contrôlant la forme cellulaire, la motilité, la polarisation, et la division23. Les racines centrosomal sont des structures fibreuses s'étendant des centrosomes contenant la racine de protéine24 (encodée par le gène CROCC). Nous avons récemment utilisé la fusion cellule-cellule pour comprendre comment la position centrosome et le nombre varie à l'intérieur des hétérodaryons par rapport aux cellules parentales24. La raison d'être de cette méthode est de suivre la cellule d'origine des racines dans un hétérookaryon après la fusion de cellules parentales étiquetées différemment fluorescentes, et donc d'imager la fusion et la fission organelle. Les protéines fluorescentes taguées rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I sont créées par l'édition du génome dans des lignées cellulaires séparées qui sont ensuite fusionnées par la fusion cellulaire médiée par PEG. Nous décrivons l'utilisation de colorants cellulaires (Tableau des matériaux) pour identifier les cellules fusionnées par cytométrie d'écoulement et identification subséquente de microscopie de fluorescence de la cellule centrosome d'origine et de la morphologie (figure 1). Cette approche est une méthode robuste et unique pour étudier comment les changements majeurs dans l'état cellulaire, y compris le nombre d'organelles empiéter sur l'homéostasie cellulaire.
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Protocol
1. Étiquetage différentiel des cellules fluorescentes
- Marquage génétique avec CRISPR Cas9
- Utilisez l'édition du génome CRISPR Cas9 pour étiqueter la racine (ou d'autres gènes d'intérêt) avec les protéines fluorescentes meGFP ou mScarlet-I dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.
REMARQUE: Les protocoles détaillés pour l'édition du génome sont couverts ailleurs24,25,26.
- Utilisez l'édition du génome CRISPR Cas9 pour étiqueter la racine (ou d'autres gènes d'intérêt) avec les protéines fluorescentes meGFP ou mScarlet-I dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.
- Étiquetage de teinture fluorescent
- Cultivez des cellules cancéreuses humaines Cal51 dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), de L-glutamine et de 100 g/mL de pénicilline/streptomycine à 37 oC et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
REMARQUE: Il est important de s'assurer que les cellules sont régulièrement vérifiées pour l'absence de contamination par le mycoplasme et pour l'identité de la lignée cellulaire. N'utilisez pas de cellules qui ont été largement passages dans la culture (passages de 15). Les cellules doivent être en bonne santé et croître de façon exponentielle. Évitez la sous-confluence ou la sur-confluence. - Seed chaque type de cellule (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I et les cellules Cal51 non étiquetées parentales) de sorte que 6 x 106 cellules sont présentes le lendemain pour chaque échantillon, à une confluence de 70 à 90%.
REMARQUE: Il s'agit d'environ un flacon de culture tissulaire T75 ou un plat de 10 cm par type de cellule. Les cellules parentales non étiquetées sont nécessaires comme un contrôle négatif plus tard dans le protocole. Ce protocole permet la production de 20 000 cellules fusionnées, mais ce nombre pourrait être augmenté grâce à l'extension du protocole avec un nombre accru de lots. - Le lendemain, prémoudre DMEM, trypsine et 1x saline tamponnée de phosphate (PBS) en les plaçant dans un bain d'eau à 37 oC.
- Laver les cellules rootletin-meGFP et rootletin-mScarlet-I 2x dans le PBS en versant ou en s'apitant sur le milieu et en remplaçant par 10 mL de PBS.
- Étiqueter les cellules Cal51 rootletin-meGFP en ajoutant 500 nM de colorant violet (Table of Materials) en PBS pendant 1 min à température ambiante (RT).
- Étiquette Cal51 rootletin-mScarlet-I cellules en ajoutant 200 nM de colorant à cellules rouges lointaines (Tableau des matériaux) en PBS pour 1 min à RT.
REMARQUE: Gardez les échantillons à l'abri de la lumière dans la mesure du possible après la coloration fluorescente, afin d'éviter le blanchiment de la fluorescence. - Arrêter les réactions d'étiquetage de teinture en ajoutant 10 ml de DMEM pendant 5 min.
