Summary
यहां प्रस्तुत डिसेक्शन और लिपिड बूंद के लिए विस्तृत तरीके हैं ड्रोसोफिला लार्वा में ओएनोसाइट्स के बोडिप्पी 493/503 का उपयोग करके, एक लिपिड ड्रॉपलेट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाया।
Abstract
लिपिड पशु विकास और शारीरिक होमोस्टोसिस के लिए आवश्यक हैं। लिपिड मेटाबोलिज्म के डिस्रेगुलेशन के परिणामस्वरूप मोटापा और फैटी लिवर जैसे विभिन्न विकासात्मक दोष और बीमारियां होती हैं। आमतौर पर लिपिड की बूंदों में संग्रहीत किया जाता है, जो कोशिकाओं में बहुआयामी लिपिड स्टोरेज ऑर्गेनेल्स होते हैं। लिपिड की बूंदें विभिन्न ऊतकों में और विभिन्न परिस्थितियों में आकार और संख्या में भिन्न होती हैं। यह बताया गया है कि लिपिड बूंदों को इसके बायोजेनेसिस और क्षरण के नियमन के माध्यम से कसकर नियंत्रित किया जाता है । ड्रोसोफिला मेलानोगास्टरमें, ओनोसाइट लिपिड मेटाबोलिज्म के लिए एक महत्वपूर्ण ऊतक है और हाल ही में तनाव के जवाब में लिपिड जुड़ाव के बारे में एक मानव यकृत एनालॉग के रूप में पहचाना गया है। हालांकि, ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट मेटाबोलिज्म के नियमन में अंतर्निहित तंत्र मायावी बने हुए हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, विकास के दौरान और तनावपूर्ण परिस्थितियों में ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट गतिशील परिवर्तनों की सीधी कल्पना करने के लिए एक विश्वसनीय और संवेदनशील विधि विकसित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। लिपोफिलिक बॉडीपी 493/503 का लाभ उठाते हुए, एक लिपिड बूंद-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंग, यहां वर्णित है, भुखमरी के जवाब में ड्रोसोफिला लार्वा के ओनोसाइट्स में विच्छेदन और बाद में लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विभिन्न परिस्थितियों में लिपिड ड्रॉपलेट गतिशीलता के गुणात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तेजी से और अत्यधिक प्रजनन विधि का उपयोग आनुवंशिक स्क्रीन में भी किया जा सकता है जिसमें ओनोसाइट्स और अन्य ऊतकों में लिपिड ड्रॉपलेट मेटाबोलिज्म शामिल है।
Introduction
लिपिड सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। सेलुलर झिल्ली प्रणालियों के अभिन्न घटकों के रूप में उनकी पारंपरिक भूमिका के अलावा, लिपिड भी ऊर्जा की आपूर्ति में महत्वपूर्ण कार्य खेलते हैं और व्यक्तिगत जानवरों के जीवन चक्र में ट्रांसड्यूक्शन का संकेत देते हैं1। इस प्रकार, लिपिड चयापचय कोशिकाओं में शारीरिक हेमोस्सिस बनाए रखने के लिए सख्त नियमों के अनुरूप होना चाहिए। ज्ञात हो कि लिपिड मेटाबोलिज्म के डिस्रेगुलेशन के परिणामस्वरूप मधुमेह और फैटी लिवर जैसी विभिन्न बीमारियां होती हैं। पशु स्वास्थ्य में लिपिड चयापचय के बहुत महत्व के बावजूद, लिपिड चयापचय विनियमन अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहते हैं ।
ड्रोसोफिला बड़े पैमाने पर वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है के बाद से प्रोफेसर थॉमस एच मॉर्गन उंहें आनुवंशिकी और अंय बुनियादी जैविकसवालों सेजुड़े अध्ययन में उपयोग शुरू कर दिया 2 । पिछले कुछ दशकों में, उभरते सबूतों से पता चला है कि ड्रोसोफिला मोटापा1,3जैसे कई लिपिड मेटाबोलिज्म से जुड़े रोगों के अध्ययन में एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है । विशेष रूप से, ड्रोसोफिला मनुष्यों के साथ अत्यधिक संरक्षित मेटाबोलिक जीन साझा करता है और लिपिड मेटाबोलिज्म के लिए समान प्रासंगिक ऊतकों/अंगों और कोशिका प्रकारों के अधिकारी हैं ।
उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिलाका वसा शरीर, जो ट्राइसिलग्लिसराइड स्टोरेज के लिए जिम्मेदार है, मानव एडीपोस ऊतक के अनुरूप कार्य करता है। हाल ही में, विशेष हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं (यानी, ओनोसाइट्स) का एक समूह, जिसे मानव यकृत के लिए एक कार्यात्मक एनालॉग बताया गया है, को फल मक्खियोंमेंफैटी एसिड और हाइड्रोकार्बन मेटाबोलिज्म में शामिल दिखाया गया है4,5। स्तनपायी यकृत में मामले के समान, ओनोसाइट्स लार्वा और वयस्क ड्रोसोफिलादोनों में लिपिड बूंद गठन को सक्रिय करके भुखमरी का जवाब देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप ओनोसाइट्स4,6,7,8में लिपिड बूंद संचय होता है। शारीरिक रूप से, ओनोसाइट्स को पेट के हेमिसेगमेंट प्रति लगभग छह कोशिकाओं के समूहों में पार्श्व एपिडर्मिस की बेसल आंतरिक सतह से कसकर जुड़ा हुआ है, जो एपिडरमिस से ओनोसाइट समूहों को अलग करना अव्यवहारिक बनाता है। इस प्रकार, ओनोसाइट्स को विच्छेदन और धुंधला के दौरान एपिडर्मिस से जोड़ा जाना चाहिए।
लिपिड लिपिड बूंदों के रूप में संग्रहीत होते हैं, जो कोशिकाओं9में एकल परत झिल्ली के साथ ऑर्गेनेल्स होते हैं। लिपिड की बूंदें विभिन्न प्रजातियों में लगभग सभी कोशिका प्रकारों में मौजूद हैं10। लिपिड ड्रॉपलेट गतिशीलता, इसके आकार और संख्या सहित, पर्यावरण ीय तनाव के जवाब में बदल जाते हैं। इसे तनाव के जवाब में मेटाबोलिक स्थिति का प्रतिबिंब माना जाता है, जैसे कि उम्र बढ़ने और भुखमरी7,8। इसलिए, विकास के दौरान और तनावपूर्ण परिस्थितियों में ओएनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट गतिशीलता को गुणात्मक रूप से निर्धारित करने के लिए एक व्यवहार्य और विश्वसनीय विधि विकसित करना बहुत महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, तीसरे इंस्टार लार्वा में, ओनोसाइट्स में खिलाया स्थितियों के तहत कुछ या कोई पता लगाने योग्य लिपिड बूंदें होती हैं, लेकिन उनमें पोषण अभाव4के बाद कई बड़ी लिपिड बूंदें होती हैं। इस विधि की प्रभावशीलता को सत्यापित करने के लिए, भूखे परिस्थितियों में ओनोसाइट्स में लिपिड बूंद धुंधला करने का सुझाव दिया जाता है।
वर्तमान में, कई लिपोफिलिक रंग लिपिड बूंदों के लिए उपलब्ध हैं, जैसे नॉनफ्लोरोसेंट रंग सूडान ब्लैक एंड ऑयल रेड ओ और फ्लोरोसेंट रंग नील लाल और बॉडीपी 493/50311। सूडान ब्लैक और ऑयल रेड ओ आमतौर पर ऊतक कोलेस्टेरिल एस्टर और ट्राइसिलग्लिसरोल के लिए उपयोग किए जाते हैं और हल्के माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से पता लगाया जा सकता है। हालांकि, अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि धुंधला और अपेक्षाकृत कम संकल्प लिपिड बूंद गतिशीलता के गुणात्मक विश्लेषण में अपने अनुप्रयोगों के लिए दो सीमित कारक हैं । नॉनफ्लोरोसेंट रंगों की सीमाओं को दूर करने के लिए, नील लाल और बॉडीपी 493/503 लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला के लिए आदर्श विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है । यह बताया गया है कि नील लाल कुछ अप्रतिम कोलेस्ट्रॉल का भी पता लगा सकता है, जो बोप्पी 493/503 को सेलुलर लिपिड बूंदों के लिए अधिक विशिष्ट रंग बनाता है, कुछ हद तक12,13,14।
