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Artículo de método

Detección de la progresión del tumor pulmonar en ratones por imágenes por ultrasonido

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DOI:

10.3791/60565

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27 de febrero de 2020

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1Lady Davis Institute for Medical Research, Sir Mortimer B. Davis-Jewish General Hospital, 2Division of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, McGill University, 3Department of Cancer Immunology, Chair of Medical Biotechnology, Poznan University of Medical Sciences, 4Gerald Bronfman Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe las medidas tomadas para inducir tumores pulmonares KRAS en ratones, así como la cuantificación de tumores formados por imágenes por ultrasonido. Los tumores pequeños se visualizan en los primeros puntos de tiempo como líneas B. En momentos posteriores, las mediciones relativas del volumen del tumor se logran mediante la herramienta de medición en el software de ultrasonido.

Resumen

Con 1,6 millones de víctimas al año, el cáncer de pulmón contribuye enormemente a la carga mundial del cáncer. El cáncer de pulmón es en parte impulsado por alteraciones genéticas en oncogenes como el oncogene KRAS, que constituye el 25% de los casos de cáncer de pulmón. La dificultad para atacar terapéuticamente el cáncer de pulmón impulsado por KRAS se debe en parte a tener modelos deficientes que pueden imitar la progresión de la enfermedad en el laboratorio. Describimos un método que permite la cuantificación relativa de tumores pulmonares KRAS primarios en un modelo de ratón LSL-KRAS G12D inducible Cre a través de imágenes por ultrasonido. Este método se basa en la adquisición en modo de brillo (B) del parénquima pulmonar. Los tumores que se forman inicialmente en este modelo se visualizan como líneas B y se pueden cuantificar contando el número de líneas B presentes en las imágenes adquiridas. Estos representarían el número de tumor relativo formado en la superficie del pulmón del ratón. A medida que los tumores formados se desarrollan con el tiempo, se perciben como hendiduras profundas dentro del parénquima pulmonar. Dado que la circunferencia del tumor formado está bien definida, el cálculo del volumen del tumor relativo se logra midiendo la longitud y anchura del tumor y aplicándolos en la fórmula utilizada para las mediciones de la pinza tumoral. Las imágenes por ultrasonido son una técnica no invasiva, rápida y fácil de usar que se utiliza a menudo para cuantificaciones tumorales en ratones. Aunque pueden aparecer artefactos al obtener imágenes de ultrasonido, se ha demostrado que esta técnica de diagnóstico por imágenes es más ventajosa para las cuantificaciones tumorales en ratones en comparación con otras técnicas de diagnóstico por imágenes, como la tomografía computarizada (TC) y la toma de imágenes imágenes de bioluminiscencia (BLI). Los investigadores pueden investigar nuevas dianas terapéuticas utilizando esta técnica comparando la iniciación y progresión del tumor pulmonar entre diferentes grupos de ratones.

Introducción

Como la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo, el cáncer de pulmón sigue siendo refractario a los tratamientos, principalmente debido a la falta de modelos preclínicos relevantes que puedan recapitular la enfermedad en el laboratorio1. Alrededor del 25% de los casos de cáncer de pulmón se deben a mutaciones en el oncogeno KRAS2. El cáncer de pulmón impulsado por KRAS a menudo se asocia con un mal pronóstico y una baja respuesta a la terapia, lo que pone de relieve la importancia de seguir estudios en esta enfermedad2.

