Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Resumo

Este artigo tem como objetivo fornecer a metodologia para transgênese lentiviral em embriões de ratos usando múltiplas injeções de uma suspensão do vírus no espaço de perivitelline zigogote. Ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é usado para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Resumo

Modelos animais transgênicos são fundamentalmente importantes para a pesquisa biomédica moderna. A incorporação de genes estrangeiros em embriões de camundongos ou ratos primitivos é uma ferramenta inestimável para a análise da função genética em organismos vivos. O método de transgênese padrão é baseado na microinjeção de fragmentos de DNA estranho susceptante em um pronúcleo de um oócito fertilizado. Esta técnica é amplamente utilizada em camundongos, mas permanece relativamente ineficiente e tecnicamente exigente em outras espécies animais. O transgene também pode ser introduzido em embriões em estágio unicelular através de infecção lentiviral, fornecendo uma alternativa eficaz às injeções pronuclears padrão, especialmente em espécies ou cepas com uma estrutura de embriões mais desafiadora. Nesta abordagem, uma suspensão que contém vetores lentivirais é injetada no espaço perivitelline de um embrião de rato fertilizado, que é tecnicamente menos exigente e tem uma taxa de sucesso maior. Os vetores lentivirais mostraram incorporar eficientemente o transgene no genoma para determinar a geração de linhas transgênicas estáveis. Apesar de algumas limitações (por exemplo, requisitos de Biossegurança Nível 2, limites de tamanho do fragmento de DNA), a transgênese lentiviral é um método de transgênese rápida e eficiente. Além disso, o uso de ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é apresentado como uma alternativa para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Introdução

Por muitos anos, roedores de laboratório, como ratos e camundongos, têm sido usados para modelar condições fisiológicas e patológicas humanas. A pesquisa em animais levou a descobertas que eram inatingíveis por qualquer outro meio. Inicialmente, estudos genéticos se concentraram na análise de distúrbios e fenótipos de ocorrência espontânea que são considerados para imitar de perto a condição humana¹. O desenvolvimento de métodos de engenharia genética permitiu a introdução ou exclusão de genes específicos para obter um fenótipo desejado. Portanto, a geração de animais transgênicos é reconhecida como uma técnica fundamental na pesquisa moderna q....

Protocolo

A produção e aplicação de vetores virais estava de acordo com as diretrizes do Nível 2 de Biossegurança e foi aprovada pelo Ministério do Meio Ambiente polonês. Todos os procedimentos experimentais em animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Deética Local. Os animais foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente a uma temperatura estável (21-23 °C) e umidade (50-60%) com acesso a ad libitum à água e alimentos sob um ciclo de luz/escuridão de 12 h/12 h.

1. Produção de vetores lentivirais

1. Transfecção de células HEK 293T
   NOTA: O protocolo aqui apresentado é projetado para a transfecção de vinte pratos de cultura....

Resultados

Utilizando-se o protocolo descrito aqui, foram produzidos vetores lentivirais que carregavam o construto Syn-TDP-43-eGFP (título de LV físico = 3,4 x 10⁸/μL) e, em seguida, poderiam ser utilizados para injeções subzonais de embriões em estágio de célula. Apenas embriões com duas pronucéis visíveis foram submetidos ao procedimento. O número de injeções de suspensões virais foi determinado experimentalmente. Alta eficiência de implantação e falta simultânea de descendentes transgênicos foram considerados indicad.......

Discussão

Os avanços nas tecnologias transgênicas tornaram os modelos de roedores uma ferramenta inestimável na pesquisa biomédica. Eles oferecem a oportunidade de estudar relações genótipo-fenótipo in vivo. Aqui, apresentamos uma alternativa amplamente disponível para transgênese convencional por injeções pronucleares. O uso da transdução do gene lentiviral ignora a necessidade de exigir microinjeções porque vetores virais podem ser injetados sob a zona pellucida. Essa abordagem não afeta a integridade do embrião, o que essencial.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
7500 Sistema de PCR em Tempo Real	Applied Biosystems
Aerrane (isoflurano)	Baxter	FDG9623
Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas	Sigma	A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml	Eurovet Animal Health BV	N/A	0,5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)	Bayer	N/A	5-10 mg/kg
Capilares de vidro borossilicato com filamento GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	injeção capilar
Bupivacaína 25 mg/ml	Advanz Pharma	N/A	0,25% em  0,9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorfanol  tartarato)	Orion Pharma	N/A	1 mg/kg
CELLSTAR Placa de Cultura de Células de Tecido 35-mm	Greiner Bio-One	627160
Placa de Cultura de Células de Tecido CELLSTAR 60-mm	Greiner Bio-One	628160
CellTram Oil	Eppendorf	5176 000.025
Cepetor (Medetomidina) 1 mg/ml	cp-pharma	N/A	0.5 mg/kg
Chorulon, Gonadotrofina Coriônica Humana	Intervet	N/A	150 UI/ml ml 0,9% NaCl
DMEM baixa glicose	Sigma Aldrich	D6048
DNase, livre de RNase	A& A Biotechnology	1009-100
EmbryoMax Óleo Mineral Leve Filtrado	Sigma	ES-005-C
Envelope protein coding plasmid para vetores lentivirais (VSVg plasmid)	ADDGENE	14888
FemtoJet	Eppendorf	4i /5252 000.013
Soro Fetal Bovino	Sigma Aldrich	F9665-500ML
Folligon, Égua Grávida' s Gonadotrofina sérica	Intervet	N/A	125 UI/ml em células HEK
293T	ATCC	ATCC CRL-3216
Hialuronidase de testículo bovino	Sigma	H4272-30MG	0.5 mg/ml em microscópio invertido médio M2
	Zeiss	Axiovert 200
Cetamina 100mg/ml	Biowet Pulawy	N/A	50 mg/kg
Parafina Líquida	Merck Millipore	8042-47-5
M16 médio EmbryoMax	Sigma	MR-016-D
M2 médio	Sigma	M7167
Cloreto de Magnésio 1M	Sigma Aldrich	63069-100ML
Óleo Mineral Microforge	Narishige	MF-900
	Sigma	M8410-500ML
NaCl 0.9%	POLPHARMA OTC	N/A	estéril, ampolas de 5ml
Microscópio de operação	Inami Ophthalmic Instruments	Deca-21
Sistema de embalagem que codifica plasmídeo para vetores lentivirais  (plasmídeo delta R8.2)	ADDGENE	12263
PEI reagente (Polietilenimina, Mw ~ 25,000,),	Polysciences, Inc	23966-1
Penicilina-estreptomicina	Sigma Aldrich	P0781-100ML
Tamponado com Fosfato Salino, pH 7.4, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células	Sigma Aldrich	806552-500ML
Extracter	Sutter Instrument Co.	P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips	World Precision Instruments	500345/500346
Safil, ácido poliglicólico, trançado, revestido, fios absorvíveis	B.Braun Estereomicroscópio Cirúrgico	1048029
	Olympus	SZX16
Costura Cirúrgica	B.Braun
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4334973
Tolfedine 4% (ácido tolfenâmico)	Vetoquinol	N/A	2 mg/kg
TransferMan NK2	Eppendorf	N/A
Tripsina EDTA solução	Sigma Aldrich	T3924-500ML
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
VacuTip	Eppendorf	5175108.000	suportes capilar
Vita-POS	Ursapharm	N / A	pomada para os olhos
Placa de aquecimento	Semic	N / A
Relojoeiro Fórceps	VWR	470018-868

de NaCl de 9% Linha de C1048040