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Biology

Production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/60569
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

Summary

Cet article décrit les protocoles utilisés pour produire une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins, « polybulles », pour permettre la libération retardée. Des polyesters, y compris le poly (acide lactique-co-glycolique) et la polycaprolactone, ont été utilisés pour former les polybulles et de petites molécules et antigènes ont été utilisés comme cargaison.

Abstract

Les stratégies de livraison de vaccins qui peuvent limiter l’exposition de la cargaison au solvant organique tout en permettant de nouveaux profils de diffusion sont cruciales pour améliorer la couverture vaccinale dans le monde entier. Ici, une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins injectables, ultraviolets et retardés, appelée polybulles. La cargaison a été injectée dans des polybulles à base de polyester qui ont été formés dans 10% de solution aqueuse à base de carboxyméthycellulose. Ce document comprend des protocoles pour maintenir la forme sphérique des polybulles et optimiser le placement et la rétention de la cargaison afin de maximiser la quantité de cargaison dans les polybulles. Pour assurer la sécurité, la teneur en solvants chlorés dans les polybulles a été analysée à l’aide d’une analyse d’activation des neutrons. Des études de libération ont été menées avec de petites molécules comme cargaison dans le polybulle pour confirmer la libération retardée d’éclatement. Pour montrer davantage le potentiel de livraison à la demande de la cargaison, les nanorods d’or ont été mélangés dans la coque polymère pour permettre l’activation laser proche infrarouge.

Introduction

Une couverture vaccinale limitée entraîne la mort de 3 millions de personnes causées spécifiquement par des maladies évitables par la vaccination1. Les conditions de stockage et de transport inadéquates entraînent le gaspillage de vaccins fonctionnels et contribuent ainsi à réduire la vaccination mondiale. En outre, la vaccination incomplète due au non-respect des calendriers vaccinaux requis entraîne également une couverture vaccinale limitée, en particulier dans les pays en développement2. Plusieurs visites au personnel médical sont nécessaires dans la période recommandée pour recevoir des vaccins de rappel, limitant ainsi le pourcentage de la population avec la vaccination complète. Par conséquent, il est nécessaire d’élaborer de nouvelles stratégies pour la livraison contrôlée de vaccins afin de contourner ces défis.

Les efforts actuels pour développer des technologies de livraison de vaccins comprennent des systèmes polymériques à base d’émulsion3,4. Toutefois, la cargaison est souvent exposée à une plus grande quantité de solvant organique qui peut potentiellement provoquer l’agrégation et la dénaturation, en particulier dans le contexte de la cargaison à base de protéines5,6. Nous avons mis au point une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins, « polybulles », qui peut potentiellement abriter plusieurs compartiments de chargement tout en minimisant le volume de cargaison qui est exposé au solvant7. Par exemple, dans notre plate-forme en coquille de noyau polybulle, une poche cargo de diamètre 0,38 mm (SEM) est injectée au centre d’une polybulle de 1 mm. Dans ce cas, la surface de la cargaison exposée au solvant organique serait d’environ 0,453 mm2. Après avoir examiné la densité d’emballage des sphères (microparticules) dans une sphère (dépôt de cargaison), le volume réel de microparticules (10 μm de diamètre) pouvant tenir dans le dépôt est de 0,17 mm3. Le volume d’une microparticule est de 5,24x10-8 mm3 et donc le nombre de particules microparticules pouvant s’adapter au dépôt est de ~3,2x106 particules. Si chaque microparticule a 20 poches de cargaison (à la suite d’une double émulsion) de 0,25 μm de diamètre, alors la surface de la cargaison exposée au solvant organique est de 1274 mm2. Le dépôt de marchandises dans la polybulle aurait donc une surface inférieure d’environ 2 800 fois moins exposée au solvant organique que celle de la cargaison organique exposée aux solvants dans les microparticules. Notre plate-forme à base de polyester peut ainsi réduire potentiellement la quantité de marchandises exposées au solvant organique qui peut autrement causer l’agrégation et l’instabilité du fret.