Optimizamos un método que permite la evaluación relativa del crecimiento del tumor pulmonar en tiempo real en ratones inmuno-competentes inducidos por el cáncer de pulmón KRAS. Utilizamos ratones Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) en los que el oncogene KRAS G12D puede ser expresado por vectores lentivirales Cre3,4. Estos vectores son impulsados por la anhidrasa carbónica 2, permitiendo que la infección viral tenga lugar específicamente en las células epiteliales alveolares5. Además, para acelerar la iniciación y progresión de los tumores pulmonares, la construcción lentiviral también expresa el ARNS P53 de un promotor U6/H1 (la construcción lentiviral aquí se denominará Ca2Cre-shp53)6. La relevancia biológica de este método radica en el curso natural del desarrollo de tumores pulmonares en ratones en comparación con los xenoinjertos de tumores no ortotópicos en ratones. Un obstáculo que utiliza el método ortotópico es controlar el crecimiento del tumor pulmonar sin sacrificar el ratón. Para superar esta limitación, optimizamos las imágenes por ultrasonido para permitir el análisis de la progresión del tumor pulmonar en modo bidimensional (2D) en este modelo de ratón. La iniciación de tumores a las 7 semanas después de la infección se refleja como líneas B en imágenes de ultrasonido, que se pueden contar, pero no reflejará el número exacto de tumores presentes en el pulmón. Las líneas B se caracterizan por líneas blancas verticales similares al láser que surgen de la línea pleural en el parénquima pulmonar7,8. Los tumores grandes se pueden visualizar después de 18 semanas de infección. El volumen relativo de estos tumores se cuantifica mediante mediciones 2D realizadas en ultrasonido.

Este método es óptimo para los investigadores que investigan el efecto de los medicamentos farmacológicos en el crecimiento del tumor pulmonar en el modelo de ratón LSL-KRAS G12D. Además, la progresión del tumor pulmonar se puede comparar entre ratones con diferentes linajes genéticos, para examinar la importancia de la presencia o ausencia de ciertos genes/proteínas en el desarrollo del volumen del tumor pulmonar.

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Protocolo

Los estudios en animales se realizaron de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad McGill y los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad McGill (protocolo de uso animal n.o 2009-5754).

1. Generación de CA2Cre-shp53 Lentiviral Titre

NOTA: El siguiente protocolo es el mismo que el descrito en Xia et al.6, con modificaciones menores.

