이 문서는 접합체 perivitelline 공간으로 바이러스 현탁액의 다중 주사를 사용하여 쥐 배아에 있는 lentiviral transgenesis를 위한 방법론을 제공하는 것을 작정입니다. 다른 지배적 인 모피 색상과 비옥한 남성 균주와 교교 여성 쥐는 의사 임신 수양 어머니를 생성하는 데 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
형질전환 동물 모델은 현대 생물 의학 연구에 근본적으로 중요합니다. 초기 마우스 또는 쥐 배아에 외국 유전자의 통합은 살아있는 유기체에 있는 유전자 기능 분석을 위한 귀중한 공구입니다. 표준 트랜스제네시스 방법은 수정된 난모세포의 프로핵으로 외래 DNA 단편을 미세 주입하는 것을 기반으로 합니다. 이 기술은 마우스에서 널리 사용되지만 다른 동물 종에서 상대적으로 비효율적이고 기술적으로 요구되는 상태로 남아 있습니다. 이식 유전자는 또한 lentiviral 감염을 통해 1 세포 단계 태아로 소개될 수 있습니다, 표준 pronuclear 주입에 효과적인 대안을 제공하, 특히 더 도전적인 배아 구조물을 가진 종 또는 긴장에서. 이 접근법에서, 렌티바이러스 벡터를 포함하는 현탁액은 기술적으로 덜 까다롭고 더 높은 성공률을 가지고 있는 수정된 쥐 배아의 perivitelline 공간으로 주입된다. 렌티바이러스 벡터는 안정적인 형질전환 라인의 생성을 결정하기 위해 게놈 내로 이식유전자를 효율적으로 통합하는 것으로 나타났다. 몇 가지 제한에도 불구하고 (예를 들어, 생물 안전성 수준 2 요구 사항, DNA 단편 크기 제한), 렌티바이러스 트랜스제네시스는 신속하고 효율적인 트랜스제네시스 방법이다. 추가적으로, 다른 지배적인 모피 색깔을 가진 비옥한 남성 긴장과 결합되는 암컷 쥐를 사용하여 의사 임신 수양 어머니를 생성하는 대안으로 제출됩니다.
서론
몇 년 동안, 실험실 설치류, 쥐와 쥐 등, 인간의 생리 및 병 적 조건을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. 동물 연구는 다른 방법으로 는 달성 할 수없는 발견으로 이어졌다. 처음에, 유전 학문은 인간 상태를 밀접하게 모방하기 위하여 여겨지는 자발적으로 생기는 무질서 및 표현형의 분석에 집중했습니다1. 유전 공학 방법의 발달은 특정 유전자의 소개 또는 삭제가 원하는 표현형을 얻기 위하여 허용했습니다. 따라서, 형질전환 동물의 생성은 살아있는 유기체에 있는 유전자 기능의 연구를 허용하는 현대 연구에서 근본적인 기술로 인식되고 있습니다.
형질전환 동물 기술은 실험적인 발생학과 분자 생물학에 있는 성과의 조합을 통해 가능하게 되었습니다. 1960년대에 폴란드의 배아학자 A. K. Tarkowski는 발달2의초기 단계에서 마우스 배아 조작에 대한 첫 번째 작업을 발표했습니다. 추가적으로, 분자 생물학자는 동물의 게놈으로 외국 DNA의 interalia 소개를 위한 DNA 벡터 (즉, 운반대)를 생성하는 기술을 개발했습니다. 이들 벡터는 수행되는 연구의 유형에 따라 선택된 유전자의 전파 및 이들의 적절한 변형을 허용한다. 용어 "형질 전환 동물"고든과 러들 에 의해 ....
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프로토콜
바이러스 벡터의 생산 및 적용은 생물 안전 성 수준 2 지침에 따라 폴란드 환경부의 승인을 받았습니다. 아래에 설명된 모든 실험 동물 절차는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 안정된 온도(21-23°C)와 습도(50-60%)에서 개별적으로 통풍이 잘 되는 케이지에 보관되었습니다. 12 시간 / 12 h / 12 h 의 빛 / 어두운 주기에서 물과 음식에 대한 광고 리비텀 액세스.
1. 렌티 바이러스 벡터 생산
- HEK 293T 세포의 형질감염
참고: 본원에 제시되는 프로토콜은 약 200 mL의 조질 벡터 상판을 생산하는 20Ø10 cm 배양 접시의 형질화를 위해 설계된다.- 배양 HEK 293T 세포는 37°C에서 가습된CO2 인큐베이터에서 태아 소 혈청(10%, v/v)으로 보충되는 DMEM 배지에서. 형질 감염의 경우, 접시 당 20cm 직경 플레이트, 씨앗 1.5-2 x 106 HEK 293T 세포를 준비합니다.