Les polybulles sont formés sur la base du principe de séparation de phase où le polyester en phase organique est injecté dans une solution aqueuse résultant en une bulle sphérique. La cargaison dans la phase aqueuse peut alors être injectée au centre de la polybulle. Une autre soute peut potentiellement être réalisée dans le polybulbble en mélangeant une cargaison différente avec la coque en polymère. Le polybulle à ce stade sera malléable et sera ensuite guéri pour aboutir à une structure solide polybulle avec la cargaison au milieu. Les polybulles sphériques ont été choisis plutôt que d’autres formes géométriques pour augmenter la capacité de chargement dans le polybulbble tout en minimisant la taille globale du polybulle. Les polybulles avec la cargaison dans le centre ont été choisis pour démontrer la libération retardée d’éclatement. Les polybulles ont également été incorporés avec l’agent proche infrarouge (NIR) - sensible (c’est-à-dire l’onduler) agent, à savoir les nanorods d’or (AuNR), pour provoquer une augmentation de la température des polybulles. Cet effet pourrait potentiellement faciliter une dégradation plus rapide et pourrait être utilisé pour contrôler la cinétique dans les applications futures. Dans cet article, nous décrivons notre approche pour former et caractériser les polybulbbles, pour obtenir la libération retardée d’éclatement des polybulbulles, et pour incorporer AuNR dans les polybulles pour causer nir-activation.

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Protocol

1. Synthèse du triacrylate de polycaprolacyone (PCLTA)

  1. Sécher 3,2 ml de 400 Da polycaprolacyone (PCL) triol toute la nuit à 50 °C dans une fiole ouverte de 200 mL de fond rond et K2CO3 dans un flacon en verre à 90 °C.
  2. Mélanger le triol avec 6,4 mL de dichlorométhane (DCM) et 4,246 g de carbonate de potassium (K2CO3)sous l’argon.
  3. Mélanger 2,72 ml de chlorure d’acryloyle dans 27,2 ml de DCM et ajouter le mélange de réaction dans la fiole sur 5 min.
  4. Couvrir le mélange de réaction de papier d’aluminium et le laisser tranquille à température ambiante pendant 24 h sous l’argon.
  5. Après 24 h, filtrer le mélange de réaction à l’aide d’un papier filtre sur un entonnoir Buchner sous vide pour jeter l’excès de réactifs.
  6. La filtrate précipitée de l’étape 1.5 qui contient le polymère encapped dans l’éther diéthylique dans un 1:3 (vol/vol) et le rotovape à 30 °C pour enlever l’éther de diéthyle.

2. Formation de la polybulle

REMARQUE : L’injection de polymère dans l’eau déionisée (DI) entraînerait la migration des polybulles vers le fond du flacon, ce qui entraînerait un aplatissement du fond. Utilisez 10 % (wt/vol) de cellulose de carboxyméthyle (CMC) remplir le flacon de verre à la place pour éviter l’aplatissement de polybulote.

  1. Préparer une solution CMC à 10 % (wt/vol) dans l’eau di.
  2. Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 0,8 mL de 10 % de CMC à l’aide d’un tuyau de transfert de 1 mL.
  3. Mélanger 1000 mg/mL de 14 kDa PCL en DCM et synthétiser pclta dans un 1:3 (vol/vol) pour un volume total de 200 μL ou préparer 200 μL de 1000 mg/mL de 5 kDa poly (acide lactique-co-glycolique) diacrylate (PLGADA) en chloroforme.
  4. Mélanger le mélange 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-méthylpropiophénone (photoinitiator) avec le mélange polymère (PLGADA ou PCL/PCLTA) en 0,005:1 (vol/vol).
  5. Charger 200 μL de mélange polymère dans une seringue en verre de 1 mL montée sur une pompe à seringues reliée à un tube en acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.
  6. Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère pour injecter du polymère dans le CMC à 10 % dans le flacon en verre pour former le polybulle.
  7. Soignez les polybulles sous ultraviolet (UV) à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm2.
  8. Geler les polybulles dans l’azote liquide et lyophiliser pendant la nuit à 0,010 mBar vide et à -85 °C.
  9. Séparez les polybulles du CMC séché à l’aide de forceps et lavez les polybulles avec de l’eau DI pour éliminer tout CMC résiduel. Notez que d’autres polymères peuvent être utilisés probablement avec des modifications pour modifier la cinétique de libération.

