Descrevemos um protocolo de inoculação atrasado para gerar infecções crônicas de feridas em camundongos imunocompetentes.
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Artigo de método
Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é um grande patógeno nosocomial de crescente relevância para a saúde e doença humana, particularmente no cenário de infecções crônicas de feridas em pacientes diabéticos e hospitalizados. Há uma necessidade urgente de modelos de infecção crônica para auxiliar na investigação da patogênese ferida e no desenvolvimento de novas terapias contra esse patógeno. Aqui, descrevemos um protocolo que usa inoculação atrasada 24 horas após ferimentos excisional de espessura total. A infecção da matriz de feridas provisórias presente neste momento, ou a liberação rápida ou a disseminação da infecção e, em vez disso, estabelece infecção crônica que dura de 7 a 10 dias sem a necessidade de implantação de materiais estranhos ou supressão imunológica. Este protocolo imita um curso temporal típico de infecção pós-operatória em humanos. O uso de uma cepa luminescente P. aeruginosa (PAO1:lux) permite a avaliação diária quantitativa da carga bacteriana para infecções por feridas P. aeruginosa. Este novo modelo pode ser uma ferramenta útil na investigação da patogênese bacteriana e no desenvolvimento de novas terapias para infecções crônicas de feridas P. aeruginosa.
Introdução
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é uma bactéria em forma de vara gram-negativa com crescente relevância para a saúde e doenças humanas. É responsável pela morbidade e mortalidade extensivas em ambientes nosocomiais, particularmente envolvendo infecções por feridas em pacientes imunocomprometidos1,2. O surgimento de cepas multidrogaresistentes deste patógeno proporcionou mais impulso para a investigação de fatores que contribuem para a virulência P. aeruginosa, mecanismos de resistência a antibióticos P. aeruginosa e novos métodos de prevenção e tratamento desta infecçã....
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Protocolo
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Stanford.
1. Preparação e crescimento de bactérias
- Realizar todo o trabalho com P. aeruginosa e animais com precauções BSL-2 de acordo com o comitê institucional de biossegurança do pesquisador e diretrizes do comitê de uso de animais. Faça todas as etapas descritas aqui envolvendo P. aeruginosa, incluindo a inoculação do rato, em um armário de biossegurança.
- A cepa luminescente PAO1:lux de P. aeruginosa está disponível em nosso laboratório por solicitação. Raia PAO1....
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Resultados
Utilizando uma cepa luminescente de PAO1 com uma codificação plasmídea codificando o sistema de repórteres luxABCDE (PAO1:lux), realizamos ferimentos excisional em camundongos, inoculamos essas feridas com plânctnico P. aeruginosa 24 h depois, e medimos carga bacteriana ao longo do tempo (Figura 1 e Figura 2). Uma imagem representativa obtida usando um sistema óptico de imagem demonstra que este modelo resulta em lumines.......
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Discussão
Desenvolvemos um novo modelo de infecção por feridas de inoculação tardia P. aeruginosa. A estratégia de retardar a inoculação com bactérias até 24 h após o ferimento excisional permite a avaliação de infecções por feridas durante um prazo de 1 semana. Usando uma cepa luminescente de P. aeruginosa,é possível rastrear a progressão da infecção ao longo do curso de infecção. O curso mais longo de infecção em comparação com outros modelos de infecção por P. aeruginosa permitirá novas oportunidades .......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes para divulgar.
Agradecimentos
O vetor de construção luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 foi um presente gracioso de J. Hardy. Os esquemas foram criados com BioRender.com. Agradecemos ao laboratório de G. Gurtner por seus conselhos sobre o modelo de infecção por feridas. Também agradecemos a T. Doyle, do Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging, por sua experiência técnica. Este trabalho foi apoiado por subsídios R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, e subsídios da Stanford SPARK, do Falk Medical Research Trust e da Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para p.L.B. C.R.D foi apoiado pela T32AI007502. Uma Bolsa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Gabilan Stanford e uma Lubert St....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Injeção de cloreto de sódio a 0,9% | Hospira | 2484457 | |
| 18 G x 1 agulha estéril | BD | 305195 | |
| 25 G x 1 1/5 agulha estéril | BD | 305127 | |
| Cotonete com álcool | BD | 326895 | |
| Aura Imaging Software | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| Betadine | Purdue Frederick Company | 19-065534 | |
| Buprenorfina SR LAB | Zoopharm | n / a | |
| C57BL / 6J camundongos machos | O Laboratório Jackson | 000664 | |
| perfurador de biópsia descartável, tesoura | Integra | 33-36 | |
| - carboneto de tungstênio Ferramentas de | Ciência Fina | 14568-09 | |
| Esterilizador Seco de Esferas de Vidro | Aparelho de Harvard | 61-0183 | |
| Ágar granulado | Fisher BioReagents | BP9744 | |
| Almofada de aquecimento | Milliard | 804879481218 | |
| Seringa de insulina com agulha de 28 G | BD | 329461 | |
| Lago X Imaging System | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| LB caldo | Fisher BioReagents | BP1426 | |
| Seringa Leur-Lok de 1 mL | BD | 309628 | |
| Mini Arco Animal Trimmer | Wahl Professional | 919152 | |
| Nair Loção de Depilação com Óleo de Bebê | Church e Dwight | n/a | Disponível em qualquer farmácia |
| Octagon Fórceps | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Placa de Petri | Falcon | 351029 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Press and Seal Cling Wrap | Glad | n/a | |
| Seringa de insulina SafetyGlide com agulha de 30 G | BD | 305934 | |
| Seringa de insulina Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
| Scale | Ohaus Scout Pro | SP202 | |
| Suplemento Nutricional Suplementar | Henry Schein Saúde Animal | 29908 | |
| Tegaderm, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
Referências
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Serra, R., et al. Chronic....
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Reimpressões e permissões
