Summary
Presenteras här är detaljerade metoder för dissektion och lipid dropp färgning av oenocyter i Drosophila larver med hjälp av bodipy 493/503, en lipid dropp-specifika fluorescerande färgämne.
Abstract
Lipider är avgörande för djurens utveckling och fysiologiska homeostas. Dysreglering av lipidmetabolismen resulterar i olika utvecklingsdefekter och sjukdomar, såsom fetma och fettlever. Vanligtvis, lipider lagras i lipid droppar, som är den multifunktionella lipid lagring organeller i celler. Lipiddroppar varierar i storlek och antal i olika vävnader och under olika förhållanden. Det har rapporterats att lipiddroppar är tätt kontrollerade genom reglering av dess biogenes och nedbrytning. I Drosophila melanogasterär oenocyten en viktig vävnad för lipidmetabolismen och har nyligen identifierats som en human lever analog om lipid mobilisering som svar på stress. Mekanismerna bakom regleringen av lipiddroppmetabolismen i oenocyter är dock fortfarande svårfångade. För att lösa detta problem är det av yttersta vikt att utveckla en tillförlitlig och känslig metod för att direkt visualisera lipiddroppar dynamiska förändringar i oenocyter under utveckling och under stressiga förhållanden. Att dra nytta av lipofila bodipy 493/503, en lipid dropp-specifika fluorescerande färgämne, beskrivs här är ett detaljerat protokoll för dissektion och efterföljande lipid dropp färgning i oenocyter av Drosophila larver som svar på svält. Detta möjliggör kvalitativ analys av lipiddroplet dynamik under olika förhållanden genom konfokal mikroskopi. Dessutom kan denna snabba och mycket reproducerbara metod också användas i genetiska skärmar för att identifiera nya genetiska faktorer som involverar lipid-dropp-metabolism i oenocyter och andra vävnader.
Introduction
Lipider är avgörande för cellöverlevnad. Förutom sin traditionella roll som integrerade komponenter i cellulära membransystem, lipider också spela avgörande funktioner i energiförsörjning och signalering transduktion under hela livscykeln för enskilda djur1. Sålunda, lipid metabolism måste överensstämma med strikta regler för att upprätthålla fysiologiska hemostas i celler. Det är känt att dysreglering av lipidmetabolismen resulterar i olika sjukdomar, såsom diabetes och fettlever. Trots den stora betydelsen av lipidmetabolismen i djurhälsa, mekanismerna bakom lipidmetabolismen förordningen är fortfarande i stort sett okända.
Drosophila har använts flitigt i åratal sedan professor Thomas H. Morgan började använda dem i studier som omfattade genetik och andra grundläggande biologiska frågor2. Under de senaste decennierna har nya belägg visat att Drosophila är en utmärkt modellorganism i studiet av många lipidmetabolism-relaterade sjukdomar, såsom fetma1,3. I synnerhet, Drosophila aktier starkt bevarade metaboliska gener med människor och besitter liknande relevanta vävnader/organ och celltyper för lipid metabolism.
Till exempel, fett kroppen av Drosophila, som ansvarar för Triacylglyceride lagring, fungerar analogt med mänsklig fettvävnad. Nyligen, ett kluster av specialiserade hepatocyte-liknande celler (dvs., oenocyter), som har rapporterats vara en funktionell analog till den mänskliga levern, har visat sig vara inblandade i fettsyror och kolvätemetabolism i bananflugor4,5. Liknar fallet i däggdjurs lever, oenocyter reagera på svält genom att aktivera lipid droppbildning i både larv och vuxen Drosophila, vilket resulterar i lipid dropp ansamling i oenocyter4,6,7,8. Anatomiskt, oenocyter är tätt knutna till basal inre ytan av den laterala epidermis i kluster av cirka sex celler per buken hemisegment, vilket gör det opraktiskt att isolera oenocyte kluster från epidermis. Sålunda, oenocyter måste fästas på epidermis under dissektion och färgning.