3. Modulation du diamètre de polybulote

  1. Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 10 % de CMC à l’aide d’un tuyau de transfert de 1 mL.
  2. Mélangez PCL/PCLTA dans un 1:3 (vol/vol) avec 1000mg/mL 14kDa PCL et synthétisez PCLTA. Mélanger le photoinitiator avec le mélange de polymère dans un 0.005:1 (vol/vol).
  3. Chargez le mélange de polymère dans une seringue en verre de 1 mL montée sur une pompe à seringues reliée à un tube en acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.
  4. Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère pour injecter du polymère dans le CMC à 10 % dans le flacon en verre pour former le polybulle.
  5. Pour obtenir des polybulles de diamètres divers, varier le taux de distribution de 0,0005 à 1 μL/s.
  6. Prenez des images de la fiole avec les polybulles de diamètre variable.
  7. Utilisez ImageJ pour quantifier le diamètre des polybulles et utiliser la taille du flacon comme échelle.

4. Centrement de la cargaison dans le polybulle

  1. Modulation de la viscosité PCL/PCLTA à l’aide de K2CO3:
    REMARQUE : La viscosité de PLGADA n’a pas à être modifiée à l’aide de K2CO3 parce que la viscosité de 5 kDa PLAGDA à 1000 mg/mL est suffisante pour le centre de la cargaison.
    1. Ajouter K2CO3 (qui a été isolé après la réaction pclta) à la PCLTA à des concentrations variables, y compris 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, et 60 mg/mL.
    2. Mesurer les viscosités dynamiques des solutions en modifiant le taux de cisaillement de 0 à 1000 1/s à l’aide de la rhéométrie.
    3. Injecter manuellement la cargaison au milieu (voir l’étape 4.2 pour préparer le mélange de cargaison) des polybulles qui ont été formés à l’aide des solutions PCL/PCLTA avec différentes concentrations de K2CO3 (étape 4.1.1). Déterminer la concentration optimale de K2CO3 en observant quelle solution de l’étape 4.1.1 peut entraîner la rétention de la cargaison au milieu.
  2. Centrage de la cargaison (déjà montré faisabilité avec de petites molécules) avec CMC
    1. Mélanger la cargaison avec 5 % (wt/vol) CMC dans un rotateur pendant la nuit afin d’augmenter la viscosité de la cargaison.
    2. Injecter manuellement 2 μL de mélange de cargaison dans la polybulle et procéder à un traitement UV à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm2.
    3. Geler les polybulles en azote liquide pendant 30 s et lyophiliser pendant la nuit à 0,010 mBar vide et à -85 °C.
    4. Séparez les polybulles du CMC séché à l’aide de forceps et lavez-les avec de l’eau DI pour enlever tout CMC résiduel.
    5. Couper la polybulle en deux et imager les moitiés à l’aide de la microscopie confocale pour vous assurer que la cargaison est centrée (voir l’étape 6 pour les longueurs d’onde d’excitation et d’émission utilisées).

5. Formulation de cargaison

REMARQUE : La formulation de polybulbble peut abriter divers types de cargaison, y compris de petites molécules, des protéines, et des acides nucléiques.

  1. Sur la base d’études antérieures, dans le cas de la cargaison de protéines, utiliser des excipients, y compris le polyéthylène glycol (PEG)6, la polyvinylpyrroidone (PVP), et les glycopolymères6 pour améliorer la stabilité des protéines pendant la formulation de polybulble.
  2. Former des polybulles basés sur le protocole à l’étape 2.
  3. Préparer la solution d’antigène en ajoutant 17,11 g de tréhalose à 625 μL d’antigène gp120/41 du VIH.
  4. Injecter manuellement 1 μL de solution d’antigène au milieu de la polybulle.
  5. Ouvrez les polybulles les jours 0, 7, 14 et 21, et enregistrez la fluorescence de l’antigène avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission 497 nm et 520 nm, respectivement.
  6. Déterminer la fonctionnalité de l’antigène à l’aide d’un test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) et utiliser 5 % de lait non gras comme tampon de blocage.

