Summary
É apresentado um protocolo para a geração de paisagens químicas dinâmicas por fotolise dentro de configurações microfluidas e milfluidas. Essa metodologia é adequada para estudar diversos processos biológicos, incluindo o comportamento motil, a absorção de nutrientes ou adaptação a produtos químicos de microrganismos, tanto no nível celular quanto populacional.
Abstract
Demonstramos um método para a geração de pulsos químicos controlados e dinâmicos — onde o quimioatrativo localizado se torna subitamente disponível na microescala — para criar microambientes para experimentos microbiano de quimioterapia. Para criar pulsos químicos, desenvolvemos um sistema para introduzir fontes de aminoácidos quase instantaneamente por fotolise de aminoácidos enjaulados dentro de uma câmara microfluida de polimetilsiloxano (PDMS) contendo uma suspensão bacteriana. Aplicamos esse método à bactéria quimotática, Vibrio ordalii, que pode escalar ativamente esses gradientes químicos dinâmicos enquanto é rastreado por microscopia de vídeo. Os aminoácidos, tornados biologicamente inertes ('enjaulados') por modificação química com um grupo de proteção fotoremovível, estão uniformemente presentes na suspensão, mas não estão disponíveis para consumo até sua liberação repentina, que ocorre em pontos definidos pelo usuário no tempo e espaço por meio de um feixe LED focado em UV-A próximo. O número de moléculas liberadas no pulso pode ser determinado por uma relação de calibração entre o tempo de exposição e a fração incessante, onde o espectro de absorção após a fotolise é caracterizado pelo uso da espectroscopia UV-Vis. Uma membrana policarbonato nanoporosa (PCTE) pode ser integrada ao dispositivo microfluido para permitir a remoção contínua pelo fluxo dos compostos sem tampa e da mídia gasta. Uma ligação forte e irreversível entre a membrana PCTE e a estrutura microfluida PDMS é alcançada revestindo a membrana com uma solução de 3 aminopropidaltriethoxysilane (APTES) seguida pela ativação plasmática das superfícies a serem ligadas. Um sistema controlado por computador pode gerar sequências definidas pelo usuário de pulsos em diferentes locais e com diferentes intensidades, de modo a criar paisagens de recursos com variabilidade espacial e temporal prescrita. Em cada paisagem química, a dinâmica do movimento bacteriano na escala individual e seu acúmulo no nível populacional podem ser obtidas, permitindo assim a quantificação do desempenho quimotático e seus efeitos sobre as agregações bacterianas em ambientes ecologicamente relevantes.
Introduction
Micróbios dependem de quimotáxis, processo de detecção de gradientes químicos e modificação da motilidade na resposta1, para navegar em paisagens químicas, abordar fontes de nutrientes e hospedeiros e escapar de substâncias nocivas. Esses processos de microescala determinam a cinética macroescala das interações entre micróbios e seu ambiente2,3. Os recentes avanços em microfluidos e tecnologias de microfabricação, incluindo alitografia4, revolucionaram nossa capacidade de criar microambientes controlados para estudar as interações dos micróbios. Por exemplo, experimentos anteriores estudaram quimiotáxibacteria susindo gerando gradientes altamente controlados e estáveis de concentrações intermediárias a altas de nutrientes5,6. No entanto, em ambientes naturais, gradientes químicos de microescala podem ser de curta duração — dissipados por difusão molecular — e as condições de fundo são muitas vezes altamente diluídas7. Para medir diretamente a resposta quimiotática de populações microbianas expostas pela primeira vez a ambientes químicos instáveis, criamos e aqui descrevemos métodos para combinar tecnologia microfluida com fotolise, imitando gradientes que as bactérias selvagens encontram na natureza.
A tecnologia uncing emprega sondas sensíveis à luz que encapsulam funcionalmente biomoléculas de forma inativa. A irradiação libera a molécula enjaulada, permitindo a perturbação direcionada de um processo biológico8. Devido ao rápido e preciso controle da química celular que o uncaging oferece9,a fotolise de compostos enjaulados tem sido tradicionalmente empregada por biólogos, fisiologistas e neurocientistas para estudar a ativação dos genes10, canais íons11e neurônios12. Mais recentemente, os cientistas aproveitaram as vantagens significativas da fotolise para estudar quimotaxe13, para determinar a dinâmica de troca de flagella de células bacterianas individuais expostas a um estímulo quimioatraidor depassos 14,15, e para investigar padrões de motilidade de células de esperma única em gradientes tridimensionais (3D)16.