- Retirez les cellules Cal51 parentales non étiquetées de l'incubateur (à partir de l'étape 1.2.2).
REMARQUE: Ces cellules seront utilisées plus tard comme contrôles négatifs non étiquetés (étape 3.3.2). - Laver toutes les cellules une fois en versant le milieu de croissance et en remplaçant par 10 ml de PBS.
- Verser le PBS et incuber pendant 5 min dans des conditions de culture avec 1 ml de 1x trypsine préréchauffée.
- Transférer les cellules dans un tube conique en plastique de 15 ml et une centrifugeuse à 1000 x g pendant 5 min.
- Retirez soigneusement et jetez la trypsine de la pastille cellulaire à l'utilisation d'une pipette.
- Resuspendre délicatement les granulés de cellules violets et rouges en 1 ml de PBS.
- Resuspendre délicatement le granule de cellule parental (non fluorescent) dans 1 ml de DMEM et retourner à l'incubateur.
REMARQUE: Cet échantillon ne subira pas de fusion cellule-cellule, mais sera utilisé plus tard pendant la cytométrie du débit.
- Cultivez des cellules cancéreuses humaines Cal51 dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), de L-glutamine et de 100 g/mL de pénicilline/streptomycine à 37 oC et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
2. Fusion cellule-cellule
- Mélanger 3 x 106 cellules violettes étiquetées avec 3 x 106 cellules étiquetées rouges dans un tube de 15 ml en tapissant doucement 0,5 ml de chaque type de cellule à l'aide d'une pipette de 1 ml.
- Centrifuger les cellules non mélangées restantes de l'étape 2.1 à 1000 x g pendant 5 min, puis verser pbS, resuspendre le granule dans 1 ml de DMEM et revenir à l'incubateur.
REMARQUE: Ces échantillons non mélangés non étiquetés restants seront utilisés plus tard comme contrôles négatifs et de compensation à la section 3 du protocole. - Centrifuger les cellules mélangées à partir de l'étape 2.1 à 1000 x g pendant 5 min et aspirer soigneusement PBS à l'aide d'une pipette de 1 ml.
- Ajouter 0,7 ml de solution PEG de 50 % 1450 dans le sens déroulant de la pastille cellulaire (étape 2.3) à l'aide d'une pipette de 1 ml sur une période de 30 s.
- Laisser agir 3,5 min à RT.
REMARQUE: Le temps d'incubation avec PEG peut être optimisé en fonction du type de cellule, bien que notez que le temps d'incubation plus long augmente la toxicité cellulaire. - Ajouter 10 ml de DMEM sans sérum dans le sens de la baisse pendant 30 s et laisser dans l'incubateur pendant 10 min.
- Faites tourner à 1 000 x g pendant 5 min, jetez le supernatant et suspendez doucement dans 1 ml de milieu complet (DMEM contenant du FBS).
REMARQUE: Passez directement à l'article 3. Il y a toxicité associée à l'exposition de PEG suivie de cytométrie de flux et d'imagerie, ainsi maintiennent des cellules dans des conditions de culture autant que possible en procédant rapidement entre les étapes.
3. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir les cellules fused
- Préparer toutes les cellules à la cytométrie du débit en tapant doucement chaque échantillon séparément à travers un filtre de 70 m dans un tube FACS.
REMARQUE: Quatre échantillons sont nécessaires : cellules fusionnées, globules rouges étiquetés isolés, cellules violettes étiquetées simples, cellules parentales non étiquetées. Une fois retirées du capuchon stérile de culture des tissus, les cellules ont la capacité d'être infectées, afin de minimiser le temps d'exposition des échantillons à un environnement non stérile à partir d'ici. Les cellules sont triées dans un milieu DMEM complet. - Utilisez un cytomètre capable de tri à cellule unique.
- Configurez le trieur cellulaire pour une sorte aseptique. Effectuer le contrôle de la qualité de l'instrument selon la recommandation du fabricant.