6. Libération de la cargaison

REMARQUE : Une petite molécule ou un antigène peut être utilisé comme type de cargaison

  1. Petite molécule
    1. Incuber des polybulles avec de l’acriflavine centrée dans 400 μL de saline tampon de phosphate (PBS) à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C, 70 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA.
      REMARQUE : La raison pour laquelle nous recommandons de tester au-dessus de la température corporelle est de simuler la température (50 °C) à laquelle la polybulle atteint tout en laserant les nanorods d’or (AuNRs) dans PCL et PLGA; b) accélérer le processus de dégradation du PCL (50 °C, 70 °C).
    2. À chaque point de temps, recueillir les supernatants et remplacer par 400 μL de PBS frais.
    3. Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier les intensités de fluorescence dans les supernatants recueillis.
      REMARQUE : Utilisez ex/em de 416 nm/514 nm pour l’acriflavine.
  2. Antigène
    1. Incuber des polybulbulles avec sérum d’albumine bovine centré (BSA)-488 en 400 μL de PBS à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA.
    2. À chaque point de temps, recueillir les supernatants et remplacer par 400 μL PBS frais.
    3. Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier les intensités de fluorescence dans les supernatants recueillis. Utilisez ex/em de 497 nm/520 nm pour BSA-488.
      REMARQUE : L’étude de libération à 70 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA ne doit pas être menée pour éviter d’exposer l’antigène à des températures extrêmes.

7. Toxicité

  1. Quantification de la teneur en chlore dans les polybulles à l’aide de l’analyse d’activation des neutrons (NAA)
    1. Utilisez des polybulles qui ont été lyophilisés pendant 2, 4, 6, 20 et 24 h pour cette étude à 0,010 mBar vide et à -85 °C.
    2. Mesurez 5 à 9 mg de polybulles et placez-les sur des flacons d’irradiation LDPE.
    3. Préparer 1000 g/mL de solution d’étalonnage du chlore à partir de la solution d’étalonnage traçable de l’Institut national des normes et de la technologie (NIST).
    4. Utiliser le réacteur Triga de 1 mégawatt pour effectuer des irradiations de neutrons sur chaque échantillon à un taux de fluence neutronique de 9,1 ×10 12 /cm2·s pour 600 s.
    5. Transférer les polybulles dans des flacons non irradiés.
    6. Utilisez le détecteur HPGe pour obtenir des spectres de rayons gamma pendant 500 s après 360 s intervalles de décomposition.
    7. Utilisez le logiciel NAA de canberra Industries pour analyser les données.
  2. Quantification de la teneur en chlore libérée par les polybulles à l’aide de NAA
    1. Incuber des polybulles qui ont été lyophilisés pendant la nuit (à 0,010 mBar vide et à -85 °C) dans 400 μL de PBS à 37 °C.
    2. Recueillir les supernatants aux semaines 1, 2 et 3 après incubation.
    3. Analyser les supernatants pour la teneur en chlore à l’aide de NAA en utilisant la même méthode que celle décrite ci-dessus à l’étape 7.1.

8. AuNR Synthesis par Kittler, S., et al.8

  1. Préparer la solution d’ensemencement AuNR en mélangeant 250 μL d’acide chloroaurique de 10 m MM (HAuCl4),7,5 mL de bromure de cétrimonium de 100 mM (CTAB) et 600 μL de 10 m M de borohydrure de sodium glacée (NaBH4).
  2. Préparer la solution de croissance en mélangeant 40 ml de CTAB de 100 mM, 1,7 mL de 10 mM HAuCl4,250 μL de nitrate d’argent (AgNO3)et 270 μL de 17,6 mg/mL d’acide ascorbique à un tube.
  3. Mélanger vigoureusement 420 μL de solution de semences avec la solution de croissance à 1200 tr/min pendant 1 min. Ensuite, laissez le mélange tranquille pour réagir pendant 16 h.
  4. Retirer l’excédent de réactifs du mélange en centrifuge à 8000 × g pendant 10 min et jeter le supernatant.

9. Hydrophobicization of AuNRs par Soliman, M.G., et coll.9

  1. Ajuster le pH de 1,5 mL d’AuNR synthétisés ctab-stabilisés à 10 à l’aide d’hydroxyde de sodium de 1 mM (NaOH).
  2. Remuer la solution avec 0,1 mL de 0,3 m M de PEG méthylé (mPEG) thiol à 400 tr/min pendant la nuit.
  3. Mélanger les auNRs PEGylated avec 0,4 M de dodécylamine (DDA) en chloroforme à 500 tr/min pendant 4 jours.
  4. Pipet la couche organique supérieure contenant des auNR hydrophobes et stocker à 4 °C jusqu’à l’utilisation future.