Em nossa abordagem, implementamos a fotolise de aminoácidos enjaulados dentro de dispositivos microfluidos para estudar a resposta comportamental de uma população bacteriana a pulsos químicos controlados, que se tornam quase instantaneamente disponíveis através da foto-lançamento. O uso de um objetivo de baixa ampliação (4x) (NA = 0,13, profundidade de foco aproximadamente 40 μm) permite tanto a observação da resposta agregadora em nível populacional de milhares de bactérias sobre um grande campo de visão (3,2 mm x 3,2 mm), quanto a medição do movimento no nível unicelular. Apresentamos duas aplicações deste método: 1) a liberação de um único pulso químico para estudar a dinâmica de acumulação bacteriana-dissipação a partir de condições uniformes, e 2i) a liberação de pulsos múltiplos para caracterizar a dinâmica de acumulação bacteriana em condições de quimioterapia variadas e espacialmente heterogêneas. Este método foi testado na bactéria marinha Vibrio ordalii realizando quimioterapia em direção ao glutamato aminoácido17,mas o método é amplamente aplicável a diferentes combinações de espécies e quimioatraintes, bem como a processos biológicos além da quimotaxe (por exemplo, absorção de nutrientes, exposição a antibióticos, sensoriamento de quórum). Essa abordagem promete ajudar a elucidar a ecologia e o comportamento dos microrganismos em ambientes realistas e descobrir as trocas ocultas que as bactérias individuais enfrentam ao navegar por gradientes dinâmicos efêmeros.
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Protocol
1. Fabricação do Dispositivo Microfluido para o Experimento Único de Pulso Químico
- Projete o canal usando o software de design auxiliado por computador (CAD) e imprima-o em um filme de transparência para criar a máscara fotográfica (Figura 1A).
- Fabricar o mestre por litografia suave (em condições de sala limpa).
- Limpe um wafer de silício (4 polegadas) em rápida sucessão com acetona, metanol e isopropanol, depois seque usando nitrogênio. Asse o wafer no forno a 130 °C por 5 min.
- Coloque o wafer no centro de um spin-coater e despeje foto SU-8 fotoresistem no wafer. Aumente a velocidade do spin-coater até 500 rpm acima de 5 s, e mantenha-se a 500 rpm por 10 s. Rampa até a velocidade final acima de 10 s e mantenha-se a esta velocidade para 30 s.
NOTA: O valor exato da velocidade final depende da espessura de revestimento direcionada e do SU-8 usado. - Após o processo de revestimento de spin, asse o wafer a 65 °C e depois a 95 °C. Deixe o wafer esfriar à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 5 min.
NOTA: O tempo de cozimento depende da espessura direcionada e tipo de fotoresiste usado. Como regra geral, para cada camada de 100 μm o wafer deve ser assado por 5 min a 65 °C e 45 min a 95 °C. - Coloque a máscara fotográfica no wafer para garantir que apenas a região de interesse seja exposta e polimerizada. Expor à luz UV pelo tempo recomendado no manual SU-8.
NOTA: Aqui, com energia de exposição de 200 mJ cm-2 a um comprimento de onda de 350 nm, o wafer foi exposto por 150 s. - Asse o wafer a 65 °C e 95 °C pelo tempo recomendado no manual su-8.
NOTA: Como regra geral, para cada camada de 100 μm o wafer deve ser assado por 5 min a 65 °C e 45 min a 95 °C. - Mergulhe o wafer em um béquer cheio de desenvolvedor de metocrilato de polimetil (PMMA) para obter o mestre. Agite suavemente o béquer para garantir que a fotoresistnão polimerizada seja lavada. Asse o mestre a 200 °C para ligar ainda mais a camada SU-8.
- Prepare uma mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) combinando o elastômero com seu agente de cura(Tabela de Materiais) a uma proporção de 10:1 em um béquer (aqui, 40 mL). Misture vigorosamente até que o líquido seja homogêneo.
NOTA: A mistura PDMS parecerá opaca porque as bolhas são geradas durante o processo de mistura.
ATENÇÃO: Para evitar que a pele entre em contato com produtos químicos ou materiais biológicos potencialmente perigosos, use sempre um jaleco e luvas de plástico descartáveis em todo o protocolo e siga quaisquer protocolos de segurança específicos de acordo com o Material Ficha de dados de segurança (MSDS). - Degasa a mistura PDMS em uma câmara de vácuo por 45 min na RT. Para agilizar o processo, libere periodicamente o vácuo para estourar as bolhas que se formam na interface.
NOTA: O processo de degasagem deve ser realizado dentro de 1h para evitar que a mistura de PDMS comece a curar. - Retire a poeira da superfície do mestre com um limpador pressurizado, em seguida, despeje a mistura de PDMS desgasejado no mestre e asse em um forno a 80 °C por 2 h.