- Dessinez une parcelle de diffusion vers l'avant par rapport à la dispersion latérale et un complot de discrimination doublet.
- Créez des portes pour identifier les cellules fusionnées.
- Excitez les colorants fluorescents à des longueurs d'onde de 405 nm et 635 nm. Détecter à 450 nm et 660 nm (longueurs d'onde violettes et rouges, respectivement). Terrain loin rouge contre longueurs d'onde violettes.
- Exécutez des cellules parentales non étiquetées à travers le cytomètre et enregistrez l'intensité de fluorescence.
REMARQUE: Les valeurs au-dessus de cette ligne de base définissent la positivité pour la coloration des colorants. - Exécuter des cellules violettes étiquetées simples à travers le cytomètre. Confirmez qu'il n'y a pas de débordement de violette dans le canal rouge lointain.
- Exécutez des globules rouges étiquetés isolés à travers le cytomètre et confirmez qu'il n'y a pas de débordement de rouge lointain dans le canal violet.
REMARQUE: Pour les données représentatives présentées, les cellules ont été triées à 20 psi sur un trieur équipé d'une buse de 100 m. - Exécutez brièvement l'échantillon de fusion pour confirmer que les cellules fusionnées sont visibles avec les portes créées à l'étape 3.3.
- Aligner le flux de tri de façon centralisée dans un plat d'imagerie à 8 puits.
- Les cellules fusionnées de tri FACS, présentes sous forme de cellules violettes positives doubles et d'étiquettes rouges lointaines directement dans un plat d'imagerie de 8 puits contenant 100 l de milieu de croissance.
REMARQUE: Le nombre maximum recommandé de cellules est de 50 000 euros par plat de 8 puits. Assurer la santé des cellules pendant le tri. La confluence cellulaire peut influencer la santé cellulaire, alors gardez les cellules entre 20 et 90 % de confluence après le tri en triant un nombre approprié de cellules pour le plat d'imagerie. Chaque gouttelette triée contient environ 3 nL de liquide de gaine. Assurez-vous que le liquide de gaine ne dilue pas de façon significative le milieu de croissance pendant le tri. - Directement après le tri, ramener les cellules à l'incubateur et laisser pour la nuit.
REMARQUE: Les cellules adhérentes réadhéreront progressivement à la couverture pendant cette période, à partir du tri, et donc leur morphologie changera au fil du temps si elle est prise directement au microscope.
4. Staining immunofluorescent et imagerie des fusions de cellules-cellules
REMARQUE: Les cellules futilisées peuvent être représentées en direct ou après fixation et d'autres taches fluorescentes (ou les deux), selon les expériences et les mesures requises.
- Imagerie cellulaire en direct
- Remplacer le milieu de croissance par un milieu d'imagerie sans phenol rouge(tableau des matériaux)et passer directement à l'imagerie.
- Fixation et coloration
- Préparer le paraformaldéhyde frais de 4 % (PFA) dans PBS.
- Fixez les cellules en les incuber dans 100 'L de 4% PFA pendant 15 min à RT. Enlevez PFA après 15 min.
MISE EN GARDE: PFA est toxique lorsqu'il est inhalé de sorte que cette étape doit être effectuée dans un capot de fumée avec un équipement de protection individuelle approprié.
REMARQUE: Après fixation, l'expérience peut être interrompue et redémarrée plus tard si nécessaire. Entreposer l'échantillon à 4 oC, à l'abri de la lumière, au besoin. - Laver les cellules 3x dans 200 OL de PBS à RT.
- Les cellules de perméabilize pendant 10 min à RT dans 200 'L de 0.1% surfactant nonionic (tableau des matériaux) et 0.1% détergent nonionic (tableau des matériaux) dilué dans PBS.
- Bloquer en 200 l de 3% d'albumine de sérum bovin en PBS pendant 30 min à RT.
- Incuber avec des anticorps dans 150 OL de PBS contenant 3% d'albumine de sérum bovin et 0,1% de surfactant nonionique et 0,05% de détergent nonionique pendant 1 h à RT.