  1. Preparación de lentivirus (para platos de 15 cm x 10 cm)
    1. En el día 1, células HEK293T sanas (7,5 x 106 células por plato de 10 cm) con 10 ml del medio Eagle modificado de Dulbecco) (DMEM), 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% pluma/estreptococo. Cultivo en una incubadora de 37oC, 5%CO2.
    2. Preparar la mezcla para la transfección calcio-fosfato (mezcla para 15 placas). Preparar el tubo A que contiene 225 g (15 g/placa) del vector lentiviral (Ca2Cre-shp53), 75 g (5 g/placa) de plásmido PsPAX2 (que contiene la mordaza VIH-1 y los genes VIH-1 pol), 75 g (5 g/placa) de plastido pMD2.G (que contiene el gen VSV-G) para el envasado, una concentración final de 0,15 M de CaCl2 y llenar el tubo con H2O destilado hasta 3,75 ml. Prepare el tubo B que contiene 3,75 ml de 2 solución salina tamponada HEPES (HBS; 50 mM HEPES, pH 7,05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4x 2H2O y 12 mM de xtrosa D).
    3. Tubo de vórtice A y agréguelo en gota al tubo B bajo vórtice continuo.
      NOTA: El volumen total será de 7,5 ml.
    4. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 a 30 min.
    5. Aproximadamente 9 h después de enchapar las células, añadir 500 l de la mezcla de transfección en el medio celular (7,5 ml/15 platos: 0,5 ml por plato).
    6. Gire suavemente cada plato para mezclar e incubar todos los platos a 37 oC, 5% CO2.
    7. En el día 2, 12-18 h después de la transfección, sustituya el medio por 10 ml de medios séricos reducidos sin antibióticos(Tabla de materiales)por plato de 10 cm. Vuelva a colocar los platos en la incubadora de 37oC, 5%co2.
    8. En el día 3, recoger los medios que contienen lentivirus que expresan Ca2Cre-shp53 y filtrar a través de filtros de 0,45 m. Reponga los medios con medios séricos reducidos nuevos sin antibióticos.
      NOTA: Los soportes recogidos se pueden mantener a 4 oC durante no más de 3 días.
    9. En el día 4, recoger, por segunda vez, los medios que contienen el lentivirus y filtrar a través de un filtro de 0,45 m. Manténgase a 4 oC (durante no más de 3 días).
    10. Combine los sobrenatantes de virus de los pasos 1.1.8 y 1.1.9. Concentre a través de unidades de filtro centrífugos(Tabla de materiales)centrifugando a 1.372 x g durante 30 min a 4 oC. Repita el proceso hasta que todos los medios recopilados hayan pasado por las columnas.
      NOTA: Después de cada centrifugación, se pueden cosechar entre 100 y 200 ml de filtrado concentrado.
    11. Recoger y mezclar los filtrados concentrados en un tubo de hielo frío de 15 ml. Mezclar bien los lentivirus concentrados y luego la alícuota (p. ej., 100 l/tubo). Conservar a -80oC.
  2. Valoración lentiviral
    NOTA: En este protocolo se utilizan fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados (MEF) que expresan un alelo flanqueado por loxP de proteína fluorescente verde (GFP) para la cuantificación del titer viral. Sin embargo, cualquier línea celular con un alelo loxP-GFP debe ser adecuada para este paso.
    1. Células de cultivo que expresan un alelo de GFP flanqueado loxP con DMEM, 10% FBS y 1% pluma/estreptococo a 37oC, 5% CO2.
    2. Placa 2 x 105 células en dos pocillos de 50 mm de una placa de 6 pocillos.
      NOTA: Las células de un pozo se utilizarán para la infección lentiviral, mientras que la del otro se utilizará como un control negativo.
    3. Al día siguiente, reponer las células con 2 mL de DMEM, 10% FBS, y 1% pluma / estreptococo 2 h antes de la infección lentiviral.
    4. Añadir 20 l del lentivirus CA2Cre-shp53 (el volumen puede variar cuando sea necesario) en el pozo de infección lentiviral.
    5. Después de 3 días en cultivo, determine la frecuencia de las células GFP-positivas inducidas por Cre por citometría de flujo, como se muestra en la Figura 1. Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS), separar por trippsinización y recoger las células por centrifugación a 112 x g.
    6. Lave las células dos veces con PBS. Por último, suspenda las celdas en 100 sL de PBS. Determinar el porcentaje de células positivas GFP por un analizador de celdas (Tabla de materiales).
    7. Calcule el titer infeccioso/funcional lentivirus utilizando la siguiente fórmula:
      figure-protocol-1
      donde F es la frecuencia de las células positivas de GFP y se calcula restando la frecuencia de las células -positivas de GFP después de la infección (Fi) de la frecuencia de las células positivas de GFP (fondo) antes de la infección (Fc) como se muestra en la Figura 1 (F - Fi-Fc), Cn es el número de células chapadas (2 x 105),V es el volumen del inóculo (ml), y DF es el factor de dilución del virus.
      NOTA: La concentración infecciosa/funcional es de 2 x 106 TU/ml.

2. Intubación intratraqueal de lentivirus en ratones LSL-KRASG12D

NOTA: El método de intubación intratraal se utilizó como se describe en el protocolo publicado por Vandivort et al.9. En este protocolo, los ratones LSL-KRASG12D en fondo C57BL/6 se utilizan a la edad de 6 a 8 semanas. Se utiliza una junta de procedimientos de trabajo casera como se describe en Vandivort et al.9. La placa se coloca delante del experimentador en un espacio de trabajo conveniente (aproximadamente 1 m2).