NOTA: Alternativamente, assar durante a noite (ou por pelo menos 12 h) a 60 °C alcançaria o mesmo PDMS endurecido. - Corte o PDMS com uma lâmina ao redor das microestruturas (a uma distância de aproximadamente 5 mm) e, em seguida, retire cuidadosamente o PDMS do mestre.
- Furos para servir como inlet e saída do microcanal (aqui, uma dentro e uma tomada, ver Figura 1A). Certifique-se de que nada toque na face inferior do PDMS onde as características estão localizadas.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. O microcanal deve ser selado com fita adesiva para evitar acúmulo de poeira e outras partículas durante o armazenamento. - Conecte o microcanal PDMS a um escorregador de vidro.
- Limpe completamente um toboçador de vidro com sabão, água isopropanol e desonizada. Deixe o vidro deslizar seco ou usar ar comprimido para acelerar o processo.
- Remova partículas de poeira, batendo com fita adesiva. Ligue o microcanal PDMS no escorregador de vidro limpo, imediatamente após tratar ambas as superfícies com plasma (usando um sistema corona ou uma câmara de oxigênio plasmático) por 2 min.
- Coloque o dispositivo microfluido para aquecer em uma placa quente a 80 °C por pelo menos 1h para fortalecer a ligação química com o vidro.
2. Fabricação do dispositivo milífluido impresso em 3D para o experimento com pulsos múltiplos
- Projete a forma 3D usando software de design 3D e imprima o mestre para o molde PDMS com uma impressora 3D de alta resolução(Figura 1B).
NOTA: Consulte tabela de materiais para a impressora 3D e material de molde usado para criar o mestre. - Repita os passos 1.3-1.4, em seguida, limpe a superfície do mestre, batendo com fita adesiva. Coloque o mestre em uma escala, então, evitando a região central do mestre que será ocupada pela membrana, despeje sobre a quantidade exata de mistura de PDMS não curada (aqui, 23,4 g) para obter a altura desejada de PDMS, combinando com a altura do mestre (aqui, 0,5 mm). Remova todas as bolhas restantes com a ajuda de ar comprimido.
- Coloque o PDMS lançado no mestre em um forno a 45 °C para assar por pelo menos 12 h.
- Conecte o molde 3D PDMS a uma placa de Petri.
- Retire delicadamente a camada de PDMS endurecida e perfura a inlet e os furos de saída para a injeção da suspensão bacteriana(Figura 1C).
- Ative tanto a superfície de uma placa de Petri (90 mm x 15 mm) quanto o molde PDMS com plasma de oxigênio por 2 min. Conecte o molde PDMS na placa de Petri. Pressione suavemente o molde para a placa de Petri, mas não pressione onde as características estão localizadas, pois isso pode desmoronar na câmara de interrogatório.
- Coloque a placa de Petri ligada ao molde PDMS 3D em um forno a 45 °C por pelo menos 12 h para fortalecer a ligação química.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
- Funcionalização da superfície da membrana18
- Ative a membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) em uma câmara de plasma de oxigênio por 1 min na RT.
ATENÇÃO: Evite usar um sistema corona para a ativação do plasma porque danificará a membrana. - um capô químico, diluir uma solução comercial de 3 aminopropidaltriethoxysilane (APTES) em água deionizada para 1% em volume (aqui, 40 mL), usando um tubo de polipropileno.
ATENÇÃO: A solução APTES é extremamente tóxica (pontuação 3 de risco à saúde do MSDS) e deve ser tratada com extremo cuidado exclusivamente um capuz químico com luvas. Troque as luvas imediatamente após o manuseio da solução APTES. Os vapores APTES são destrutivos para as membranas mucosas e o trato respiratório superior. Os órgãos-alvo da APTES são nervos, fígado e rim. Se um capô de fumaça não estiver disponível, um escudo facial e um respirador de rosto completo devem ser implementados. - Transfira a solução APTES diluída em uma placa de Petri e mergulhe a membrana ativada na solução APTES por 20 min.
- Remova a membrana da solução APTES com pinças e coloque-a em uma limpeza para secar.
- Ative a membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) em uma câmara de plasma de oxigênio por 1 min na RT.
- Para a fabricação dos canais microfluidos PDMS que ficarão na membrana e permitirão a lavagem da arena bacteriana, repita os passos 1.1-1.7.
- Ligar os canais de lavagem PDMS à membrana funcionalizada.
- Ative tanto o canal de lavagem PDMS quanto a membrana PCTE com uma câmara de plasma de oxigênio por 2 min.