Lipider lagras i form av lipiddroppar, som är organeller med enstaka skikt membran i celler9. Lipiddroppar finns i nästan alla celltyper över olika arter10. Lipid dropp dynamik, inklusive dess storlek och antal, förändring som svar på miljömässiga stressfaktorer. Detta betraktas som en återspegling av metabolisk status som svar på stress, såsom åldrande och svält7,8. Därför är det av stor betydelse att utveckla en genomförbar och tillförlitlig metod för att kvalitativt bestämma lipid dropp dynamik i oenocyter under utveckling och under stressiga förhållanden. I synnerhet i de tredje INSTAR larverna innehåller oenocyter få eller inga detekterbara lipiddroppar under utfodrade förhållanden, men de innehåller många stora lipiddroppar efter näringsbrist4. För att kontrollera effektiviteten av denna metod, det föreslås att utföra lipid dropp färgning i oenocyter under svalt tillstånd.
För närvarande, flera lipofila färgämnen är tillgängliga för lipid droppar färgning, såsom icke-fluorescerande färgämnen Sudan svart och olja röd O och fluorescerande färgämnen Nile röd och BODIPY 493/50311. Sudan svart och olja röd O används ofta för vävnad kolesterylestrar estrar och triacylglycerols och kan lätt upptäckas av ljus mikroskopi. Emellertid, relativt hög bakgrunds färgning och relativt låg upplösning är två begränsande faktorer för dess tillämpningar i kvalitativ analys av lipid dropp dynamik. För att övervinna begränsningarna av icke-fluorescerande färgämnen, Nile Red och BODIPY 493/503 utnyttjas som idealiska substitut för lipid dropp färgning. Det har rapporterats att Nile Red kan också upptäcka några oförestrade kolesterol, vilket gör bodipy 493/503 en mer specifik färg för cellulära lipiddroppar, till viss del12,13,14.
Framför allt, för att uppfylla ett behov av snabb och känslig analys av lipiddroppar i oenocyter, detta protokoll presenterar en genomförbar och mycket reproducerbar metod för fixativ-baserade lipid dropp-specifik färgning med BODIPY 493/503 som fläcken färgämne. I denna rapport är oenocyter dissekeras, och BODIPY 493/503 används för lipid dropp färgning i oenocyterna, där lipiddroppar upptäcks av konfokalmikroskopi. Enkelheten och överkomligheten i detta förfarande gör den idealisk för modifiering och vidare användning i andra applikationer, såsom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. äggläggning
- Förbered standard majsmjöl mat för äggläggning.
Anmärkning: För receptet och tillagnings proceduren för standard majsmjöl mat som används här, se tidigare publicerade detaljer15. - Förbered färsk jästpasta genom att tillsätta 6 mL destillerat vatten till 4 g aktiv torkad jäst i en 50 mL centrifugalslang. Använd en spatel för att blanda och göra en pasta.
- Gör ägg läggnings flaskor genom att fylla majsmjöl maten i flaskorna och sprida cirka 1 g jästpasta på ytan av majsmjöl mat med en spatel.
- Placera flugorna av önskade genotyper i en ägg läggnings flaska och placera den i en inkubator med en konstant temperatur på 25 ° c och luftfuktighet på 60%.
Anmärkning: Ideal korsningar består vanligtvis av 150 jungfru flugor och minst 75 hanar. Att hålla flugor i mörker genom att placera en ljustäta låda över ägg läggnings flaskor kommer att öka reproduktions takten. - Innan ägg insamling, låt flugor lägga ägg för 1 h att tillåta avlägsnande av alla gamla ägg som återstår lagras i den kvinnliga ovikanalerna.
- Låt flugor lägga ägg i en ny ägg läggnings flaska för 1 h och ta bort de vuxna från flaskan.
Anmärkning: Kontrollera äggläggningstiden för att minimera utvecklings intervallet för att få larver inom ett exakt kontrollerat utvecklingsstadium. - Låt äggen att utvecklas för 84 h i den tredje INSTAR larverna i inkubatorn vid 25 ° c med en 12 h/12 h ljus/mörker cykel.