सबसे बड़ी बात यह है कि ओनोसाइट्स में लिपिड बूंदों के तेजी से और संवेदनशील विश्लेषण की आवश्यकता को पूरा करने के लिए, यह प्रोटोकॉल दाग रंगे के रूप में बॉडीपी 493/503 का उपयोग करके स्थिर-आधारित लिपिड बूंद-विशिष्ट धुंधला की एक व्यवहार्य और अत्यधिक प्रजनन विधि प्रस्तुत करता है। इस रिपोर्ट में, ओनोसाइट्स विच्छेदित होते हैं, और बॉडीपी 493/503 का उपयोग ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला करने के लिए किया जाता है, जिसमें लिपिड बूंदों का पता कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लगाया जाता है । इस प्रक्रिया की आसानी और सामर्थ्य इसे प्रवाह साइटोमेट्री जैसे अन्य अनुप्रयोगों में संशोधन और आगे के उपयोग के लिए आदर्श बनाती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. अंडा बिछाने
- अंडा बिछाने के लिए मानक कॉर्नमील भोजन तैयार करें।
नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले मानक कॉर्नमील भोजन के लिए नुस्खा और खाना पकाने की प्रक्रिया के लिए, पहले प्रकाशित विवरण15देखें। - 50 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 ग्राम सक्रिय सूखे खमीर में 6 मिलीग्राम आसुत पानी डालकर ताजा खमीर पेस्ट तैयार करें। पेस्ट मिलाने और बनाने के लिए स्पैटुला का इस्तेमाल करें।
- बोतलों में कॉर्नमील भोजन भरकर अंडे बिछाने वाली बोतलें बनाएं और एक स्पैटुला के साथ कॉर्नमील भोजन की सतह पर लगभग 1 ग्राम खमीर पेस्ट फैलाएं।
- वांछित जीनोटाइप की मक्खियों को अंडे बिछाने वाली बोतल में रखें और इसे लगातार तापमान 25 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता 60% के साथ इनक्यूबेटर में रखें।
नोट: आदर्श पार आमतौर पर 150 कुंवारी मक्खियों और कम से कम 75 पुरुषों से मिलकर बनता है। अंडे बिछाने वाली बोतलों के ऊपर लाइटप्रूफ बॉक्स रखकर मक्खियों को अंधेरे में रखने से प्रजनन दर में वृद्धि होगी। - अंडा संग्रह से पहले, मक्खियों को मादा अंडाशय में संग्रहीत रहने वाले सभी पुराने अंडों को हटाने की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए अंडे डालने दें।
- मक्खियों को 1 घंटे के लिए एक नए अंडे बिछाने वाली बोतल में अंडे डालने दें और वयस्कों को बोतल से हटा दें।
नोट: एक सटीक नियंत्रित विकास के चरण के भीतर लार्वा प्राप्त करने के लिए विकासात्मक सीमा को कम करने के लिए अंडा बिछाने के समय को नियंत्रित करें। - अंडे को 12 एच/12 एच लाइट/डार्क साइकिल के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में तीसरे इंस्टार लार्वा में 84 एच के लिए विकसित करने की अनुमति दें।
2. लार्वा के लिए भुखमरी उपचार
नोट: जैसा कि ऊपर बताया गया है, तीसरे इंस्टार लार्वा में, सामान्य भोजन की स्थिति में ओनोसाइट्स में कुछ या कोई पता लगाने योग्य लिपिड बूंदें नहीं हैं, लेकिन कई बड़ी लिपिड बूंदों को भुखमरी जैसी तनाव की स्थिति में ओनोसाइट्स में प्रेरित किया जा सकता है। इस विधि को और सत्यापित करने के लिए, ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट बायोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए इन लार्वा का पूर्वइलाज करना आवश्यक है। यहां, 12 घंटे, 24 एच, और ३६ एच के एक भुखमरी समय पाठ्यक्रम प्रतिमान के रूप में चुना गया था । विशेष रूप से, भुखमरी की एक छोटी अवधि (उदाहरण के लिए, 3 घंटे) ओनोसाइट्स में पता लगाने योग्य लिपिड बूंदों को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। भुखमरी की अवधि विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों और सेटिंग्स के अनुसार भिन्न हो सकती है।
