ショウジョウバエ幼虫における大鼻細胞の解剖と脂質液滴染色
Summary
ここで提示する、脂質液滴特異的蛍光色素であるBODIPY 493/503を用いたショウジョウバエ幼虫における卵細胞の解剖および脂質液滴染色に関する詳細な方法である。
Abstract
脂質は、動物の発達と生理学的恒常性に不可欠です。脂質代謝の調節不全は、肥満や脂肪肝などの様々な発達上の欠陥や疾患をもたらす。通常、脂質は細胞内の多機能脂質貯蔵オルガネラである脂質液滴に貯蔵される。脂質液滴は、異なる組織および異なる条件下でサイズと数が異なります。脂質液滴は、その生体発生および分解の調節を通じて厳密に制御することが報告されています。.ショウジョウバエメラノガスターでは、卵子細胞は脂質代謝の重要な組織であり、ストレスに応じて脂質動員に関するヒト肝臓類似体として最近同定されている。しかし、オエノサイトにおける脂質液滴代謝の調節の基礎となるメカニズムは、依然として不可解である。この問題を解決するためには、開発中およびストレスの多い条件下で、大脳細胞の脂質液滴動的変化を直接可視化する信頼性の高い、敏感な方法を開発することが最も重要です。親油性BODIPY493/503を利用して、脂質液滴特異的蛍光色素を、ここで説明する、飢餓に応答してショウジョウバエ幼虫の好色細胞における解剖およびその後の脂質液滴染色のための詳細なプロトコルである。これにより、共焦点顕微鏡による様々な条件下での脂質液滴ダイナミクスの定性的分析が可能となる。さらに、この迅速かつ高度に再現性の高い方法は、食素細胞および他の組織における脂質滴代謝を含む新しい遺伝的要因を同定するための遺伝的スクリーンでも使用することができる。
Introduction
脂質は細胞の生存に不可欠です。細胞膜系の不可欠な構成要素としての従来の役割に加えて、脂質はまた、個々の動物のライフサイクルを通じてエネルギー供給およびシグナル伝達において重要な機能を果たす1.したがって、脂質代謝は、細胞内の生理学的止血を維持するために厳格な規制に準拠する必要があります。脂質代謝の調節不全は、糖尿病や脂肪肝などの様々な疾患を引き起こすことが知られています。動物の健康における脂質代謝の重要性は非常に高いにもかかわらず、脂質代謝調節の根底にあるメカニズムはほとんど未知のままである。
ショウジョウバエは、トーマス・H・モーガン教授が遺伝学やその他の基本的な生物学的質問を含む研究でそれらを使用し始めて以来、長年にわたって広く使用されてきました2.過去数十年の間に、ショウジョウバエは肥満1、3のような多くの脂質代謝関連疾患の研究において優れたモデル生物であることを示している。特にショウジョウバヤは、高度に保存された代謝遺伝子をヒトと共有し、脂質代謝に関連する組織/器官および細胞型を有する。
例えば、トリアシルグリセリド貯蔵を担うショウジョウバアラの脂肪体は、ヒト脂肪組織に類似した機能を有する。近年、ヒト肝臓に対する機能的類似であることが報告されている特殊な肝細胞様細胞(すなわち、食素細胞)の群れが、果実ハエ4、5における脂肪酸および炭化水素代謝に関与していることが示されている。哺乳類の肝臓の場合と同様に、卵形細胞は、幼虫および成体ショウジョウバエの両方で脂質液滴形成を活性化することによって飢餓に反応し、その結果、オエノサイト4、6、7、8に脂質液滴蓄積をもたらす。解剖学的に、大外細胞は腹部半分当たり約6個の細胞のクラスターで横表皮の基底内部表面にしっかりと付着しており、表皮から大外細胞クラスターを分離することは不可能である。したがって、卵外細胞は、解剖および染色中に表皮に付着しなければならない。
脂質は、細胞9に単層膜を有するオルガネラである脂質液滴の形態で貯蔵される。脂質液滴は、異なる種10間でほぼすべての細胞型に存在する。脂質液滴ダイナミクスは、その大きさと数を含め、環境ストレッサーに応答して変化する。これは、加齢や飢餓7、8などのストレスに対する代謝状態の反映とみなされます。したがって、開発中およびストレスの多い条件下で、大エノサイトの脂質液滴ダイナミクスを定性的に決定する実現可能で信頼性の高い方法を開発することが非常に重要です。特に、第3のインスター幼虫において、食血球は、与えられた条件下で検出可能な脂質小滴をほとんどまたは全く含まないが、それらは栄養欠乏後に多数の大きな脂質液滴を含んでいる4である。この方法の有効性を検証するために、飢餓条件下で食細胞における脂質液滴染色を行うことが示唆される。
現在、非蛍光色素スーダンブラックおよびオイルレッドOおよび蛍光色素ナイルレッドおよびBODIPY 493/50311などの脂質液滴染色にはいくつかの親油性染料が利用可能である。スーダンブラックとオイルレッドOは、一般的に組織コレステリルエステルとトリアシルグリセロールのために使用され、光顕微鏡で簡単に検出することができます。しかしながら、比較的高い背景染色と比較的低い分解能は、脂質液滴ダイナミクスの定性的分析におけるその用途のための2つの制限因子である。非蛍光色素の限界を克服するために、ナイルレッドおよびBODIPY 493/503は脂質液滴染色の理想的な代替として利用される。ナイルレッドはまた、BODIPY 493/503を細胞脂質液滴のより特異的な色素にするいくつかの未エステルコレステロールを検出できることが報告されています, ある程度12,13,14.
とりわけ、食素細胞における脂質液滴の迅速かつ敏感な分析の必要性を満たすために、このプロトコルは、染色染料としてBODIPY 493/503を用いた固定性基脂質液滴特異的染色の実現可能かつ再現性の高い方法を提示する。本報告では、オエノサイトを解剖し、BODIPY 493/503をオエノサイトの脂質液滴染色に用い、共焦点顕微鏡で脂質液滴を検出する。このプロシージャの容易さおよび手頃な価格は変更および流れのサイトメトリーのような他の適用の更に使用にとって理想的である。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記で概説したものの中で、このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあり、卵の産卵期間はこれらの1つです。脂質動員組織として、大エノサイトは栄養状態6、8に対して高感度である。長期間の産卵期間は、群れた幼虫と食物競争の増加をもたらし、不正確な結果をもたらす可能性があります。このプロトコルで使用される1時間の産卵期?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、中国国立自然科学財団(31671422、31529004、31601112)、111プロジェクト(D18010)、広東ペルリバータレントプログラム(2017BT01S155)の地域革新的研究チームプロジェクト、および31601112からの助成金によって支えられました。中国博士科学財団 (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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