10. NIR-activation des polybulles

  1. Mélanger la solution polymère (PLGADA ou PCL/PCLTA) avec des AuNR hydrophobes dans un 1:9 (vol/vol).
  2. Ajouter le photoinitiator au mélange polymère-AuNR dans un 0.005:1 (vol/vol).
  3. Former des polybulles en injectant le mélange polymère-AuNR dans un flacon en verre de 0,92 mL avec 10 % de CMC (wt/vol) (voir l’étape 2).
  4. Soignez les polybulles à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm2.
  5. Gel éclair dans l’azote liquide pendant 30 s et lyophiliser pendant la nuit à 0.010 mBar vide et à -85 °C.
  6. Séparez les polybulles séchés à l’aide de forceps et lavez-les avec de l’eau DI pour enlever tout CMC résiduel.
  7. Incuber les polybulles dans 400 μL de PBS à 37 °C.
  8. Activez les polybulles à l’aide du laser NIR 801 nm à 8A pendant 5 minutes tous les lundis, mercredis et vendredis.
  9. Prenez des images infrarouges (FLIR) prospectives de la polybulle avant et après l’activation laser pour obtenir des valeurs de température.
  10. Calculez les différences de température entre l’activation au laser avant et après en fonction des valeurs de température des images FLIR.

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Representative Results

Les polybulles ont été largement caractérisés à l’aide de SEM et de NAA. Cargo a été centré avec succès pour entraîner un dégagement retardé. Les polybulles ont également été activés avec succès au laser en raison de la présence d’AuNRs dans les polybulles.

Caractérisation des polybulles
Les polybulles injectées dans une solution aqueuse sans CMC ont donné lieu à une polybulille aplatie en raison de leur contact avec le fond de la fiole de verre (Figure 1A,B). On a observé un aplatissement partiel lorsque 5 % de solution aqueuse à base de CMC a été utilisée à la place de l’eau di (figure 1C). Par la suite, 10 % de solution aqueuse à base de CMC dans la fiole de verre a entraîné la suspension de la polybulille dans la solution et, par conséquent, le maintien réussi de la sphéricité de la polybulle (figure 1D).

Centrage de cargaison
L’injection de cargaison dans la polybulle en l’absence de CMC a entraîné des fuites ne causant aucune rétention de cargaison dans la polybulle (figure 3). Pour contrer ce défi, deux approches ont été utilisées : 1) la viscosité de PCLTA a été augmentée avec succès à l’aide de K2CO3 qui a été isolé après l’endcapping PCL triol avec du triacrylate (figure 2), et 2) la viscosité de la cargaison a été augmentée avec succès après le mélange de la cargaison avec 5 % CMC (figure 3, figure 4). La viscosité des polybulles PLGADA était suffisante pour faciliter le centrage de la cargaison et n’a donc pas été modulée à l’aide de K2CO3.

Fonctionnalité antigène
L’antigène gp120/41 du VIH a été mélangé avec et sans tréhalose avant de s’injecter dans la polybulle (figure 5). On a observé que l’efficacité de liaison de l’anticorps à l’antigène (appelée fonctionnalité) avec et sans tréhalose n’a pas eu de différence statistiquement significative.

Études de libération sans activation laser
Des rejets retardés ont été observés dans les polybulles PLGADA avec de l’acriflavine au milieu les jours 19 et 5 pour les polybulles incubées à 37 °C (figure 6A) et 50 °C (figure 6B), respectivement. Des rejets retardés ont également été observés dans les polybulbulles PCL/PCLTA avec acriflavine au milieu les jours 160 et 60 pour les polybulles incubées à 50 °C (figure 7A) et 70 °C (figure 7B), respectivement. Ces études de libération ont été menées en l’absence d’auNR activables au laser.

Activation laser in vitro des polybulles
Les polybulles avec auNRs dans la coquille ont été activés avec succès au laser plusieurs fois dans les polybulles PLGADA (Figure 8A) et les polybulouilles PCL/PCLTA (Figure 8B). Les variations de température d’avant et après l’activation au laser étaient de 10 ± 1 °C et de 5 ± 1 °C dans les polybulbules PCL/PCLTA avec une concentration d’AuNR plus élevée et inférieure dans la coquille, respectivement. Les changements de température observés avant et après l’activation au laser étaient de 11 ± 2 °C et de 6 ± 1 °C dans les polybulbulles PLGADA avec une concentration d’AuNR plus élevée et inférieure dans la coquille, respectivement.