  1. Prepare un espirómetro retirando el émbolo de una jeringa de 1 ml y cargando 60 ml de PBS en la jeringa.
  2. Coloque una punta de catéter de 22 G en la jeringa y reserve.
  3. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de un cóctel de 1 l/g de peso corporal del ratón de ketamina (50 mg/ml)/xilazina (5 mg/ml)/acepromazina (1 mg/ml). Asegurar la sedación adecuada del ratón por una frecuencia respiratoria baja (1 respiración cada 2 s).
  4. Aspirar 20 l de lentivirus CA2Cre-shp53 en un pipeteador y reservar.
  5. Coloque el ratón sedado en la placa de trabajo enganchando sus incisivos superiores en el hilo de la placa.
    NOTA: El dorsum del ratón debe estar plano contra la plataforma.
  6. Pegue la parte caudal de la cavidad torácica a la plataforma para asegurar la alineación del ratón durante el procedimiento.
  7. Ajusta un iluminador de cuello de cisne entre una intensidad de entre el 80 y el 100 % y coloca la luz a 1 x 2 cm de la superficie de la piel.
  8. Detrás de la plataforma, extraiga la lengua de la cavidad oral del ratón usando fórceps estériles.
  9. Mientras asegura la lengua, inserte un depresor en la cavidad oral del ratón y luego suelte la lengua.
  10. Coloque el cuello de cisne en los bronquios del tallo principal para iluminar la tráquea.
    NOTA: La tráquea puede ser visible a través de la acción de la respiración, causando fluctuación de la luz.
  11. Cuando la tráquea esté claramente visible, inserte el espirómetro preparado (jeringa con PBS y catéter) en la trayectoria traqueal.
  12. Retire el depresor y observe el aumento y la caída de PBS en la jeringa con cada respiración.
    NOTA: Este es un indicador de que el catéter está correctamente colocado en la tráquea.
  13. Retire la jeringa que contiene PBS mientras mantiene el catéter dentro de la tráquea como posición anterior.
  14. Deposite el lentivirus CA2Cre-shp53 de 20 l en el centro del catéter.
  15. Mientras mantiene el catéter en su lugar, inyecte 300 ml de aire en el catéter utilizando una jeringa vacía para asegurar una distribución adecuada del lentivirus en los pulmones.
  16. Mantenga el catéter en su lugar y vuelva a insertar el espirómetro en el catéter.
    NOTA: El aumento y la caída de la burbuja PBS garantizará que el procedimiento sea exitoso.
  17. Retire el catéter y la cinta. Coloque el animal en un lugar cálido y seco hasta que se rereviva.

3. Imágenes por ultrasonido de tumores pulmonares en ratones

NOTA: Las imágenes por ultrasonido se realizaron después de 7 y 18 semanas de intubación lentiviral utilizando el sistema enumerado en la Tabla de Materiales; sin embargo, cualquier modelo se puede utilizar para el análisis.

  1. Un día antes de la toma de imágenes, retire el pelaje de la zona torácica del ratón intubado.
    NOTA: El ratón debe ser sedado durante este paso colocándolos en una cámara de inducción de 3% de isoflurano y 2L/minuto O2.
  2. El día de la creación de imágenes, configure el espacio de trabajo como se muestra en la figura 2. Encienda la bomba de calentamiento para gel de ultrasonido y el monitor de temperatura.
  3. Colocar una incubadora caliente de 33 oC para colocar a los ratones en imágenes posteriores.
  4. Coloque el motor tridimensional (3D)(Figura 2F)en el sistema ferroviario integrado.
  5. Asegúrese de que el motor 3D y el sistema de montaje del transductor estén bien en su lugar.
  6. Conecte un transductor preferido (frecuencia: 40 MHz; Figura 2E y Tabla de Materiales) para mediciones tumorales perpendiculares al motor 3D.
  7. Inicie un nuevo estudio sobre el software de ultrasonido.
    1. Seleccione Navegador de estudio y,a continuación, seleccione Nuevo en la parte inferior de la pantalla.
    2. Seleccione Nuevo estudio, aparecerá una nueva ventana que permite la adición de un nombre de estudio además de más información sobre el estudio, es decir, la fecha de estudio, el nombre del investigador, etc.
    3. Rellene la información en Nombre de la Serie,es decir, Identificación animal, Tensión, Peso, Fecha de nacimiento, etc.
    4. Seleccione Listo, el programa cambiará para el modo B.
  8. Coloque una lámpara de calefacción en una posición conveniente por encima de la plataforma animal.
  9. Coloque el ratón en la cámara de inducción (3,5% isoflurano).
    NOTA: La anestesia adecuada se confirma por la inconsciencia del ratón y una frecuencia respiratoria más lenta de alrededor de 1 respiración por 2 segundos.
  10. Cuando el ratón esté sedado, cambie la conexión de la máquina anestésica que se dirigirá hacia la plataforma animal, reduzca el isoflurano al 2,5%.
  11. Coloque el ratón sobre la plataforma animal en decúmito ventral, con su cavidad oral dirigida hacia el tubo anestésico.
  12. Aplique lubricante en los ojos del ratón.
  13. Coloque el ratón en decúmito dorsal y pegue sus manos y pies firmemente sobre la plataforma animal.
  14. Aplique una pequeña capa de gel de ultrasonido en el pecho del ratón.
  15. Baje la sonda de adquisición con la perilla de control de altura para tocar la superficie del pecho del ratón. Coloque la sonda de forma que el corazón del ratón esté aproximadamente centrado.
  16. Utilice los micro-botones para adquirir imágenes de todo el pecho, de ambas extremidades, en la orientación transversal idealmente reuniendo 500 fotogramas por ratón (el número de fotogramas puede variar dependiendo de la elección personal).
  17. Una vez finalizada la toma de imágenes, retire el gel del pecho del ratón y coloque el ratón en la incubadora caliente.