NOTA: A membrana, que será sanduíche entre duas camadas De PDMS, deve ser menor que o canal de lavagem PDMS. - Imediatamente após o tratamento plasmático, coloque a membrana funcionalizada e o canal de lavagem PDMS em contato pressionando suavemente o canal de lavagem PDMS na membrana.
NOTA: Não aplique pressão excessiva nesta fase, pois pode causar (irreversível) fixação da membrana ao teto do canal, bloqueando o canal.
- Ative tanto o canal de lavagem PDMS quanto a membrana PCTE com uma câmara de plasma de oxigênio por 2 min.
- Sanduíche a membrana entre duas camadas PDMS(Figura 1E).
- Ative tanto o canal de lavagem pdms laminado ligado - membrana PCTE quanto o molde 3D PDMS anteriormente ligado à placa de Petri com uma câmara de plasma de oxigênio por 2 min. Leve-os para contato e pressione juntos.
- Coloque a placa petri ligada à estrutura do sanduíche em um forno a 45 °C por pelo menos 12 h para fortalecer a ligação química.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Cultura Celular
- Cresça uma população de V. ordalii (cepa 12B09 ou 12B09pGFP) durante a noite por 20 h em 2216 médio19 em um shaker orbital (600 rpm) a 30 °C e células de colheita em fase exponencial tardia. Para isolados que abrigam pGFP, adicione espectinomicina (50 μg mL-1) para manter o plasmídeo.
- Centrífuga uma alíquota de 1 mL de células a 2500 x g por 3 min, remova o supernatant e resuspenda as células em 1 mL de água do mar artificial filtrada. Repita este passo.
- Fome a população de V. ordalii em um agitador orbital (600 rpm) a 30 °C por 3h.
- Prepare uma solução artificial de água do mar de 10 mM (aqui, 1 mL) de 4-metoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate (MNI-caged-L-glutamato) e armazene a -20 °C.
NOTA: Proteja a soluçãoMNI-caged-L-glutamate da luz ambiente para evitar a foálise. - Diluir as células 50x resuspendendo as células famintas em uma solução artificial de água do mar de 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato.
NOTA: Isso garantirá uma concentração bacteriana final inferior a 5 x 107 mL-1 (o valor exato depende da concentração inicial de células no exponencial tardio, que é tipicamente ~109 mL-1). A concentração bacteriana foi estimada utilizando-se um espectrofotômetro em densidade óptica (OD) de 600 nm.
4. Calibração do Protocolo Descarado
- Coloque uma gota (20 μL) de uma solução artificial de água do mar de MNI-enjaulado-L-glutamate20 em uma concentração C0 = 10 mM em um slide de vidro. Encapsular a gotícula cobrindo-a com uma câmara de PDMS circular (diâmetro d = 5 mm, altura h = 250 μm).
- Coloque o deslizamento de vidro em um palco de microscópio e exponha toda a câmara por 20 ms a um feixe de LED a um comprimento de onda de 395 nm (potência de 295 mW) usando um objetivo de 4x (abertura numérica [NA] = 0,13).
- Abra a câmara PDMS e extrai uma gotícula (1 μL) para análise com um espectrômetro UV-Vis.
- Repita as etapas 4.1-4.3 para diferentes períodos de iluminação led de 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (ou até saturação da reação química) e 0 s (para obter o fundo). Reproduza as etapas do procedimento 4.1-4.4 pelo menos 3x (aqui, 4x).
- Do espectro de absorção, extrair o valor em 405 nm, que representam o pico no espectro de absorção da molécula da gaiola21. Para determinar a taxa k da reação química incessante pela exposição led14,use a seguinte equação cinética de primeira ordem para o ajuste numérico dos dados experimentais17
onde C(t) é o valor do espectro de absorção da solução a 405 nm (após a remoção de antecedentes) com um tempo de sem esclerose de segundos. Por um pequeno tempo de semeado t tal que kt 1, Eq. 1 pode ser simplificado para a formulação linear
5. Experimento de pulso químico único
- Mantenha o canal microfluido vácuo por 20 minutos para reduzir a concentração de gás dentro do PDMS para que as bolhas sejam menos propensas a se formar durante o processo de enchimento.
- Extrair o canal da bomba de vácuo e introduzir imediatamente a suspensão bacteriana diluída em 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato em água do mar artificial para o microcanal usando suavemente uma micropipeta para evitar danos flageladores por forças mecânicas de cisalhamento (aqui, todo o processo de enchimento levou de 5 a 10 s). Depois de encher o canal com a suspensão bacteriana, chupe a solução em excesso com papel toalha e veda a linto e saída com plugues PDMS pressionando-os suavemente para os buracos.