REMARQUE: Les principaux anticorps utilisés pour générer les résultats représentatifs sont les nanobodys anti-GFP conjugués fluorescents (utilisés à 1:400 dilution), et fluorescents conjugués anti-mScarlet-I nanobody (utilisé à 1:500 dilution). Ceux-ci améliorent le signal des protéines déjà fluorescentes. - Laver 2x pendant 5 min dans 300 OL de PBS, puis laisser dans 200 'L de PBS.
REMARQUE: Les échantillons sont représentés dans PBS. Les échantillons peuvent être stockés à 4 oC, protégés de la lumière.
- Acquisition d'images
- Acquérir des images avec un microscope à fluorescence approprié capable d'imagerie quatre couleurs (p. ex., éclairage confocal, large champ, structuré).
- Excitez-moiGFP et mScarlet-I canaux avec 488 nm et 561 nm lasers longueur d'onde, respectivement. Définir les détecteurs pour détecter à 505 à 550 nm et à 590 à 650 nm. Excitez les canaux violets et les canaux de teinture rouge lointain avec 405 nm et 633 nm lasers, respectivement. Définir les détecteurs pour détecter à 430 à 500 nm et à 660 à 750 nm.
- Déterminez empiriquement l'intensité laser de telle sorte qu'il n'y ait pas de photoblanchiment significatif et que les cellules restent en bonne santé (si l'imagerie cellulaire vivante).
- Déterminez empiriquement le gain tel que le signal est obtenu sans saturer ou couper artificiellement les valeurs des pixels.
- Recueillir des données De pile Z, de sorte que les images sont tridimensionnelles, couvrant une gamme de 20 à 60 m avec une taille d'étape de 500 m.
REMARQUE: Les images présentées dans les données représentatives ont été acquises soit par confocal (figure 2B), Airyscan (figure 2C) ou par microscopie d'éclairage structurée (figure 2D). Chaque cellule est un hétérookaryon de bonne foi si elle contient à la fois des colorants violets et rouges qui se chevauchent dans le cytoplasme.
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Representative Results
Les cellules correctement étiquetées sont visibles pendant la cytométrie d'écoulement par signal de fluorescence plus élevé que les cellules témoins non étiquetées (figure 2A). Les portes sont fixées pour le tri des cellules double ment positives, enrichissant cette population directement dans des plats d'imagerie pour d'autres analyses microscopiques. Les cellules futilisées sont détectables en tant que cellules distinctes à double fluorescent positif et constituent environ 1 % de la population.
La fusion induit un réarrangement majeur de l'architecture cellulaire par le mélange de deux cellules en une seule (Figure 2B). Les hétérookaryons sont identifiés au microscope comme des cellules contenant les deux signaux fluorescents de colorant mélangés à l'intérieur d'une seule cellule (sans intervenir dans les membranes plasmatiques). En outre, deux noyaux peuvent être visibles dans les cellules fusionnées par le contraste d'interférence brightfield/différentiel ou la formation image de fluorescence. Notez que triploïde ou d'autres états plus fortement polyploïdes sont possibles en plus des fusions diploïdes cependant, et ainsi le signal de teinture de deux couleurs devrait être employé pour confirmer l'identité des cellules fusionnées.
La structure et la fonction cellulaires sont étudiées plus en détail par la fusion de cellules contenant des protéines mGFP et mScarlet-I. La fusion entraîne un doublement du nombre centrosome à l'intérieur des hétérodaryons résultant de la fusion de deux cellules. Ainsi, si les cellules avec des centrosomes fluorescents sont fusionnées, au moins quatre foyers de matière pericentriolar sont observés quand le composant pericentriolar centrosome NEDD1 est fluorescent (NEDD1-mRuby3 ; Figure 2C). La fusion de cellules avec de la racine lénétine fluorescente endogène (rootletin-meGFP et rootletin-mScarlet-I) permet d'identifier la cellule d'origine de chaque centrosome dans un hétérookaryon. Rootletin dans les racines centrosomal a limité le chiffre d'affaires de diffusion24, et est donc présent comme fibres distinctement colorées dans les heterokaryons photographiés avec la microscopie de fluorescence (Figure 2D).