2. svält behandling för larverna
Anmärkning: Som nämnts ovan, i tredje INSTAR larver, det finns få eller inga detekterbara lipiddroppar i oenocyter under normala utfodringsförhållanden, men många stora lipid droppar kan induceras i oenocyter under stress, såsom svält. För att ytterligare kontrollera denna metod, är det nödvändigt att förbehandla dessa larver att inducera lipid dropp biogenes i oenocyter. Här, en svält tid kurs av 12 h, 24 h, och 36 h valdes som paradigm. I synnerhet är en kort period av svält (t. ex. 3 h) tillräcklig för att inducera detekterbara lipiddroppar i oenocyter. Svält varaktighet kan variera beroende på specifika experimentella mål och inställningar.
- Gör kammare för svält och kontroll behandlingar.
- För svält behandling kammare: placera ett filterpapper av lämplig storlek i en 6 cm petriskål och Pipettera 1 mL PBS på filtrerpapper.
- För kontroll behandling kammare: Placera 5 mL av Bloomington standard majsmjöl mat i petriskål.
- Använd en spatel för att försiktigt gräva upp det översta lagret av mat som innehåller larver som fortfarande är grävande i maten och överföra dem till en petriskål fylld med 5 mL PBS. Rör försiktigt larverna i PBS för att avlägsna eventuell livsmedelskontaminering från larverna och göra den så ren som möjligt.
- Använd en liten pensel för att samla 40 tredje INSTAR larver av samma ungefärliga storlek. Sortera dem slumpmässigt i en svält eller kontroll kammare, med 20 larver vardera.
- Placera kamrarna i inkubatorn vid 25 ° c med 60% luftfuktighet och Tillåt utveckling för 12 h, 24 h och 36 h av behandling.
Anmärkning: För larverna i svält kammaren, tillsätt 1 mL PBS varje 12 h för att undvika larver dehydrering.
3. dissektion av Oenocyter
- Använd en liten pensel för att plocka larver av lämplig ålder (12 h, 24 h, eller 36 h efter behandling), sedan överföra dem till en ny petriskål fylld med 5 mL iskall PBS att tvätta.
Anmärkning: Upprepa steg 2,2 vid hantering av larver i en kontroll kammare för att avlägsna eventuell kontaminering av livsmedel. - Fyll en dissektion tallrik med iskall PBS och använda pinken för att försiktigt överföra larver i dissektion plattan. Placera dissektion plattan under ett stereomikroskop för följande dissekera steg.
Anmärkning: Den iskalla temperaturen kommer att hjälpa långsamma rörelser av larverna och underlätta dissektion. - Vänd larverna ventrala sida upp och rygg sida ner och försiktigt hålla på plats med hjälp av tång. Säkra larverna till dissektion plattan genom att placera en dissektion stift om svalget vid den främre änden och en annan stift genom spiracle vid den bakre änden.
Anmärkning: Den dorsala sidan är lättast identifieras genom närvaron av dorsala stammar av luftstrupen. - Använd Vannas våren sax för att incisionsfilm (longitudinellt) genom epidermis från den främre till den bakre änden.
- Ta bort den inre vävnaden i epidermis med hjälp av pinps.
Anmärkning: Försiktighet måste iakttas vid avlägsnande av trakeala grenar för att undvika skador på oenocyter, som är lokaliserade i den inre ytan av epidermis. - Med pinpett, Hämta dissektion stift och överföra epidermis i en 1,5 mL microcentrifug tub fylld med PBS på is.
- Fortsätt att dissekera andra larver enligt proceduren som beskrivs ovan.
4. färgning av lipiddroppar
- Inkubera dissekerade epidermis i fixering buffri 30 min vid rumstemperatur (RT) på en rotator.