NOTA: Desta forma, o fluxo de fluidos na câmara é impedido. - Coloque o microcanal em um palco de microscópio e mova o palco para definir o campo de visão no meio do canal. Configure o microscópio para realizar imagens em contraste de fase (objetivo 4x) a uma taxa de quadrode de 12 fps.
NOTA: Esse valor pode ser variado, mas não deve ser inferior a 10 fps para permitir a reconstrução das trajetórias bacterianas através da análise de imagens (ver protocolo seção 7). - Coloque o pinhole da viga LED na abertura mínima. Ao definir o tempo de exposição da câmera para 5 s, grave alguns quadros para obter medições precisas da localização espacial e tamanho do feixe led.
NOTA: A fonte de luz LED se conecta ao iluminador epi-fluorescência do microscópio através da conexão de guia de luz líquida. O feixe led não afeta a captura de vídeo, pois a aquisição de vídeo e a estimulação led são comandadas independentemente via software. - Realizar imagens contínuas por uma duração total de 10 min (20 min para o maior pulso químico), e ativar simultaneamente o feixe de LED focado em 395 nm para a duração desejada (neste experimento, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) em um ponto de tempo definido pelo usuário (aqui, 10 s após o início da aquisição de vídeo) via microscópio. Para obter várias réplicas do mesmo processo, mova o palco para registrar a resposta bacteriana sobre diferentes posições do canal microfluido. Reproduza este procedimento para cada tamanho do pulso, usando um novo microcanal.
NOTA: O processo de semeamento gera um pulso cilíndrico eixométrico que difunde radialmente para fora no plano de imagem. - Realizar experimentos separados sem o empenhamento químico em maior ampliação (objetivo de 20x, NA = 0,45) a uma taxa de quadros mais alta (50 fps) para registrar o movimento imparcial de natação das bactérias.
6. Experimento múltiplo de pulso químico
- Mantenha a câmara milifluida vácuo por 20 min.
- Coloque a placa petri contendo a câmara milfluida em um estágio de microscópio. Encha a câmara abaixo da membrana com a suspensão bacteriana diluída (aqui, todo o processo de enchimento levou de 10-15 s) de GFP-fluorescente V. ordalii em 1 mM MNI-caged-L-solução glutamato em água do mar artificial. Depois de encher o canal com a suspensão bacteriana, chupe a solução em excesso com papel toalha e veda a linto e saída com plugues PDMS pressionando-os suavemente para os buracos.
NOTA: Desta forma, o fluxo de fluidos na câmara é impedido. Para permitir uma melhor visualização de bactérias nesta configuração onde a imagem ocorre através da membrana nanoporosa, é fortemente recomendável usar cepas fluorescentes em vez do tipo selvagem (como usado no único experimento químico-pulso). - Encha uma seringa com uma solução artificial de água do mar de 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato e conecte a tubulação à entrada e saída do canal de lavagem acima da membrana.
- Conecte a tubulação a um reservatório de resíduos e certifique-se de que a tubulação está totalmente submersa no reservatório de resíduos fluidos para evitar oscilações de pressão.
- Defina a taxa de fluxo adequada na bomba de seringa (aqui, 50 μL min-1) para obter a taxa média de fluxo desejada no canal de lavagem, que depende da geometria do canal.
- Inicie a bomba de seringa para estabelecer o fluxo no canal de lavagem acima da membrana.
- Execute o software controlando o feixe led e o estágio do microscópio para gerar sequências definidas pelo usuário de pulsos em diferentes locais e com diferentes intensidades.
NOTA: O fluxo contínuo da solução artificial de água do mar de 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato no canal de lavagem acima da membrana reabastece a solução composta enjaulada e lava o meio gasto da arena bacteriana. - Grave vídeo usando um objetivo de 4x em intervalos de tempo regulares durante um período de várias horas e em vários locais contíguos para cobrir uma superfície grande (aqui, 1 cm x 1 cm, Figura 1F).
7. Análise de Imagens e Análise de Dados
- Reconstrução das trajetórias bacterianas
- A partir dos filmes gravados com o objetivo 4x, reconstruir as trajetórias bacterianas usando o software de rastreamento17.
NOTA: Essas trajetórias representam as projeções 2D do movimento bacteriano 3D no microcanal. - A partir das trajetórias bacterianas reconstruídas, determine a velocidade de deriva radial de cada indivíduo nadando projetando sua velocidade de natação sobre a direção em direção ao centro do pulso químico (Figura 2D). Para visualização da dinâmica spatio-temporal da velocidade de deriva radial, use uma grade de binning com tamanho espacial 75 μm x 75 μm e janela temporal de intervalo de 5-10 s(Figura 2D,E).