Figure 1 : Flux de travail expérimental de fusion et d'imagerie par fluorescence des cellules cellulaires. Schéma du flux de travail expérimental en quatre étapes. (1) Deux populations cellulaires sont étiquetées différemment, avec des colorants et des protéines fluorescentes de fusion. Cyan représente la coloration avec le colorant de cellules violettes et le magenta représente la coloration avec le colorant de cellules rouges loin. Le vert représente le marquage meGFP et le rouge représente le marquage mScarlet-I. (2) Les cellules sont fusionnées par incubation avec du polyéthylène glycol. (3) Les cellules fused sont enrichies par la cytométrie du débit, triant les cellules doublement fluorescentes positives (rouge et violette). (4) Les cellules futilisées sont représentées par microscopie fluorescence pour comprendre comment la structure et la fonction cellulaires sont modifiées (imagerie des canaux vert et rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Enrichissement de cytométrie de flux représentatif et imagerie fluorescente des cellules fusionnées. (A) Stratégie de gating représentative utilisée dans le tri cytométrie de flux des cellules fusionnées. Les cellules fused qui sont doublement fluorescentes sont indiquées par le carré noir. (B) Microscopie de fluorescence confocale représentative des cellules fusionnées, double étiquetée avec des colorants violets et rouges lointains. On y voit des exemples de cellules fusionnées avec succès, qui sont soit tétraploïdes, soit héxaploïdes (panneaux supérieurs et inférieurs respectivement). Barre d'échelle de 10 m. (C) Cellule vivante représentative Airyscan imagerie confocale des centrosomes dans une seule cellule fusionnée contenant des racines centrosomal endogènes (rootletin-meGFP) et du matériel pericentriolar centrosomal (NEDD1-mRuby3). Barre à l'échelle de 1 m. (D) Les cellules exprimant la racine-meGFP endogène ment étiquetée ont été fusionnées avec des cellules exprimant endogènement marqué rootletin-mScarlet-I. Les cellules ont été fixées et tachées et représentées par microscopie d'éclairage structurée. On montre une projection z d'intensité maximale de centrosomes dans une cellule fusionnée. Barre d'échelle de 1 m. Le panneau D a été modifié à partir de Mahen24 avec la permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous démontrons un protocole facile et rentable pour fusionner des cellules et visualiser l'architecture suivante des hybrides cellulaires avec la microscopie, prenant approximativement deux jours du début à la fin. Les parties critiques de ce protocole sont l'enrichissement des cellules fusionnées par tri cellulaire (section 3 du protocole) et la validation soigneuse des cellules fusionnées par microscopie (section 4 du protocole). Ces sections s'assurent que les cellules fusionnées sont facilement obtenues et sont des hétérookaryons de bonne foi. Les concentrations et les temps d'incubation doivent être respectés. Par exemple, lorsqu'ils sont utilisés à des concentrations plus élevées ou avec des temps d'incubation plus longs, les colorants cellulaires peuvent être trop brillants et saturer les détecteurs pendant la cytométrie d'écoulement ou la microscopie de fluorescence, ou provoquer des émissions croisées selon les conditions d'imagerie. En l'absence d'un cytomètre de flux, d'autres technologies sont capables d'enrichir les cellules fusionnées, y compris la double sélection d'antibiotiques27 et les dispositifs de piégeage microfluidique28. Ces technologies sont soit plus lentes, soit nécessitent une configuration expérimentale plus sur mesure, cependant.