Anmärkning: Fixeringsbufferten innehåller 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. - Ta bort fixeringsbufferten, följt av en snabb tvätt. För att utföra en snabb tvätt, tillsätt 1 mL PBS vid RT i röret efter avlägsnande av PFA, försiktigt Omsuspendera vävnaderna, och kassera PBS.
Försiktighet: Fixeringsbufferten innehåller PFA, som är skadlig för människors hälsa. Det är viktigt att korrekt avyttra fixeringsbufferten som farligt avfall. - Tvätta proverna 3x i 5 min vardera med PBS för att tvätta ut alla möjliga PFA-rester.
- Inkubera epidermis med BODIPY 493/503 (1 μg/mL; se tabell över material) i30 min vid RT på en rotator.
Anmärkning: Från detta steg framåt, Linda mikrocentrifug röret med en bit aluminiumfolie för att skydda prover från ljus och minimera möjliga foto-blekning. - Ta bort den BODIPY 493/503 färgning lösning och tvätta proverna 3x för 10 min vardera med PBS att helt ta bort rester av färgämnen.
5. montering och avbildning
- Placera 6 μL monteringsmedium på en ren Mikroskop bild.
Anmärkning: Monteringsmedium används för längre detekteringstid baserat på dess AntiFade-egenskaper. - Använd tång för att plocka upp en epidermis och försiktigt ta bort resterande PBS med en torka.
- Placera epidermis i monterings mediet och justera dess orientering så att dess inre yta som innehåller oenocyterna är på botten och dess yttre yta är på toppen.
- Placera försiktigt en täckslip på epidermis.
Anmärkning: Ta bort eventuella extra monteringsmedel som läcker från under täckslip med en torka, om det behövs. För att underlätta bildtagning, tryck försiktigt ner täckglaset med tång så att oenocyteklustret lätt kan avbildas i ett enda plan när du observerar bilden genom mikroskopet. Alternativt, det är praktiskt möjligt att skära epidermis i två semi-epidermis genom mellersta linjen för att undvika rullande upp hela epidermis vid montering av vävnader. - Applicera klart nagellack runt kanterna på täckslip för att täta.
- Placera bilderna i en ljustäta prov låda och låt nagellacket torka vid RT, vilket kan ta 5-10 min.
- Fortsätt med Mikroskopisk analys. Ta bilder med hjälp av ett konfokal Mikroskop (förstoring av 63x med optimerade GFP-eller FITC-filterinställningar, excitation = 488 nm, emission = 503 nm) för att förvärva rena och känsliga signaler med minimerad bakgrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrikt genomförande av denna procedur bör resultera i tydliga lipiddroppar färgning som avslöjar antalet och storleken på lipiddroppar i oenocyterna. Figur 1a, a, a visar att det finns få detekterbara lipiddroppar (gröna prickar) i oenocyterna hos normala utfodringlarver under olika utvecklingsstadier. Figur 1b, b ' ' visar ökade lipiddroppar (gröna prickar) i de oenocyter som svar på 12 h (b), 24 h (b), och 36 h (b ' ') perioder av svält. Det bör noteras att efter 96 h, Fed larver (A) verkade Visa vissa lipid dropp ansamling i oenocyterna, som kan ha varit på grund av deras snabba tillväxttakt. Forskare bör ägna ökad uppmärksamhet när de behandlar larverna under detta skede.
Figur 1: representativa bilder av färgning av lipiddroppar. Bilder visas under den tid under utveckling och svält i oenocyter av Drosophila larver med hjälp av bodipy 493/503. (a, a, a ' ') Färgning av lipiddroppar (gröna prickar) av representativa bilder av oenocytkluster i utfodrade larver. (b, b ', b ' ') Färgning av lipiddroppar (gröna prickar) i representativa bilder av oenocytkluster efter 12 h (B), 24 h (B) och 36 h (B ' ') perioder av svält, med början från larver med en ålder av 84 h. Alla bilder togs i samma förstoring. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bland de som beskrivs ovan finns det flera kritiska steg i detta protokoll, där äggläggningstiden är en av dessa. Som en lipid-mobiliserande vävnad, är oenocyten mycket känslig för nutrition status6,8. Förlängd ägg läggnings tid perioder kan resultera i Gol larver och ökad mat konkurrens, vilket leder till felaktiga resultat. Den 1 h ägg läggnings tidsperiod som används i detta protokoll gör det möjligt för larverna att utvecklas utan näring konkurrens. Ett mycket större antal larver som kan bli följden av längre äggläggningsperioder kan också påverka fett droppens mängd och mönster (t. ex. storlek, antal och morfologi) i oenocyter.