NOTA: Devido à simetria cilíndrica do processo, os dados podem ser analisados em coordenadas polares e médios sobre a dimensão angular (Figura 3). - A partir das trajetórias bacterianas reconstruídas, determine a dinâmica spatio-temporal da distribuição de bactérias à medida que respondem aos pulsos químicos (Figura 2E).
- A partir dos filmes de maior resolução registrados com o objetivo de 20x durante os experimentos de pulso único, extrair a distribuição da velocidade da natação e correr tempo para a população bacteriana à medida que respondem ao pulso químico (Figura 4).
- A partir dos filmes gravados com o objetivo 4x, reconstruir as trajetórias bacterianas usando o software de rastreamento17.
- Estimar o coeficiente de difusão das bactérias considerando a dinâmica de dissipação da população bacteriana após a quimioterapia ser concluída17 (aqui, para t > 300 s; Figura 3).
- Esgote o coeficiente de difusão do glutamato aplicando a equação de Stokes-Einstein
onde as moléculas de aminoácidos são consideradas partículas esféricas com raio hidrodinâmicode 22rG, kB é a constante boltzmann (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T é a temperatura (296 K), e ele é a viscosidade dinâmica da água do mar artificial (salinidade 36 g kg-1) a 23 °C (10-3 Pa s23)
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Representative Results
Usamos os dispositivos microfluidos e milífluidos(Figura 1)para estudar perfis de acumulação bacteriana em condições dinâmicas de nutrientes. Trajetórias bacterianas foram extraídas de vídeos gravados adquiridos pela microscopia de contraste de fase da dinâmica de acumulação-dissipação de uma população bacteriana após um pulso químico liberado pela fotolise(Figura 2 e Figura 3). Com uma média de milhões de trajetórias, a dinâmica spatiotemporal da velocidade de deriva radial e concentração bacteriana foram obtidas. Estatísticas que descreviam a natação na ausência de um gradiente químico foram obtidas em experimentos separados com maior resolução espacial e temporal (Figura 4).
Figura 1: Dispositivos microfluidos e milífluidos para experimentos bacterianos em condições dinâmicas de nutrientes. (A)Fotomáscara do canal microfluido usado para observar o acúmulo bacteriano a um único pulso químico. (B)Fotomáscara do canal microfluido usado para lavar a câmara bacteriana milfluida para os experimentos multi pulso. Os pequenos pontos são micropilares (200 μm de tamanho) que ajudam a ligar a membrana ao PDMS, e ao mesmo tempo ajudam a evitar que a membrana se entortaou ou colapse no centro. (C)Design do mestre impresso 3D usado para criar a câmara bacteriana. (D)A camada PDMS com a padronização da câmara bacteriana. (E)O dispositivo milífluido completo (vista superior, membrana PCTE em branco). (F)Esquemática do dispositivo milífluido para a geração de condições dinâmicas de nutrientes (visão lateral). O diagrama de raios ópticos é mostrado na parte inferior do dispositivo, onde um feixe violeta (395 nm) executa o emebramento do quimioatraidor, enquanto um feixe azul (independente) (470 nm) é usado para a observação de bactérias fluorescentes (abrigando pGFP) através de uma câmera sCMOS, que captura a densidade bacteriana (centro inferior). O dispositivo é colocado em um estágio motorizado (inferior direito), que pode ser movido no plano x-y para liberar pulsos químicos em posições definidas pelo usuário (controlados via software NIS, inferior esquerdo). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Respostas bacterianas representativas a um pulso químico. (A,B) Projeção de intensidade máxima mostrando posição bacteriana (branca) ao longo de um intervalo de 0,5 s, mostrada(A)imediatamente seguindo, e(B) 40 s após a liberação do pulso (objetivo: 4x, NA = 0,13, Ph 2; gravação de vídeo a 12 fps). (C) Trajetórias bacterianas (pretas) mostraram 60 s após a liberação do pulso. A região sombreada representa o pulso químico liberado pela fotolise a t = 0 s no meio do campo de visão (cruz preta), que posteriormente se difunde. As trajetórias foram reconstruídas usando software interno personalizado. (D,E) Dinâmica temporal da velocidade de deriva radial(D)e da concentração bacteriana(E)após uma liberação de pulso no centro do campo de visão. No painel D, os valores negativos da velocidade de deriva (na cor azul) correspondem ao movimento quimotático direcionado para o centro do