4. Análisis 2D de imágenes de ultrasonido

  1. Después de abrir los marcos adquiridos en el software de ultrasonido, escanee los marcos en busca de tumores.
  2. Para tumores pequeños que inician, cuente el número de líneas B periódicamente cada 10 fotogramas para la longitud completa de los 500 fotogramas adquiridos.
    Por lo tanto, las líneas B se cuentan en un total de 50 imágenes, cada imagen está separada por 10 fotogramas. Las líneas B se caracterizan por líneas rectas blancas longitudinales que atraviesan completamente la pantalla.
  3. Para mediciones 2D de tumores grandes, seleccione la herramienta lineal y mida el ancho y la longitud del tumor presente.
  4. Para calcular el volumen de los tumores, utilice la siguiente fórmula:
    figure-protocol-2
    donde L y W son la longitud y anchura del tumor, respectivamente.

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Resultados

Después de obtener un titer infeccioso lentiviral de 2 x 106 TU/ml(Figura 1), el lentivirus Ca2Cre-shp53 se inyectó por vía intratratal cuando los ratones LSL-KRAS G12D alcanzaron una edad adecuada (6-8 semanas)9. Las imágenes por ultrasonido se realizaron después de 7 semanas de infección al iniciar tumores(Figura 3B). Las imágenes se realizaron a las 7 semanas con el fin de incluir los diversos tipos de lesio...

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Discusión

Demostramos un método que puede evaluar el crecimiento del tumor pulmonar en el modelo de ratón LSL-KRAS G12D inducible Cre por ultrasonido. Este método se puede utilizar para evaluar el efecto de los inhibidores farmacológicos en el crecimiento del tumor pulmonar. También se puede utilizar para comparar el crecimiento de tumores pulmonares entre ratones de diferentes orígenes genéticos. El uso de esta técnica no requiere habilidades computacionales especializadas, sin embargo, es importante ser sistemático en el número ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. I. Verma por el vector lentiviral Ca2Cre-shp53. El trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR MOP 137113) a AEK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,45 μ m Filtros de jeringa AcrodiscPall CorporationPN 4614
Placa de cultivo celular de 100 mmCELLSTAR664 160
Placa de cultivo celular de 6 pocillosCELLSTAR657 160
Amicon Ultra - 15 unidades de filtro centrífugoMerck Millipore Ltd.
BD LSR-FortessaBD Biosciences649225B 3024
CA2Cre-shp53 vector lentiviralDel Dr. I Verma Laboratorio
DMEMMulticell319-005-CL
FBSMulticell80450
LSL-KRASG12D ratónJAX Mice8179
MX550S; Transmisión central: 40 MHzFUJIFILM VisualSonics51070
OptiMEMgibco11058-021
Pluma/estreptococoMulticell450-201-EL
pMD2.GAddgene12259
PsPAX2Addgene12260
VEVO-3100FUJIFILM VisualSonics51072-50
UFC910024

Referencias

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  2. Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
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