D'autres méthodes de fusion cellulaire ont des avantages et des inconvénients par rapport au protocole décrit ici. Les techniques d'électrofusion ou de fusion virale peuvent dans certains cas être représentées par microscopie lors de la fusion8,29, ce qui en fait de bonnes alternatives s'il est préférable d'observer le processus de fusion lui-même. Cependant, ces différentes méthodes peuvent nécessiter de l'équipement spécialisé (comme l'équipement d'électrofusion ou les transgènes viraux). Toutes les méthodes de fusion cellule-cellule ont le potentiel d'empiéter sur la santé cellulaire. Les méthodes de fusion virales reposent généralement sur l'expression continue des transgènes viraux, contrairement à la perturbation transitoire fournie par le PEG ou l'électrofusion. Le potentiel fusogénique cellulaire et la toxicité après l'exposition de PEG est variable dans différents types de cellules27,et donc la titration du temps d'incubation de PEG peut être exigée (étape de protocole 2.4), tout en reconnaissant que l'exposition accrue de PEG augmente la mortcellulaire 30. Il est essentiel de maximiser la santé cellulaire en réduisant au minimum le temps d'absence de la culture. La santé cellulaire peut être vérifiée pendant le protocole en mesurant la diffusion vers l'avant par rapport à la diffusion latérale au cytomètre et par l'observation de la morphologie pendant la microscopie.
Il est essentiel d'examiner attentivement la conception expérimentale pour permettre l'étiquetage différentiel avec des étiquettes fluorescentes. La conception la plus simple consiste à utiliser deux étiquettes fluorescentes distinctes. Cependant, les protéines de fusion fluorescentes exprimées endogènement sont fréquemment de faible niveau d'expression et sont donc difficiles à détecter sans ambiguïté par cytométrie de flux ou imagerie au niveau des cellules uniques. Nous présentons une conception qui surmonte cette limitation en incluant quatre étiquettes fluorescentes avec l'édition du génome à médiation CAS9 CRISPR et des méthodes de coloration à base de colorant. Les sondes fluorescentes doivent avoir des spectres d'émission distincts discernables les unes des autres et être suffisamment brillantes pour être suffisamment claires pour être distinguées des cellules non étiquetées au seul niveau cellulaire. Les sondes doivent rester liées à une cellule plutôt que de se dissiper à l'extérieur. La liaison irréversible interne au niveau subcellulaire n'est pas essentielle mais peut être souhaitable. Une fois que les cellules fusionnent, l'échange régulier d'état des composants cellulaires peut se produire librement. Puisque les racines sont diffusement stables, elles permettent de tracer l'histoire cellulaire, identifiant la cellule d'origine d'un centrosome donné. Une modification possible de la méthode consiste à marquer d'autres structures cellulaires d'intérêt, mais les assemblages à état stable ont le potentiel de se mélanger après la fusion, selon le taux de dynamique intracellulaire (Figure 2C).
La fusion cellule-cellule induit un changement unique dans l'architecture cellulaire17,19,24, dont les implications ne sont pas encore entièrement compris. Il s'agit à la fois d'une limitation du protocole et d'un domaine passionnant pour une enquête plus approfondie. Bien qu'il soit clair que les membranes plasmatiques fusionnent en une seule structure dans les hétérodaryons31, comment d'autres structures cellulaires répondent est mal comprise. La fusion cellulaire pourrait être utilisée pour mieux comprendre comment la fusion et la fission des organelles sont réglementées par l'imagerie d'organelles étiquetées différemment24,32. Le travail futur avec la fusion de cellules pourrait adresser comment l'euploidy, le nombre d'organite et la taille cellulaire imprègnent sur la fonction cellulaire. Puisque la fusion anormale de cellules a été observée dans les processus de la maladie, dans les tumeurs33 et après l'infection virale10,17, ce protocole est également utile pour répondre à une gamme de questions en biologie fondamentale et appliquée.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par une bourse Wellcome Trust Henry Wellcome à R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numéro 100090/12/Z). Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions Ashok Venkitaraman et Paul Français pour les conseils et les conseils essentiels sur le projet. Nous remercions Chiara Cossetti et Gabriela Grondys-Kotarba du Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry pour leur excellent soutien. Nous remercions Liam Cassiday, Thomas Miller et Gianmarco Contino d'avoir relu le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70 μm) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
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