- भुखमरी और नियंत्रण उपचार के लिए कक्ष बनाओ।
- भुखमरी उपचार कक्षों के लिए: फिल्टर पेपर पर 6 सेमी पेट्री डिश और पीबीएस के पिपेट 1 मिलील में उचित आकार का फिल्टर पेपर रखें।
- नियंत्रण उपचार कक्षों के लिए: पेट्री डिश में ब्लूमिंगटन मानक कॉर्नमील भोजन के 5 मिलील रखें।
- लार्वा युक्त भोजन की शीर्ष परत को धीरे से खोदने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें जो अभी भी भोजन में बिलिंग कर रहे हैं और उन्हें पीबीएस के 5 mL से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित कर ते हैं। लार्वा से किसी भी खाद्य संदूषण को हटाने और इसे यथासंभव साफ करने के लिए पीबीएस में लार्वा को धीरे से हिलाएं।
- एक ही अनुमानित आकार के 40 तीसरे इंस्टार लार्वा इकट्ठा करने के लिए एक छोटे से तूलिका का उपयोग करें। उन्हें बेतरतीब ढंग से भुखमरी या नियंत्रण कक्ष में सॉर्ट करें, जिसमें प्रत्येक में 20 लार्वा हैं।
- इनक्यूबेटर में कक्षों को 60% आर्द्रता के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें और 12 घंटे, 24 एच और 36 एच उपचार के लिए विकास की अनुमति दें।
नोट: भुखमरी कक्ष में लार्वा के लिए, लार्वा निर्जलीकरण से बचने के लिए हर 12 घंटे में पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें।
3. ओनोसाइट्स का विच्छेदन
- उचित उम्र (12 एच, 24 एच, या उपचार के बाद 36 घंटे) के लार्वा लेने के लिए एक छोटे से तूलिका का उपयोग करें, फिर उन्हें धोने के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस के 5 मिलील से भरे एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
नोट: किसी भी खाद्य संदूषण को दूर करने के लिए नियंत्रण कक्ष में लार्वा से निपटते समय चरण 2.2 दोहराएं। - बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ एक विच्छेदन प्लेट भरें और लार्वा को धीरे-धीरे विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। निम्नलिखित विच्छेदन चरण के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे विच्छेदन प्लेट रखो।
नोट: बर्फ-ठंड े तापमान से लार्वा की धीमी गति से आंदोलनों में मदद मिलेगी और विच्छेदन की सुविधा मिलेगी। - लार्वा वेंट्रल साइड को ऊपर और पृष्ठीय पक्ष को नीचे घुमाएं और धीरे-धीरे संदंश का उपयोग करके जगह में पकड़ें। लार्वा को विच्छेदन पिन रखकर विच्छेदन प्लेट में सुरक्षित करें, हालांकि पूर्वकाल के अंत में फेरिन्स और पीछे के छोर पर सर्पिल के माध्यम से एक और पिन।
नोट: पृष्ठीय पक्ष को श्वासनली के पृष्ठीय चड्डी की उपस्थिति से सबसे आसानी से पहचाना जाता है। - पूर्वकाल से पीछे के अंत तक एपिडर्मिस के माध्यम से (देशाधिक) छेदने के लिए वैननास स्प्रिंग कैंची का उपयोग करें।
- संदंश का उपयोग करके एपिडर्मिस के आंतरिक ऊतक को हटा दें।
नोट: ओनोसाइट्स को नुकसान से बचने के लिए श्वास शाखाओं को हटाते समय सावधानी बरती जानी चाहिए, जो एपिडर्मिस की आंतरिक सतह में स्थानीयकृत हैं। - संदंश के साथ, विच्छेदन पिन को पुनः प्राप्त करें और बर्फ पर पीबीएस से भरी 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में एपिडर्मिस स्थानांतरित करें।