Figure 1
Figure 1 : Maintien de la sphéricité des polybulles. Images SEM de (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA aplati polybubble en raison du contact de polybulble avec le fond de la fiole de verre; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polybubble du haut qui n’était pas en contact avec le fond de verre; (C) les polybulles PCL/PCLTA avec un moindre degré d’aplatissement lorsqu’ils sont injectés dans une solution de 5 % CMC par rapport à la solution d’eau DI, provoquant la formation d’une forme semblable à l’hémisphère au point de contact avec le flacon; (D) polybubble qui n’a pas atteint le fond de la fiole de verre lorsqu’il est injecté dans une solution de 10% CMC, permettant de maintenir la forme sphérique. Toutes les barres d’échelle indiquées sont de 500 μm. Ce chiffre a été modifié par Lee et coll.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Modulation de la viscosité de l’APTP. La concentration de K2CO3 a été augmentée de 0 à 80 mg/mL dans le PCLTA et on a observé que la viscosité dynamique augmentait proportionnellement avec la concentration de K2CO3. Ce chiffre a été modifié à partir d’Arun Kumar et al10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Injection de cargaison dans la polybulle avec et sans CMC. Le panneau supérieur montre des cadres extraits de la vidéo de fuite de cargaison pendant l’injection en l’absence de CMC. Le panneau inférieur montre des cadres extraits de la vidéo de rétention de cargaison dans le polybulble en présence de 5% CMC. Ce chiffre a été modifié par Lee et coll.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Cargaison centrée. Images au microscope fluorescent de (A) POLYbubble PCL/PCLTA avec cargaison centrée, (B) PCL/PCLTA polybulble avec cargaison dans la coquille et colorant non fluorescent centré. Ce chiffre a été modifié à partir d’Arun Kumar et al10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Fonctionnalité antigène avec tréhalose. La fonctionnalité du GP120/41 du VIH avec et sans tréhalose dans le polybubble a été analysée à l’aide d’ELISA. L’efficacité de liaison d’un anticorps à la protéine est généralement considérée comme un indicateur de la fonctionnalité de la protéine. Lorsque nous discutons de la fonctionnalité de l’antigène dans cette étude, nous avons l’intention de signifier qu’il aide les anticorps liant la protéine d’intérêt (qui est un indicateur pour la fonctionnalité des protéines). Aucune signification statistique n’a été observée entre les deux groupes. Les intervalles de confiance sont indiqués par des lignes solides et pointillées. Ce chiffre a été modifié par Lee et coll.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Rejet retardé des polybulles PLGADA. Études de libération montrant les rejets retardés des polybulbules PLGADA avec acriflavine au milieu à (A) 37 °C, (B) 50 °C. La ligne solide indique la courbe ajustée obtenue en fonction des points de données. Ce chiffre a été modifié à partir d’Arun Kumar et al10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Rejet retardé des polybulbulles PCL/PCLTA. Études de libération montrant les rejets retardés des polybulbules PCL/PCLTA avec acriflavine au milieu à (A) 50 °C, (B) 70 °C.  Ce chiffre a été modifié à partir d’Arun Kumar et al10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Activation laser NIR des polybulles. Changement de température observé avant et après l’activation laser NIR dans (A) POLYbubbles PLGADA, (B) PCL/PCLTA polybulles avec une concentration plus élevée et inférieure d’AuNRs dans la coque polymère. Cette augmentation de la température pourrait être mise à profit pour potentiellement accélérer la dégradation des polymères conduisant à un rejet plus précoce de la cargaison. Ce chiffre a été modifié à partir d’Arun Kumar et al10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Technologies et défis actuels
Les microparticules à base d’émulsion et les nanoparticules ont été couramment utilisées comme vecteurs de livraison de médicaments. Bien que la cinétique de libération de la cargaison de ces dispositifs ont été largement étudiées, le contrôle de la cinétique de libération d’éclatement a été un défi majeur11. La polyvalence et la fonctionnalité du fret sont également limitées dans les systèmes à base d’émulsion en raison de l’exposition de la cargaison à des solvants aqueux et organiques excédentaires. Les cargaisons à base de protéines ne sont souvent pas compatibles avec les micro-et les nanoparticules en raison de la possibilité d’une dénaturation et d’agrégation decargaisons 12. En plus de la stabilité du fret, la cinétique de la cargaison est particulièrement importante dans le contexte des vaccins en raison de la nécessité de plans de rappel conduisant à la séroconversion. Les efforts antérieurs pour relever ces défis dans la livraison de vaccins n’ont pas été suffisamment fructueux, car la notion de systèmes de vaccins à injection unique existe depuis quelques décennies et n’a pas encore été traduite cliniquement.