- 합류가 ~70%에 도달하면, DNA의 1 μg 당 PEI의 3 μg의 비율로 폴리에틸렌민 (PEI) 시약, pH 7.0을 사용하여 세포를 트랜스펙트.
- 다섯 접시에 대한 형질 전환 혼합물을 준비 (요리의 총 수에....
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결과
본 원에 기재된 프로토콜을 사용하여, Syn-TDP-43-eGFP 구제를 운반한 렌티바이러스 벡터를 생산하였다(물리적 LV 이터 = 3.4 x 10 8/μL) 이어서 1단계 배아 서브구역 주사에 사용될 수 있었다.8 두 개의 눈에 보이는 전핵구를 가진 배아만 시술을 받았다. 바이러스 현탁액의 주사 수는 실험적으로 결정되었다. 높은 이식 효율과 형질전환 자손의 동시 부족은 성공적인 형질 전환에 대한 바이러스 입자의 부족의 지표로 간주되었다. 이 경우 주사 횟수가 증가했습니다. LV의 단 하나 관리는 20F0 세대 쥐의 출생 귀착되었습니다, 어느 것도 형질 전환되지 않았습니다. 한 단계의 크기의 주사 수가 증가하면 쥐가 태어나지 않았지만 배아의 100 %가 2 세포 단계로 발전했습니다. 후속 실험에서, 주사의 수는 자손이 얻은 값과 비교하여 하나씩 증가하였다. 2개의 주사의 변이체에 대해, 8마리의 쥐가 태어났고, 그 중 3마리가 이식유전자를 운반하는 것으로 확인되었다(표 1에요약됨.......
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토론
형질전환 기술의 발전으로 설치류 모델은 생물 의학 연구에서 귀중한 도구로 만들었습니다. 그(것)들은 생체 내에서 유전자형 표현형 관계를 공부하는 기회를 제공합니다. 여기서, 우리는 핵 주사에 의한 종래의 종래의 기진에 대해 널리 이용 가능한 대안을 제시한다. 렌티 바이러스 유전자 전달의 사용은 바이러스 벡터가 조나 pellucida의 밑에 주입될 수 있기 때문에 까다로운 미세 주입을 위한 필요를 우회합니다. 이 접근은 본질적으로 주입된 zygotes를 위한 100% 생존율을 보장하는 태아 무결성에 영향을 미치지 않습니다. 렌티바이러스 벡터를 통해 통합되는 이식유전자는 숙주 게놈에 안정적으로 통합되어 장기 발현 및 생식선 전달을 허용한다. 추가적으로, 우리는 어머니를 양육하기 위하여 수정한 태아 전송을 위한 2개의 대체 기술을 제시합니다. 1개의 기술은 vasectomized 불임 수컷과 교배해서 이전에 준비된 의사 임신 한 여성에 태아 전송을 이용합니다. 다른 기술은 비옥한 수컷과 교제되지만 다른 모피 색상 (즉, BN 쥐)과 .......
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공개 사항
저자(W.K.)는 폴란드 특허청으로부터 "형질전환동물의 생산방법"에 대한 특허권(P 355353; 21.03.2008)을 가지고 있다.
감사의 글
이 연구는 폴란드 과학 재단의 팀 테크 코어 시설 플러스 프로그램 내 ANIMOD 프로젝트에 의해 지원되었으며, 유럽 지역 개발 기금에서 WK에 따라 유럽 연합 (EU)이 공동 으로 자금을 지원했습니다.
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재료
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| 보라실리케이트 유리 모세관 필라멘트 GC100TF-15 | Harvard Apparatus Limited | 30-0039 | 주입 모세관 |
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| Butomidor 10 mg/ml (butorphanol tartrate) | Orion Pharma | N/A | 1 mg/kg |
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| CELLSTAR 조직 세포 배양 접시 60-mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
| Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ | ml cp-pharma | N/A | 0.5 mg/kg |
| Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin | Intervet | N/A | 150 IU/ml ml 0.9% NaCl |
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| DNase, RNase-free | A& A 생명공학 | 1009-100 | |
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| 온난화 플레이트 | Semic | N/A | |
| 시계 제작자 집게 | VWR | 470018-868 |
참고문헌
- Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
- Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, ....
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