- ऊपर वर्णित प्रक्रिया का पालन करते हुए अन्य लार्वा को विच्छेदन जारी रखें।
4. लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला
- एक रोटेटर पर कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मेंस के लिए फिक्सेशन बफर में विच्छेदित एपिडर्मिस को इनक्यूबेट करें।
नोट: फिक्सेशन बफर में पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) शामिल हैं। - फिक्सेशन बफर निकालें, एक त्वरित धोने के बाद। एक त्वरित धोने के लिए, पीएफए को हटाने के बाद ट्यूब में आरटी पर पीबीएस के 1 mL जोड़ें, धीरे ऊतकों को फिर से निलंबित करें, और पीबीएस को त्यागदें।
सावधानी: फिक्सेशन बफर में पीएफए होता है, जो मानव स्वास्थ्य के लिए हानिकारक है। फिक्सेशन बफर को खतरनाक कचरे के रूप में ठीक से निपटाना महत्वपूर्ण है। - सभी संभव पीएफए अवशेषों को धोने के लिए पीबीएस के साथ प्रत्येक 5 मिन के लिए नमूनों 3x धोएं।
- एक रोटेटर पर आरटी में 30 मिन के लिए BODIPY 493/503 (1 μg/mL; सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एपिडर्मिस इनक्यूबेट ।
नोट: इस कदम के बाद से, प्रकाश से नमूनों की रक्षा और संभावित फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के साथ माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब लपेटें। - BODIPY 493/503 धुंधला समाधान निकालें और पूरी तरह से अवशिष्ट रंगों को दूर करने के लिए PBS के साथ 10 min के लिए नमूनों 3x धोने ।
5. बढ़ते और इमेजिंग
- एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के 6 μL रखें।
नोट: बढ़ते माध्यम का उपयोग इसके एंटीफीका गुणों के आधार पर लंबे समय तक पता लगाने के समय के लिए किया जाता है। - एक एपिडर्मिस लेने के लिए संदंश का उपयोग करें और धीरे-धीरे अवशिष्ट पीबीएस को पोंछने के साथ हटा दें।
- एपिडर्मिस को बढ़ते माध्यम में रखें और इसके अभिविन्यास को समायोजित करें ताकि इसकी आंतरिक सतह जिसमें ओनोसाइट्स युक्त है और इसकी बाहरी सतह शीर्ष पर है।
- धीरे-धीरे एपिडर्मिस पर एक कवरस्लिप रखें।
नोट: यदि आवश्यक हो तो एक पोंछ के साथ कवरस्लिप के नीचे से लीक होने वाले किसी भी अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को हटा दें। इमेजिंग की सुविधा के लिए, धीरे-धीरे संदंश के साथ कवरस्लिप पर नीचे धकेलें ताकि माइक्रोस्कोप के माध्यम से स्लाइड को देखते समय, ओनोसाइट क्लस्टर को आसानी से एक ही विमान में चित्रित किया जा सके। वैकल्पिक रूप से, ऊतकों को बढ़ते समय पूरे एपिडर्मिस के रोलिंग-अप से बचने के लिए मध्य रेखा के माध्यम से दो अर्ध-एपिडर्मिस में एपिडर्मिस में कटौती करना व्यवहार्य है। - सील करने के लिए कवरस्लिप के किनारों के चारों ओर स्पष्ट नेल पॉलिश लगाएं।
- स्लाइड्स में एक लाइटप्रूफ सैंपल बॉक्स में रखें और नेल पॉलिश को आरटी पर ड्राई करने की इजाजत दें, जिसमें 5-10 मिन लग सकते हैं।
- सूक्ष्म विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें। कम से कम पृष्ठभूमि के साथ स्वच्छ और संवेदनशील संकेतप्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (अनुकूलित जीएफपी या फिटसी फ़िल्टर सेटिंग्स के साथ 63x का आवर्धन, उत्तेजना = 488 एनएम, उत्सर्जन = 503 एनएम) का उपयोग करके छवियां लें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस प्रक्रिया के सफल निष्पादन के परिणामस्वरूप स्पष्ट लिपिड बूंदों का धुंधला होना चाहिए