Dessutom, förlängd ägg läggnings tid perioder resulterar också i en larv population med en stor variation av utvecklingsstadier. I detta sammanhang, forskare bör vara försiktig när du använder mutanter som påverkar embryonal eller larv utveckling, eftersom deras inverkan på lipiddroppar mönster kan påverkas av sekundära effekter av utvecklingsdefekter. Tiden kurs förfarande tyder på att lipiddroppar är sällan upptäckas i Fed villkoret oenocyter under utveckling från tidig tredje INSTAR larver (84 h) till sena tredje INSTAR larver (120 h). Dessutom, till skillnad från Amber pigmentering av oenocyter hos vuxna, larv oenocyter är färglös5. Sålunda, ökad uppmärksamhet bör ägnas under oenocyte dissektion för att undvika potentiella skador på oenocyter, särskilt när du tar bort de omgivande vävnaderna (dvs., trakeal grenar). Dessutom, lipiddroppar är enstaka skikt membran organeller, som är känsliga för rengöringsmedel såsom Triton X-1009. Det är därför viktigt att se till att buffertar som används i detta protokoll inte innehåller rengöringsmedel.
Som nämnts ovan, det finns flera färgämnen som används för att bestämma fett droppar mängd och mönster förändringar i Drosophila och andra arter. Bland dessa, BODIPY 493/503 kan vara mest lämpade för lipid dropp-specifik färgning jämfört med andra fluorescerande (t. ex., Nile röd) eller nonfluorescerande färgämnen (t. ex., olja röd O); även om, mer roman och avancerade färgämnen utvecklas. Till exempel, LipidSpot 488 och dess derivat är en serie nyutvecklade fluorescerande färgämnen med minimal bakgrunds färgning av cellulära membran och andra organeller. De tillåter snabb färgning av lipiddroppar i både levande och fasta celler, utan tvättsteg krävs16,17. En begränsning av denna lipid dropp färgning protokollet är att det inte är optimalt för att kvantitativt mäta fett reserver i celler, även om det fungerar bra för kvalitativ bedömning av lipid droppstorlek, antal, och morfologi.
Förutom fett droppar färgning i oenocyter, denna metod kan också tillämpas på andra vävnader i larver (dvs, muskler, fett kropp, och tarm vävnad) med mindre ändringar under vävnad dissektion och sektionering7. Dessutom, denna metod fungerar också bra för lipid dropp färgning av vuxna vävnader7. En modifierad version av denna metod kan utvidgas till bredare tillämpningar i kombination med immunohistokemi färgning med antikroppar. I detta fall, fasta vävnader bör genomsyras av saponin (0,1% för 30 min vid RT) i stället för traditionella rengöringsmedel innan inkuberingen med antikroppar, vilket underlättar passage av antikroppar över plasmamembran och underhåll av lipid dropp membran integritet8.
Sammanfattnings, detta protokoll ger en genomförbar metod för forskare att undersöka om vissa genetiska eller miljö manipulationer orsaka kvalitativa förändringar i lipid droppar mängder och mönster (dvs., storlek, antal, och morfologi) utan behov av svåra operationer och dyr utrustning och material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (31671422, 31529004 och 31601112), det 111 projektet (D18010), den lokala innovativa och forskargrupper projekt av Guangdong perl River Talents program (2017BT01S155), och Kina postdoktorala stiftelsen (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell? Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