pulso. Este número foi modificado após Brumley et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Perfis spatio-temporal da velocidade de deriva radial e concentração bacteriana após uma liberação de pulso químico. (A,B) A velocidade de deriva radial(A)e a concentração bacteriana(B)em função do tempo e distância do centro de um pulso glutamato de 35 μM. No painel A, os valores negativos da velocidade de deriva (na cor azul) correspondem ao movimento quimotático direcionado para o centro do pulso. Os valores foram calculados pela média de todas as trajetórias. A linha preta tracejada em t = 250 s aproximadamente delimita o período de quimotáxi ativo (sombreamento azul no painel A, região I), após o qual as células se difundem isotropicalmente para fora (sombreamento verde no painel A, região II). (C) Concentração bacteriana (redimensionada sobre o fundo B0) como função de distância em t = 10, 30, 60 s após a criação de um pulso químico difuso. Bactérias agregam perto do local do pulso devido à quimiotáxi. (D) A concentração bacteriana leva ~20 min para relaxar ao fundo B0 por difusão bacteriana. O inset mostra o ajuste da difusão difusiva com um coeficiente de difusão de DB = 165 μm2 s-1. Os painéis A, C e D foram modificados de Brumley et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Estatísticas de natação para uma população bacteriana na ausência de gradientes químicos. (A) Trajetórias representam as projeções bidimensionais do movimento bacteriano tridimensional no microcanal. Trajetórias bacterianas são extraídas usando um script personalizado de rastreamento interno. Aqui a cruz azul indica o início da pista, e símbolos vermelhos e verdes indicam eventos de reorientação. Os dados foram registrados a 50 fps com um objetivo de 20x, NA 0,45. (B) Distribuição de probabilidade de velocidade de natação bacteriana medida (preta) juntamente com um ajuste de distribuição gama (azul). Como a profundidade do foco quando a imagem com um objetivo de 20x (NA 0,45) é de apenas alguns mícrons24, as trajetórias registradas são essencialmente planares e as medições da velocidade de natação não são tendenciosas pela projeção. (C) Distribuição de probabilidade do tempo entre sucessivas reorientações. Esses dados foram necessários para calibrar efetivamente um modelo baseado individual que leve em conta o padrão de reorientação, a distribuição da velocidade da natação e as estatísticas de reorientação dos organismos. Este número foi modificado de Brumley et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Esse método permite que os pesquisadores estudem quimotáxis bacterianos gradientes controlados e dinâmicos em dispositivos micro e milífluidos, permitindo a aquisição de dados reprodutíveis. A criação quase instantânea de pulsos químicos na microescala por fotolise visa reproduzir os tipos de pulsos de nutrientes que as bactérias encontram na natureza a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, a disseminação difusiva de plumas atrás de partículas marinhas afundando25, ou o nutriente que se espalha das células fitoplânctons de fitoplâncton26.
Apresentamos duas aplicações deste método: 1) a liberação de um único pulso químico para estudar a dinâmica de acumulação bacteriana-dissipação a partir de condições uniformes, e 2) a liberação de pulsos múltiplos para caracterizar os perfis de acumulação bacteriana em condições de nutrientes não-equilibrium. A primeira aplicação é particularmente adequada para caracterizar as respostas comportamentais dos micróbios ao encontrar pela primeira vez uma fonte de nutrientes. Nessas condições, em que a concentração de moléculas quimioattractantes é extremamente baixa, a fase inicial da quimotaxe é dominada pelos eventos stocásticos de ligação-unbinding de moléculas quimioattractantes aos quimoreceptores17. Nosso método, liberando rapidamente e precisamente uma massa conhecida de quimioatraidor em um fundo de zero nutrientes, oferece vantagens significativas sobre abordagens anteriores para caracterizar a resposta bacteriana em condições dinâmicas27,28,29. As vantagens incluem conhecer a distribuição completa de quimioatrainte em todos os locais e em todos os momentos (já que sua difusividade é conhecida), e evitar completamente a geração de fluxo de fluidos que está inerentemente associada a outros dispositivos, como o microinjetor27 ou três geometrias de três entradas30.