जो ओनोसाइट्स में लिपिड बूंदों की संख्या और आकार का पता चलता है। चित्र ा 1ए, ए ', ए'' से पता चलता है कि विभिन्न विकासचरणों के दौरान सामान्य भोजन लार्वा के ओनोसाइट्स में कुछ पता लगाने योग्य लिपिड बूंदें (हरी डॉट्स) हैं। चित्रा 1बी, बी ', '' से पता चलता है कि भुखमरी की अवधि के 12 घंटे (बी), 24 घंटे (बी'), और 36 एच (बी') अवधि के जवाब में ओनोसाइट्स में लिपिड की बूंदों (हरी डॉट्स) राशि में वृद्धि हुई है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 96 एच के बाद, खिलाया लार्वा (ए) को ओनोसाइट्स में कुछ लिपिड बूंद संचय दिखाई देने लगा, जो उनकी तेज वृद्धि दर के कारण हो सकता है। शोधकर्ताओं को इस चरण के दौरान लार्वा से निपटने के दौरान अधिक ध्यान देना चाहिए।
चित्र 1: लिपिड बूंद धुंधला की प्रतिनिधि छवियां । छवियों को कैडिपी 493/503 का उपयोग करके ड्रोसोफिला लार्वा के ओनोसाइट्स में विकास और भुखमरी के समय में दिखाया गया है। (ए,ए', ए') फेड लार्वा में ओएनोसाइट्स क्लस्टर के प्रतिनिधि छवियों की लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला (हरी डॉट्स)। (बी,बी', बी') 12 घंटे (बी), 24 एच (बी'), और भुखमरी की 36 एच (बी') अवधि के बाद ओनोसाइट्स समूहों के प्रतिनिधि चित्रों में लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला (हरे बिंदु) 84 घंटे की उम्र के साथ लार्वा से शुरू होते हैं। सभी छवियों को एक ही आवर्धन में लिया गया था । स्केल बार = 20 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऊपर उल्लिखित लोगों में से, इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, अंडा बिछाने की समय अवधि इनमें से एक होने के साथ । लिपिड जुटाने वाले ऊतक के रूप में, ओनोसाइट पोषण स्थिति6,8के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। लंबे समय तक अंडे बिछाने की समय अवधि के परिणामस्वरूप कौवे लार्वा और खाद्य प्रतिस्पर्धा में वृद्धि हो सकती है, जिससे गलत परिणाम हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली 1 घंटे अंडा-बिछाने की समय अवधि लार्वा को पोषण प्रतियोगिता के बिना विकसित करने की अनुमति देती है। लार्वा की एक बहुत बड़ी संख्या जो लंबे समय तक अंडे बिछाने की समय अवधि से उत्पन्न हो सकती है, ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट मात्रा और पैटर्न (जैसे, आकार, संख्या और आकृति विज्ञान) को भी प्रभावित कर सकती है।
इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक अंडा देने की समय अवधि के परिणामस्वरूप विकास के चरणों में व्यापक भिन्नता के साथ लार्वा आबादी भी होती है। इस संदर्भ में, शोधकर्ताओं को भ्रूणीय या लार्वा विकास को प्रभावित करने वाले म्यूटेंट का उपयोग करते समय सावधान रहना चाहिए, क्योंकि लिपिड ड्रॉपलेट पैटर्न पर उनका प्रभाव विकासात्मक दोषों के माध्यमिक प्रभावों से प्रभावित हो सकता है। समय पाठ्यक्रम प्रक्रिया से पता चलता है कि लिपिड बूंदों को जल्दी तीसरे इंस्टार लार्वा (84 एच) से देर से तीसरे इंस्टार लार्वा (120 एच) तक विकास के दौरान खिलाया स्थिति oenocytes में शायद ही कभी पता लगाने योग्य हैं। इसके अलावा, वयस्कों में ओनोसाइट्स के एम्बर पिगमेंटेशन के विपरीत, लार्वा ओनोसाइट्स बेरंग5हैं। इस प्रकार, ओनोसाइट विच्छेदन के दौरान वृद्धि ध्यान दिया जाना चाहिए ताकि ओनोसाइट्स को संभावित क्षति से बचाजा जा सके, खासकर आसपास के ऊतकों (यानी, श्वासनली शाखाओं) को हटाते समय। इसके अलावा, लिपिड की बूंदें एकल परत झिल्ली ऑर्गेनेल्स हैं, जो ट्राइटन एक्स-1009जैसे डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील हैं। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स में डिटर्जेंट नहीं होते हैं।