Notre plate-forme de livraison de vaccins en polybulc peut potentiellement surmonter les défis en augmentant l’exposition de la cargaison au solvant organique en minimisant le volume de chargement exposé. Cette technologie peut potentiellement accueillir au moins deux compartiments de chargement : la cargaison dans la coquille et la cargaison dans le centre. Les polybulles avec cargaison centrée peuvent être utilisés pour contrôler le rejet de la cargaison tout en étant compatibles avec différents types de fret, y compris les petites molécules et l’antigène. Dans cette étude, nous avons utilisé des polyesters avec des temps de dégradation variables, PLGADA (temps de dégradation plus court) et PCL/PCLTA (temps de dégradation plus long), comme les porteurs de polymères et l’acriflavine (petite molécule) comme type de cargaison pour démontrer la libération retardée d’éclatement. Dans les sections suivantes, nous décrivons les étapes cruciales dans la formation de polybulles capables de permettre à la fois la libération retardée et l’activation NIR, en particulier pour les futures applications de livraison à la demande.

Centrage de cargaison dans le polybubble
Le centrage de la cargaison a été l’un des défis importants qui ont été rencontrés lors de la formulation des polybulles. Immédiatement après l’injection, la cargaison migrerait vers la surface et la poche de chargement serait stabilisée sans éclater dans la solution aqueuse de 10 % CMC. Les polybulles avec une telle cargaison décalée peuvent entraîner une libération plus précoce en raison de l’épaisseur non uniforme du polymère entourant la cargaison. La modulation de la viscosité du polymère et de la cargaison était donc cruciale pour résoudre les problèmes liés au centrage des cargaisons. La viscosité de la cargaison a été augmentée en mélangeant la solution de cargaison avec 5% CMC. Pour augmenter la viscosité du polymère, le poids moléculaire du polymère aurait pu être modifié. Cependant, l’augmentation du poids moléculaire entraîne souvent une dégradation plus lente des polymères, ce qui entraîne un retard supplémentaire dans la libération de la cargaison. La viscosité du polymère a donc été modifiée en augmentant la concentration du polymère. Une concentration plus élevée (1000 mg/mL) était suffisante pour augmenter la viscosité de PLGADA. Toutefois, la viscosité de la PCL/PCLTA n’était pas suffisante pour conserver la cargaison au milieu. Ainsi, K2CO3 qui a été isolé après la réaction d’endcapping de PCLTA a été utilisé pour augmenter la viscosité de PCLTA.

Nouvelle sortie retardée
Des rejets retardés ont été observés à partir des études de libération menées à l’aide des polybulles avec la cargaison centrée. Une petite molécule (acriflavine) a été utilisée comme cargaison centrée dans les polybulles pour étudier le profil de libération. Des profils de libération uniques ont été observés en fonction du polyester utilisé en raison de la différence dans le temps de dégradation des polymères. La libération d’éclatement a été observée plus tôt dans les polybulbulles plgada comparés à ceux des polybulbules de PCL/PCLTA. Des rejets précoces de cargaison ont été observés dans les polybulbulles PLGADA parce que PLGA se dégrade plus rapidement que dans le PCL13. Après une modulation réussie de la cinétique de libération avec deux types de polyesters, nous avons également voulu concevoir la polybulle pour potentiellement permettre le dégagement à la demande de la cargaison.