Na segunda aplicação, os pulsos químicos ocorrem em um domínio grande, quase 2D de acordo com uma sequência definida pelo usuário no espaço e no tempo que é totalmente personalizável via software, que pode ser usado para impor sequências aleatórias ou padrões específicos. É importante ressaltar que esse método fornece uma poderosa ligação entre a dinâmica comportamental de alta resolução da quimiotáxi bacteriana e a absorção de nutrientes sobre escalas de tempo de segundos e dinâmicas de longo prazo, como crescimento e potencialmente evolução. A arena bacteriana é consideravelmente maior (2 cm x 2 cm) do que a faixa espacial de interação química das bactérias com um único pulso (de centenas de micrômetros para os menores pulsos a alguns milímetros para os maiores pulsos). A chave para a manutenção de um fundo químico baixo (muito menor do que a concentração dos pulsos químicos em sua liberação) é a inclusão da membrana PCTE nanoporosa entre as duas camadas PDMS18. Ao aplicar um fluxo de fluido no canal microfluido colocado na parte superior do dispositivo, uma lavagem contínua dos compostos sem tampa e gasta média na arena bacteriana é realizada por meio de difusão molecular através da membrana nanoporosa, sem criar fluxo na seção de teste do dispositivo onde as bactérias estão localizadas(Figura 1).
Ao modular o feixe led focado no tempo, amplitude, tamanho e geometria, a tecnologia de fotolançamento dota o experimentador com grande flexibilidade para gerar diferentes tipos de ambientes químicos. Ao mesmo tempo, enquanto os testes aqui apresentados foram realizados em condições quiescentes, nosso método pode ser expandido ainda mais para testar quimiotáxis bacterianos diferentes configurações de fluxo. Ao reconstruir fielmente a dinâmica de acumulação bacteriana através da microscopia de vídeo, nosso método gera grandes quantidades de dados de alta qualidade que podem ser usados para estimar as estatísticas do comportamento bacteriano e a potencial absorção de nutrientes por células bacterianas. Nossa abordagem microfluida experimental, imitando paisagens de nutrientes que as bactérias podem enfrentar condições ambientais naturais, permite o estudo sistemático do comportamento forrageamento de espécies microbianas que são essenciais no ciclismo de nutrientes na escala macroscópica2,3. Como tal, o tipo de dados gerados através dessa metodologia é útil para calibrar efetivamente as taxas de captação populacional e obter melhor cinética de nutrientes em modelos de ecossistema de mesoescala.
A fabricação dos moldes PDMS para fazer a grande arena bacteriana foi realizada por meio de um serviço comercial de impressão 3D. No entanto, resultados semelhantes podem ser alcançados usando uma impressora 3D high-end em casa, com uma resolução de 50-100 μm necessária para resolver as menores características dos designs de microcanais. Uma superfície lisa do material impresso em 3D para o molde PDMS é necessária para obter uma boa ligação entre o PDMS fundido e as outras superfícies do dispositivo (ou seja, vidro, poliestireno, PDMS). Para nossa aplicação, o uso de uma placa de petri de poliestireno (90 mm x 15 mm) como a superfície inferior da arena 3D apresenta duas vantagens sobre o uso de um slide de vidro como comumente empregado em estudos microfluidos: primeiro, reduz consideravelmente a fixação de células bacterianas em comparação com uma superfície de vidro (embora o apego possa depender das propriedades de superfície particulares do micróbio em consideração); segundo, fornece contenção secundária, o que pode evitar vazamento de mídia sobre equipamentos de microscopia em caso de derramamentos. O processo de cura do molde PDMS normalmente ocorre a uma temperatura elevada (70-80 °C), mas nesta aplicação o experimentador deve assar o molde PDMS a uma temperatura consideravelmente menor (45 °C no caso atual, ver Tabela de Materiais),abaixo da deflexão de calor e a temperatura de fusão do material utilizado para a impressão 3D do mestre. A temperatura mais baixa do cozimento alonga consideravelmente o processo de cura (durante a noite), mas não altera as propriedades mecânicas e químicas do PDMS.
Embora nosso método tenha sido aplicado a uma combinação particular de bactérias e quimioatraiant, a metodologia é adequada para testar diversos processos biológicos, incluindo absorção de nutrientes ou exposição a antibióticos, e pode ser aplicada a sistemas modeladores de diferentes espécies e quimioatrativores, dado que uma miríade de moléculas foram (ou podem ser) enjauladas8. Uma limitação potencial decorre dos custos de compostos enjaulados disponíveis comercialmente, mas esses custos são comparáveis aos incorridos ao usar as sondas moleculares tipicamente empregadas nas ciências da vida para viabilidade celular, contagem ou coloração intracelular. Apesar dessa limitação potencial, a metodologia proposta pode encontrar aplicações amplas em ciências biofísicas e biomédicas, para caracterizar respostas precoces e dinâmicas de adaptação de populações microbianas em resolução celular única para gradientes químicos dinâmicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a primeira instalação de microfabricação na ETH Zurique. Este trabalho foi apoiado por um Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (to D.R.B.), um Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (to R.S.), e uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência da Suíça 1-002745-000 (para R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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