जैसा कि ऊपर बताया गया है, ड्रोसोफिला और अन्य प्रजातियों में लिपिड ड्रॉपलेट राशि और पैटर्न परिवर्तन निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कई रंग हैं। इनमें से, बॉडीपी 493/503 अन्य फ्लोरोसेंट (जैसे, नील लाल) या नॉनफ्लोरोसेंट रंगों (जैसे, तेल लाल ओ) की तुलना में लिपिड बूंद-विशिष्ट धुंधला के लिए सबसे उपयुक्त हो सकता है; हालांकि, अधिक उपन्यास और उन्नत रंग विकसित किए जा रहे हैं। उदाहरण के लिए, लिपिडस्पॉट 488 और इसके व्युत्पन्न सेलुलर झिल्ली और अन्य ऑर्गेनेल्स की न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ नए विकसित फ्लोरोसेंट रंगों की एक श्रृंखला है। वे जीवित और निश्चित कोशिकाओं दोनों में लिपिड की बूंदों को तेजी से धुंधला करने की अनुमति देते हैं, जिसमें16,17की आवश्यकता नहीं होती है। इस लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह कोशिकाओं में मात्रात्मक रूप से वसा भंडार को मापने के लिए इष्टतम नहीं है, भले ही यह लिपिड ड्रॉपलेट आकार, संख्या और आकृति विज्ञान के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से काम करता है।
ओएनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला होने के अलावा, इस विधि को ऊतक विच्छेदन और सेक्शनिंग7के दौरान मामूली संशोधनों के साथ लार्वा (यानी मांसपेशियों, वसा शरीर और आंत के ऊतक) में अन्य ऊतकों पर भी लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यह विधि वयस्क ऊतकों7के लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला के लिए भी अच्छी तरह से काम करती है। इस विधि का एक संशोधित संस्करण एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला के साथ संयोजन में व्यापक अनुप्रयोगों के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस मामले में, निर्धारित ऊतकों को एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटिंग से पहले पारंपरिक डिटर्जेंट के बजाय सैपोनिन (आरटी में 30 टिन के लिए 0.1%) के साथ रिस दिया जाना चाहिए, जो प्लाज्मा झिल्ली में एंटीबॉडी को पार करने और लिपिड ड्रॉपलेट झिल्ली अखंडता8के रखरखाव की सुविधा प्रदान करता है।
संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए एक व्यवहार्य तरीका प्रदान करता है कि क्या कुछ आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोड़तोड़ लिपिड बूंद मात्रा और पैटर्न (यानी, आकार, संख्या और आकृति विज्ञान) में गुणात्मक परिवर्तन का कारण बनता है) की आवश्यकता के बिना कठिन संचालन और महंगे उपकरण और सामग्री।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671422, 31529004, और 31601112), 111 परियोजना (D18010), गुआंगडोंग पर्ल नदी प्रतिभा कार्यक्रम (2017BT01S155) की स्थानीय अभिनव और अनुसंधान टीमों परियोजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और चाइना पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (2018M640767) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell? Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