NIR-activation des polybulles
Le rejet à la demande de la cargaison en fonction du moment des besoins des patients a été difficile à réaliser en utilisant les stratégies de livraison actuelles14. Nous avons émis l’hypothèse qu’il pourrait être possible d’accélérer le rejet à la demande du rejet de la cargaison en accélérant la dégradation des polymères grâce à l’utilisation d’agents sensibles au NIR (c’est-à-dire les agents theranostic-habilitant). AuNRs ont été largement étudiés pour leur capacité à être activé à l’aide de laser NIR qui peut voyager de quelques centimètres à travers la peau15. Les auNR stabilisées par le CTAB ont ainsi été préparées sur la base du protocole de Kittler, S et coll. et ont été hydrophobes sur la base des méthodes publiées par Solimon, M.G., et al. Les polybulles avec des auNR hydrophobes dans la coquille ont ensuite été irradiés avec le laser NIR aux points de temps souhaités pendant 5 min pour observer le changement de température. Les températures avant et après le laser ont été mesurées à partir des images FLIR. La coquille de polymère durcie a aidé à préserver la forme des AuNR pendant l’activation laser permettant ainsi de multiples activations NIR de polybulles. Il s’agit d’une observation intéressante parce que dans la littérature précédente, AuNRs ont souvent été connus pour perdre leur forme de tige (cruciale pour l’activation NIR) en raison de l’activation laser16. L’activation au laser réussie des polybulles avec auNR pourrait ouvrir la voie au contrôle de la libération à la demande de la cargaison dans la prochaine génération de polybulles.

Importance et applications futures
Les résultats obtenus de cette étude montrent donc que les polybulles ont le potentiel d’être utilisés comme une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins. La préparation de polybulles décrit dans cet article permettra d’autres chercheurs d’utiliser des polybulbbles comme plate-forme de livraison pour d’autres applications thérapeutiques. Par exemple, en plus de la livraison de vaccins, les polybulles peuvent également être utilisés potentiellement pour la livraison d’agents thérapeutiques synergiques avec une cinétique de libération variable. En outre, les polybulles sont faites de polyesters qui sont biodégradables et ont été utilisés dans de nombreux dispositifs médicaux approuvés par la FDA. Nous avons en outre validé la sécurité des polybulles en montrant que le chlore libéré par les polybulles sont bien dans les niveaux de sécurité recommandés par l’EPA17. Ainsi, notre nouvelle plate-forme de polybulisure injectable et UV a le potentiel d’être utilisée comme plate-forme de livraison de médicaments sûre et efficace pour une variété de types de cargaison.

Limitations de cette technologie
La technologie de la plate-forme polybulble peut être utilisée comme plate-forme de livraison de vaccins permettant potentiellement une libération contrôlée. Nos études mettent en évidence la polyvalence de cette plate-forme capable de livrer différents types de fret, y compris les antigènes et les petites molécules. Cependant, l’une des limites actuelles de cette technologie est que la cargaison est actuellement injectée manuellement. À des fins de mise à l’échelle, nous sommes en train d’concevoir une plate-forme automatisée qui permettra l’injection (c.-à-d. comme un tableau) de marchandises dans la polybulle et pourrait aider à atténuer les préoccupations concernant la translatabilité de cette technologie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Dr Bryan E. Tomlin affilié au laboratoire d’analyse élémentaire du département de chimie de TAMU qui a participé à l’analyse de l’activation des neutrons (NAA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution Thermo scientific 34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone TCI AMERICA H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab17152
Acryloyl chloride Sigma Aldrich A24109-100G
Acriflavine Chem-Impex International 22916
Anhydrous ethyl ether Fisher Chemical E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BioReagents BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates Invitrogen A13100
Bromosalicylic acid Acros Organics AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC) Millipore Sigma 80502-040
Centrimonium bromide (CTAB) MP Biomedicals ICN19400480
Chloroform Fisher Chemical C2984
Coating buffer Abcam ab210899
Dichloromethane (DCM) Sigma Aldrich 270997-1L
Diethyl ether Fisher Chemical E1384
Dodeacyl Amine Acros Organics AC117665000
Doxorubicin hydrochloride Fisher BioReagents BP251610
L-ascorbic acid Acros Organics A61 100
Legato 100 Syringe Pump KD Scientific 14 831 212
mPEG thiol Laysan Bio NC0702454
Nonfat dry milk Andwin Scientific NC9022655
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Phosphate saline buffer Fisher BioReagents BP3991
(Poly(caprolactone) Sigma Aldrich 440744-250G
(Poly(caprolactone) triol Acros Organics AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate CMTec 280050
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein Abcam ab49054
Silver nitrate Acros Organics S181 25
Sodium borohydride Fisher Chemical S678 10
Tetrachloroauric acid Fisher Chemical G54 1
Trehalose Acros Organics NC9022655
Triethyl amine Acros Organics AC157910010

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References

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Biologie numéro 164 vaccin à injection unique polybulle dépôt de polymères maladies infectieuses sensible au NIR rafale retardée
Production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale
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Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C.… More

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).

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